一、脊髓损伤模型制备及评价的研究进展（论文文献综述）
罗文琪[1]（2021）在《基于含硒纳米材料的构建及其治疗脊髓损伤的实验研究》文中研究说明研究背景:脊髓损伤（Spinal cord injury,SCI）是暴力因素（坠落,车祸等）直接或间接损伤脊髓组织,导致患者感觉、运动、大小便、性功能障碍等一种严重疾病。SCI不仅严重影响患者的生活质量,也给家庭、社会和医疗保健系统带来沉重的负担。目前临床上常用的治疗方法是手术减压解除脊髓压迫,稳定脊柱生物力学力线。但是,手术减压的治疗效果与损伤程度、患者就诊时间、身体耐受程度等多种因素密切相关。另外,在脊髓损伤的急性期,脊柱外科医师常给予大剂量甲基强的松龙的冲击治疗,但是,众多研究表明大剂量甲基强的松龙冲击疗法的治疗效果并不确切,并且常伴随感染、消化道大出血、肺栓塞等并发症。因此,大剂量甲基强的松龙冲击疗法治疗SCI仍有很大局限性。所以,临床上迫切需要新的治疗SCI方法。SCI治疗效果不理想可能与其复杂的级联动态病理过程有关。这种复杂的病理过程主要包括以下四个方面,第一,外伤导致的脊髓内出血、缺血、缺氧、血栓形成;第二,血-脊髓屏障破坏后,循环系统中的中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等炎症细胞浸润至脊髓,并分泌大量促炎因子如IL-1β,TNF-α等;第三,炎症细胞（中性粒细胞、小胶质细胞、巨噬细胞等）产生大量活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）,过量ROS打破了脊髓自身的氧化还原平衡,损伤核酸、蛋白质、脂质等诱导神经元、少突胶质细胞凋亡;第四,凋亡细胞产生的大量细胞碎片募集炎症细胞浸润并分泌促炎因子,加重炎症反应使微环境进一步恶化。目前,脊髓损伤的治疗包含神经再生和神经保护两个方向。神经再生包括移植骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞等或刺激自体有潜能的干细胞再生,但SCI后恶劣的微环境不利于移植的干细胞存活或难以向神经元分化限制了以上疗法的治疗效果及临床应用。神经保护则通过抑制或中止SCI后复杂的级联动态病理过程,改善损伤微环境提高神经元、胶质细胞对损伤因素的耐受程度,促进细胞在恶劣的微环境存活、重塑,进而恢复神经功能。研究目的:随着纳米材料与临床医学的深度融合及相关领域的快速发展,纳米材料在神经保护方面的应用也得到了重视。纳米材料既有良好的生物相容性又能够有效清除ROS、抑制炎症反应,因此,利用纳米材料治疗SCI是当前的研究热点。为此,本文拟合成制备了具有清除ROS功能的硒杂化碳量子点（Selenium-Doped Carbon Quantum Dots,Se-CQDs）,旨在探讨Se-CQDs的生物相容性、抗氧化性、抑制炎症性和神经保护性。并在此基础上进一步优化,设计并制备了既能清除ROS同时具有靶向性的透明质酸-硒（Hyaluronic acid-Selenium,HA-Se）纳米粒子。旨在探讨HA-Se纳米粒子在体内外的靶向性及其对SCI的治疗效果。研究方法:（1）通过水浴加热L-硒代胱氨酸的方法制备了Se-CQDs。采用动态光散射（DLS）,透射电镜（TEM）,马尔文粒度仪对Se-CQDs大小、形态、电位进行表征。采用核磁共振氢谱（1H NMR）和碳谱(13C NMR),傅里叶变换红外线（FTIR）,x射线表面光电子能（XPS）,紫外吸收光谱,荧光光谱对Se-CQDs结构进行表征,明确合成物质结构及组成成分。同时,通过DPPH检测Se-CQDs清除自由基的效率。体外实验,首先通过MTT法验证了不同浓度Se-CQDs（6.25,12.5,25,50,100,200μg/m L）对细胞（N2a细胞、PC12细胞、星形胶质细胞）生物相容性的影响。同时,用MTT法检验了上述浓度Se-CQDs在250μM H2O2模拟的氧化应激环境对N2a细胞、星形胶质细胞的保护作用。另外,通过Elisa法探究了Se-CQDs对LPS刺激后BV2细胞炎症因子（IL-1β,IL-6,TNF-α）表达的影响。体内实验,采用标准的脊髓打击器制造大鼠脊髓挫伤模型。造模成功后脊髓损伤局部通过微量注射器原位给予盐水或不同浓度的Se-CQDs（250μg/m L,1000μg/m L）各10μL,分组情况如下:saline组,Se-CQDs（250μg/m L）组及Se-CQDs（1000μg/m L）组。于术后24h取材提取脊髓损伤处的全蛋白,进行Western Blot实验,评估Se-CQDs在体内水平对Caspase-9,Cleaved caspase-3,Bcl-2,Bax凋亡相关蛋白表达量的影响。术后5d,心脏灌注取材通过免疫荧光染色（CD68,活化的小胶质细胞）评估Se-CQDs在体内水平抑制炎症的作用。剩余SD大鼠于造模后1d,1w,2w,3w,4w,5w,6w,7w和8w通过BBB评分连续评估下肢运动功能,同时记录大鼠恢复自主排尿的时间。于造模后8周心脏灌注取材,通过膀胱H&E和Masson染色,脊髓外像、脊髓H&E和LFB染色及脊髓免疫荧光染色（CS56&GFAP,Neu N&NF200）等系统评价Se-CQDs对急性SCI及相关膀胱改变的治疗效果。（2）透明质酸（Hyaluronic Acid,HA）在水溶液中作为稳定剂通过氧化还原体系制备HA-Se纳米粒子。采用动态光散射（DLS）,马尔文粒度仪,透射电镜（TEM）,扫描电镜（SEM）对HA-Se纳米粒子的大小、电位、形貌进行表征,采用傅里叶变换红外线（FTIR）,x射线表面光电子能（XPS）对HA-Se纳米粒子的结构进行表征。同时,通过DPPH检测HA-Se纳米粒子清除自由基的效率。体外实验,首先通过MTT法验证了不同浓度HA-Se纳米粒子（3.125,6.25,12.5,25,50,100μg/m L）对PC12细胞和星形胶质细胞生物相容性的影响。同时,用MTT法检验了50和100μg/m L HA-Se纳米粒子在100μM H2O2模拟的氧化应激环境下对星形胶质细胞保护作用。另外,通过Elisa法检测了HA-Se纳米粒子对LPS刺激BV2细胞后炎症因子（IL-1β,IL-6,TNF-α）表达量的影响。体内实验,采用标准的脊髓打击器制造大鼠脊髓挫伤模型。为了探究SCI后CD44表达情况,通过Western Blot法检测脊髓损伤各组间CD44表达量,同时,术后5d取材通过免疫荧光染色共定位法探究了CD44具体为何种细胞表达。进一步,为了评估HA-Se纳米粒子在脊髓的靶向性,采用尾静脉注射NH2-CY5荧光标记的HA-Se纳米粒子进行示踪,并于动物成像系统拍照记录组织分布。为了探究HA-Se纳米粒子对凋亡的影响,术后24h取材,检测假手术组,saline组和HA-Se纳米粒子组促凋亡蛋白Cleaved caspase-3的表达差异。另外,为了评估HA-Se纳米粒子抑制炎症的作用,术后5天心脏灌注后取材通过免疫荧光染色（CD68&Iba-1）评估不同浓度HA-Se纳米粒子（1mg/kg,5mg/kg,10mg/kg）在体内抑制炎症的作用。为了评估HA-Se纳米粒子治疗效果,于损伤后1d,1w,2w,3w,4w,5w,6w,7w,8w,9w,10w,11w和12w通过BBB评分连续评估下肢运动功能,通过脊髓外像、脊髓H&E和LFB染色及脊髓免疫荧光染色（Neu N&NF200）等评价HA-Se纳米粒子对急性SCI的治疗效果。研究结果:（1）制备了溶解性良好,大小均匀,半径为34.5±3.3 nm的Se-CQDs。体外实验结果表明Se-CQDs在200μg/m L浓度下对N2a细胞、PC12细胞、星形胶质细胞无明显毒性作用,并且62.5μg/m L、125μg/m L、250μg/m L、500μg/m L Se-CQDs清除DPPH效率分别为56.4%、72.1%、91%、98%。在250μM H2O2模拟氧化应激环境下,Se-CQDs有效提高了N2a细胞、星形胶质细胞、PC12细胞的存活率,并且能够抑制LPS刺激BV2产生炎症因子IL-1β和IL-6。此外,体内实验表明,相比saline组,Se-CQDs治疗组脊髓挫伤模型中脊髓空洞明显减小、神经脱髓鞘受到抑制、神经元得到保护、膀胱内膜增厚及膀胱纤维化均明显减轻。同时,促凋亡蛋白（Bax、Cleaved Caspase-3、Caspase-9）表达减少,抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加且均具有统计学意义,BBB评分及自主排尿恢复时间表明,相比saline组,Se-CQDs治疗组下肢运动功能及膀胱排尿功能得到明显改善。（2）制备了溶解性好,核壳结构,大小均匀,直径为95±2.3 nm的HA-Se纳米粒子。体外实验结果表明HA-Se纳米粒子在100μg/m L浓度下对PC12细胞、星形胶质细胞无明显毒性作用,并且250μg/m L HA-Se纳米粒子在30min、60min、90min、150 min清除DPPH效率分别为0.8%、5.9%、9.7%、14.5%,1000μg/m L HA-Se纳米粒子在30 min、60 min、90 min、150 min清除DPPH效率分别为14.6%、19.5%、25.7%、31.8%。HA-Se纳米粒子有效促进了星形胶质细胞在H2O2模拟氧化应激环境下的存活,并且能够抑制LPS刺激BV2产生炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α。此外,本研究发现SCI后大鼠脊髓损伤局部星形胶质细胞及部分小胶质细胞CD44表达增加,且体外实验证实LPS刺激星形胶质细胞24 h后能够诱导其表达CD44。体内实验证实,HA-Se纳米粒子能够特异性的与CD44结合,相比saline组,HA-Se治疗组的脊髓空洞减小、神经脱髓鞘减轻、炎症细胞浸润受到抑制,促凋亡蛋白Cleaved Caspase-3表达减少,HA-Se治疗组下肢运动功能明显改善。研究结论:（1）Se-CQDs具有良好的生物相容性及高效的ROS清除能力,显着减轻了SCI氧化应激反应和炎症细胞募集浸润,明显改善了SCI后的神经功能,为治疗SCI提供了新的选择。（2）SCI后星形胶质细胞表达CD44增加,HA-Se纳米粒子通过结合星形胶质细胞表面高表达的CD44而具有良好的靶向性作用。同时,HA-Se纳米粒子本身还具备抑制炎症细胞浸润、减小脊髓空洞、保护神经元促进其存活的作用,明显改善了神经功能。这为制备靶向性纳米药物治疗SCI提供了新思路。
许月[2]（2021）在《PLGA载药微球缓释体系的研发及其在脊髓损伤修复中的应用》文中研究说明脊髓损伤（SCI）是一种感觉及运动神经元功能减退的创伤性损伤,给个人和社会带来了沉重的负担。脊髓损伤后神经生长因子（NGF）的缺乏使脊髓损伤修复困难。但NGF难以通过血脑屏障,无法长期直接给药。传统的SCI支架存在药物释放时间短或难以实现临床应用等问题。因此,设计一种能够长期释放NGF且在临床有潜在应用价值的SCI支架成为一个紧迫的问题。本课题以PLGA微球为NGF的负载体,设计了两种应用于SCI治疗的生物支架,研究主要内容如下:（1）本课题首先采用电喷雾法制备了油溶性壳聚糖/明胶载药微球及水溶性聚乳酸羟基乙酸（PLGA）微球。壳聚糖/明胶共混液固体在6.310-6.431 mg/100 mL范围内,可以形成形貌良好的微球,平均直径约450 nm。PLGA溶液的有机相浓度为7 wt%,水油比为1:200时,微球形貌最优。通过药物释放实验,圆二色光谱进行药物释放分析,壳聚糖/明胶微球在2天内快速释放NGF,释放率约为87%,PLGA微球药物缓释时间长达14天,释放率约为60%,两种微球均能良好的保持药物活性。研究表明油性PLGA微球相较水性壳聚糖/明胶微球产率及成球率高,同时因其不易溶胀而具有更加优异的药物缓释性能,可与其它生物材料复合制备SCI支架。（2）针对传统生物支架难以实现临床应用的问题,以PLGA微球为NGF的负载体,设计了 PLA/NGF-PLGA/CS复合膜。利用PLA膜的致密性作为密封层防止药物扩散并提供一定的力学支撑,浓度为7 wt%时纤维均一度最佳。PLGA微球作为负载缓释层。CS膜作为植入层,可以直接接触损伤区域,同时种植骨髓间充质干细胞（BMSCs）来修复神经,溶液浓度为6 wt%时纤维形貌最佳。单向拉伸测试显示复合膜结构有一定的力学强度,可以方便于脊髓损伤修复的应用。通过药物释放实验,圆二色光谱进行药物释放分析,结果表明复合膜可以释放药物长达两个月以上,并能保持良好的药物活性。细胞毒性实验及细胞分化实验显示,复合膜无细胞毒性,可以成功诱导PC-12细胞在5天内分化为神经元。同时动物实验显示损伤部位应用PLA/NGF-PLGA/CS复合膜后,脊髓损伤大鼠神经元再生和运动功能恢复明显改善,BMSCs的加入进一步促进了脊髓损伤的修复。这些结果表明该复合膜药物缓释时间能满足修复所需时间,并能成功改善脊髓损伤,在SCI临床应用方面具有较大的前景。（3）针对复合膜需要手术植入且无法填补病区空洞的问题,我们以P407及P188为基体,共混入SA,通过Ca2+交联获得物理-化学双交联的复合凝胶。P407浓度为16 wt%、P188浓度为3wt%,此时复合凝胶的凝胶化温度约为34℃,且固体含量低。通过黏温曲线测试、频率扫描序列、压缩测试、剪切变稀测试对凝胶的流变学特性表征。黏温曲线显示复合凝胶具有温敏性。频率扫描序列显示水凝胶形成,37℃下的凝胶转变为固态强度高于25℃。复合凝胶表现出剪切变稀行为可通过常规注射器注射,同时压缩测试显示凝胶注射入体内后能保持一定的形态。经Ca2+交联后复合凝胶凝胶网络结构收紧孔径变小,释放时间可达14天,其释放率约为48%。圆二色光谱显示,NGF活性保持良好,同时复合凝胶未见细胞毒性,并成功诱导PC-12细胞在5天内分化为神经元,有助于神经修复。结果表明NGF-PLGA/P407/P188/SA复合凝胶有良好的可注射性,在SCI修复以及更多的医学领域存在广泛的应用前景。
李鸿儒[3]（2021）在《负载神经干细胞和多奈哌齐的导电水凝胶系统对脊髓损伤修复作用研究》文中研究说明研究目的:本研究期望制备一种复合多种优良性能的可注射导电水凝胶并对其进行相关表征测定,并通过体外试验验证该水凝胶和DPL组合有利于NSCs增殖和分化,随后利用该导电水凝胶负载NSCs和DPL对大鼠全切模型进行体内原位移植治疗脊髓损伤,来实现受损脊髓的神经再生修复以及运动功能的复原,这也将为神经组织工程治疗脊髓损伤提供新的理论基础。研究方法:1.可注射型导电水凝胶的合成和表征测定通过改性生物高分子HA-ALD和NH2-Gelatin-PANI通过醛基和氨基形成的亚胺键作为交联点,成功制备了新型可注射导电水凝胶NGP。利用小瓶倒转法、红外谱图、扫描电镜、动态流变、电化学站、药物缓释实验等对水凝胶相关性能进行了表征测定。通过体外和体内降解实验评估材料的降解属性。通过皮下注射和HE染色对水凝胶的生物相容性进行鉴定。2.水凝胶环境中多奈哌齐对NSC的生物学效应在本章实验中,首先我们利用孕13-15天SD大鼠的胎鼠大脑皮层中原代分离NSCs,接着采用通用的的悬浮培养方式对其进行培养和扩增,并通过特征性Nestin抗体的免疫荧光染色对NSCs进行鉴定。接着利用1,3,5天的活死细胞染色实验检测NGP水凝胶的细胞毒性。最后我们的目的就是探索NGP水凝胶和DPL在单独和联合应用时NSCs的增殖分化情况,分组中的DPL浓度为8ng/μl。我们利用1,4,7天的CCK-8实验检测了水凝胶环境中DPL对NSC增殖效应,培养7天后的细胞免疫荧光染色实验和RT-PCR实验定性和定量探究了NGP导电水凝胶环境中DPL对NSC的促分化效应影响。3.可注射导电水凝胶搭载NSCs和DPL治疗脊髓损伤我们首先建立SD大鼠T9脊髓全切损伤模型,利用可注射导电水凝胶NGP搭载NSCs和DPL在损伤处进行原位移植,并对术后大鼠进行持续6周的观察,通过BBB评分表对大鼠运动功能恢复情况进行评价,利用肌电图仪对大鼠神经电生理信号的传导功能恢复情况进行评估。将各组实验大鼠进行灌注取材脊髓组织,通过HE染色,固蓝染色,免疫荧光染色对损伤中心处囊性空洞面积、髓鞘再生情况、新生神经元、胶质瘢痕和神经轴突进行观察和分析,整体评估各组实验大鼠尤其是NGP+DPL+NSCs组的运动功能恢复和神经再生修复情况。研究结果:在本研究课题中,我们首先成功创新性地制备了新型可注射导电水凝胶NGP（HA-ALD:NH2-Gelatin-PAN）,随后对其各项性能进行表征后发现其拥有优良的机械强度,可注射性,自修复性,导电性,生物相容性,药物缓释性能,以及匹配脊髓损伤后移植时间的降解性。接下来的我们成功提取,培养和鉴定了神经干细胞,随后体外活死染色实验证明了NGP导电水凝胶无细胞毒性且对细胞的粘附性较好。CCK-8实验结果表明,NGP水凝胶对NSCs增殖有一定程度的促进作用,DPL的促增殖作用则不明显。细胞免疫荧光染色实验和RT-PCR实验结果表明药物DPL可以显着促进NSCs向新生神经元和少突胶质细胞分化。神经突长度的定量分析表明,NGP水凝胶而不是DPL对新生神经元神经突的生长和延伸有促进作用。另外,二者联用抑制星形胶质细胞分化作用最明显。最后,我们在SD大鼠T9脊髓全切损伤模型中利用可注射导电水凝胶NGP搭载NSCs和DPL在损伤处进行原位移植,我们发现在运动功能和神经传导功能的恢复上,NGP+DPL+NSCs组合十分有效。同时这种治疗策略还显着增加了髓鞘面积,新生神经元数量和轴突的面积,也最大程度地减少了囊性空洞和胶质瘢痕的面积。这一研究过程中也肯定了NGP导电水凝胶和NSCs本身对脊髓损伤的修复作用。研究结论:我们制备的可注射导电水凝胶NGP符合脊髓损伤后移植生物材料的各项性能要求,并且适宜作为DPL+NSCs共同的移植载体。NGP水凝胶环境能够对NSCs增殖和新生神经元神经突的延伸有促进作用,但需要DPL这种NSCs定向分化诱导剂才能显着增强神经元和少突胶质细胞的分化,抑制星形胶质细胞分化,进而才能避免大量胶质瘢痕生成。在体内动物实验中,NGP+DPL+NSCs的治疗组在运动功能和神经传导功能的恢复上有一定改善。同时,该组大鼠损伤中心处显着增加了髓鞘的形成,新生神经元再生和新生轴突生长与连接,也最大程度地减少了囊性空洞面积和胶质瘢痕的阻碍。NGP导电水凝胶+DPL药物+NSCs新型治疗组合也从神经保护和神经再生两方面为神经组织工程修复脊髓损伤提供了新的思路。
韩梦雨[4]（2021）在《中西医协同治疗视神经脊髓炎相关性视神经炎的应用研究》文中提出(一)视神经脊髓炎相关性视神经炎患者临床特点及疗效分析目的:分析视神经脊髓炎相关性视神经炎（NMO-ON）患者的临床特点及针药联合改善NMO所致视神经萎缩的疗效。方法:对2016年1月至2019年12月就诊于中日友好医院的72例以ON为首发临床表现的NMO患者进行回顾性分析总结,包括一般资料、发病特点、病程进展、合并疾病、免疫学检验、治疗反应及预后等。结果:1.一般资料:72例NMO-ON患者,发病年龄中位数33岁;女性61例（84.72%）,男女比约为1:5.54;病程中位数67月,病程以“复发-缓解”为主,单相与复发比约1:5.8。2.临床特点:66例（91.67%）单独ON起病,ON累及单眼者59例（81.94%）;主要症状为急性或亚急性视力下降,可伴转动痛、视野缺损及色觉异常等;14例（19.44%）伴诱因,最常见为上呼吸道感染;11例（15.28%）伴系统性免疫性病,最常伴发干燥综合征及甲状腺疾病;59眼（75.64%）首发视力小于0.1,AQP4-IgG状态（P=0.032,OR=2.55）和发病年龄（P=0.037,OR=3.93）是影响患者首发视力的独立危险因素;整个病程中,44例（61.11%）双眼先后累及,ON发病次数中位数为2次,ON二次发作时间中位数是3月;1年、3年复发率分别约0.56（40/72）和0.74（53/72）;至末次随访时间,单侧致盲率约48.61%,致患者单侧致盲ON发作中位数为2次;53例（73.61%）出现其他神经系统的累及,脊髓（61.1 1%）是最常见的复发部位。3.实验室结果:80%（48/60）患者血清AQP4-IgG抗体阳性;25%（3/12）患者MOG-IgG阳性;18例（25%）伴其他系统性免疫性抗体,最常见伴ANA抗体阳性;4.影像学特点:NMO-ON多累及后视路,病变长度>1/2视神经;45例（84.91%）脊髓MRI病变≥3个锥体;47.17%（25/53）患者同时或相继发生颈髓和胸髓病变。5.针药联合改善NMO所致视神经萎缩:24眼治疗4周有8只眼视力提高≥2行,总有效率91.67%;动态视野平均缺损度（MD）及平均敏感度（MS）较前改善,但与治疗前相比,差异均无统计学意义（P>0.05）;治疗8周有12眼视力提高≥2行,总有效率100%;视野MD显着下降（P<0.05）,MS明显提高（P<0.05）。结论:1.NMO-ON患者首次发病多ON单独起病,单侧累及,女性中青年高发,AQP4-IgG阴性患者更趋年轻化,急性期对患者视功能威胁巨大,恢复期多遗留较差的视力预后;最常见诱因为上呼吸道感染,漫长的病程多见双侧视神经受累及多次复发,脊髓是除视神经外最常见的复发部位;AQP4-IgG状态和发病年龄是影响NMO患者首次发病视功能的独立危险因素;2.大多数（80%）NMO-ON患者AQP4-IgG血清阳性,部分患者伴发以干燥综合征和甲状腺疾病为代表的系统性免疫性疾病,最常见伴有的血清学免疫性抗体是抗ANA抗体;3.NMO-ON患者视神经多累及后视路,病变长度>1/2视神经,脊髓损伤多为连续长节段,约一半患者同时或相继发生颈髓和胸髓病变;4.针药联合可显着提高NMO所致视神经萎缩患者的视功能,明显提高患者视力和动态视野MS,降低患者MD。（二）视神经脊髓炎相关视神经炎（NMO-ON）大鼠模型的构建与评价目的:通过将患者AQP4-IgG强阳性血清显微注射至大鼠视神经周围蛛网膜下腔,诱导视神经NMO样病变,从活体与病理、视神经及脊髓、大脑等多维度评价该模型,为探究药物防治NMO-ON提供模型基础。方法:SD雄性大鼠30只根据血清样本类型随机分为模型组、假手术组,上结膜入路暴露视神经后选择球后2mm处分别将AQP4-IgG强阳性血清和健康人血清缓慢注射到蛛网膜下腔。术后第3天免疫荧光法检测视神经AQP4-IgG表达;术前1天（第0天）、术后第7、14天分别行闪光视觉诱发电位（F-VEP）及瞳孔对光反射（PLR）检测;术后第14天分别处死两组大鼠行视网膜、视神经、大脑及脊髓等组织制片和病理学观察。结果:术后第3天模型组视神经AQP4-IgG强表达,假手术组未见表达（P<0.001）;与假手术组相比,AQP4和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）在AQP4-IgG沉积区域表达也显着降低（P<0.001）;模型组N1-P1波振幅和PLR第7天、14天均明显降低,与假手术组相比差异均有统计学意义（P<0.001）;组织病理学观察:与假手术组相比,模型组视神经HE染色肿胀水肿、着色明显加深,轴突数量显着减少伴有不规则空洞化,其间见大量炎症细胞浸润等;RGCs水肿显着,数量明显减少,且大小不一,核仁不清晰;视神经LFB髓鞘染色,模型组可见到蓝色区域显着减少;模型组大鼠视神经电镜则可见到轴突数量明显减少且排列紊乱、横断面形态不规则,微管微丝大量溶解,髓鞘严重分层、结构不完整,且大多数髓鞘松解或者脱失、塌陷,甚至无髓鞘;免疫荧光染色发现,与假手术组相比,模型组神经丝蛋白L（NFL）表达量明显下降（P<0.001）及CD68表达显着升高（P<0.001）;脊髓组织HE发现,假手术组和模型组均未见到脊髓白质炎症浸润、轴突及髓鞘损伤等病理变化;脊髓组织LFB染色可见假手术组和模型组髓鞘染色成蓝色且均匀一致,未见到染色区域减少及白色未着色区等。大脑组织HE和LFB染色也未发现炎症浸润及脱髓鞘等病理损伤;结论:1.我们通过在大鼠视神经蛛网膜下腔显微注射人类AQP4-IgG阳性血清成功构建了NMO-ON大鼠模型,该模型显示NMO-ON的特征性病理变化,包括星形胶质细胞破坏、炎症浸润、轴突损伤及脱髓鞘等;2.大鼠视神经蛛网膜下腔显微注射人类AQP4-IgG阳性血清构建NMO-ON模型,仅能启动局部视神经周围免疫,对脊髓及大脑等其他神经系统未产生病理损伤。（三）调肝活络法防治视神经脊髓炎相关性视神经炎（NMO-ON）的疗效及机制探究目的:通过动物模型的体内研究,观察调肝活络法的干预效果,并深入挖掘方药发挥作用的分子机制,为NMO-ON的临床治疗提供中西医协同的解决方案。方法:SD雄性大鼠60只随机分为模型组、假手术组、中药组、激素组、中药+激素组,显微注射法构建NMO-ON大鼠模型,分别给予无菌蒸馏水、中药、激素及中药+激素等灌胃干预21天,术前1天（第0天）、术后7天、14天及21天分别行F-VEP、PLR检测;第21天处死所有大鼠,制备视网膜、视神经切片,进行HE染色及超微电镜观察;免疫组织化学染色检测RGCs中Brn3a表达;免疫荧光染色检测GFAP、NFL、髓鞘碱性蛋白（MBP）和CD68表达;Western-blotting检测视神经IL-6、IL-10、TNF-α、p-NF-κB p65 蛋白表达。结果:1.视神经功能学评价:与同时间点模型组和激素组相比,中药组和中药+激素组在第7、14和21天均可显着提高视神经F-VEP的N1P1振幅（P<0.001）;在第21天,中药组、中药+激素组与模型组和激素组相比,PLR收缩程度也显着增加（P<0.001）;2.组织病理学评价:与模型组和激素组相比,中药组和中药+激素组视神经HE染色均可见轴突损伤减轻、视神经水肿消退及未见到明显炎症细胞浸润;电镜发现中药组轴突数量明显增加,神经纤维束状形态可循,可见微丝微管结构,髓鞘损伤也较之减轻;与激素组相比,中药+激素组见到更完整的神经轴突、髓鞘结构;免疫组化发现,与模型组和激素组相比,中药组和中药联合激素组RGCs的Brn3a表达量较之均显着升高（P<0.001）;视神经免疫荧光提示中药组及中药+激素组GFAP、MBP和NFL表达量较模型组表达量升高（P<0.001）。CD68视神经染色也发现,与模型组相比,中药组及中药+激素组可见到CD68表达显着降低（P<0.001）;3.Western Blotting:与假手术组相比,模型组大鼠视神经内p-NF-κB p65、TNF-α和IL-6显着升高（P<0.001）;与模型组相比,中药组、激素及中药+激素组均可见到p-NF-κB p65、TNF-α和IL-6降低（P<0.001）;与假手术组相比,模型组大鼠视神经内IL-10显着降低（P<0.001）;与模型组相比,中药组、激素及中药+激素组均可见到 IL-10 升高（P<0.001）。结论:1.调肝活络复方中药可以减轻NMO-ON大鼠模型视神经轴突丢失、髓鞘损伤及炎症浸润,进而提升和改善视觉诱发电位N1P1振幅及瞳孔对光反射收缩能力。2.调肝活络复方中药对NMO-ON视神经及视网膜发挥神经保护和治疗作用可能与其能抑制视神经内NF-κB蛋白磷酸化及调控相关炎症介质（IL-6、TNF-α及IL-10）的产生有关。
唐维[5]（2021）在《巨噬细胞膜包裹脂质体靶向治疗脊髓损伤的初步研究》文中指出脊髓损伤（Spinal cord injury,SCI）是一种常见的损伤性脊椎疾病,常导致受损部位以下肢体运动,感觉和自主神经系统功能障碍,使患者不得不长期甚至终身接受治疗与护理。这不仅严重影响了患者的生活质量,也给社会医疗保健体系带来了巨大挑战。目前,脊髓损伤的治疗方法非常有限,虽然静脉注射甲泼尼龙（methylprednisolone,MP）被推荐作为临床上治疗SCI的标准方法,但此方法的疗效不佳,且常伴有呼吸道感染,胃肠道出血等副作用。因此,亟需一种更加安全有效的药物治疗方法用于SCI的治疗。近年来,基于天然细胞膜的仿生纳米递送系统受到广泛关注,其将天然细胞膜与合成纳米载体结合在一起,即保留了纳米颗粒自身的载药能力和尺寸优势,又具备了天然细胞固有的“自我识别”特征,能逃避网状内皮系统的（reticuloendothelial system,RES）清除。同时,细胞膜上存在的一些功能蛋白也可赋予该仿生载体靶向递送的能力。脊髓受损后,巨噬细胞会被大量招募并浸润进入脊髓损伤部位,此过程主要由巨噬细胞膜表面相关受体介导,说明巨噬细胞膜具有成为SCI靶向递送材料的潜力。基于此,本课题以盐酸米诺环素（minocycline hydrochloride,MC·HCl）作为模型药物,构建了一种巨噬细胞膜包裹脂质体的仿生递药系统用于脊髓损伤的靶向递送治疗。此递送系统有三大优势:（1）高度的生物相容性,无免疫原性;（2）躲避RES的识别清除表现出长循环效果;（3）特异性靶向脊髓损伤。此外,考虑到巨噬细胞存在多种极化表型,彼此之间表现出不一样的生物学功能,本课题还初步考察了巨噬细胞极化分型对巨噬细胞膜包裹脂质体靶向递送能力的影响。本论文分为三部分:第一部分构建了巨噬细胞膜包裹脂质体的仿生递药系统,并对其理化性质及生物学特征进行了表征。采用梯度离心法提取出小鼠巨噬细胞RAW264.7的细胞膜,通过物理挤压的方法将巨噬细胞膜包覆在脂质体的表面,制得巨噬细胞膜包裹脂质体（RM-LIP）。透射电镜观察显示RM-LIP具有明显核-壳结构。激光粒度仪分析结果显示RM-LIP水合粒径约为110.1 nm,高于内层脂质体（PEG-LIP）的粒径（77.6 nm）,Zeta电位由-15.3 m V变为-21.0 m V,与巨噬细胞膜电位（-22.3m V）相近。在荧光共定位实验中,巨噬细胞膜的红色荧光与脂质体的绿色荧光高度重叠,进一步证实巨噬细胞膜成功包覆在纳米粒子表面。高效液相色谱（HPLC）含量分析显示巨噬细胞膜包裹的盐酸米诺环素脂质体（RM-LIP/MC）的包封率约为91.2%,在4℃在静置72 h后,其包封率和粒径未发生明显变化,制剂保持澄清透亮,证实制剂稳定性良好。体外释放结果显示RM-LIP/MC在72 h里的累计释放量约为62.6%,与LIP/MC（86.4%）和PEG-LIP/MC（85.3%）相比,显示出一定的缓释能力。蛋白印迹法（Western blot）分析显示两个重要的功能蛋白Integrinα4和Mac-1在RM-LIP上保留完好。此外,进一步分析巨噬细胞极化对巨噬细胞膜包裹脂质体的靶向递送能力的影响,诱导得到经典激活的M1型巨噬细胞和选择性激活的M2型巨噬细胞,并制备对应的细胞膜包裹脂质体RM1-LIP和RM2-LIP。实验结果显示RM-LIP,RM1-LIP和RM2-LIP三种递送系统的理化性质相似,但生物性特征存有差异。本文第二部分评估了RM-LIP长循环功能及主动靶向性。荧光显微镜观察及流式细胞术分析显示巨噬细胞膜的包裹明显降低了RAW264.7细胞对制剂的摄取。体内药代动力学研究显示,RM-LIP/MC在体内的半衰期约为12.12 h,是普通LIP/MC的2.5倍左右,说明巨噬细胞膜包裹能够显着延长制剂在血液中的循环时间。此外,三种巨噬细胞膜包裹脂质体被证实具有相似的长循环效果。以LPS诱导HUVEC细胞来模拟脊髓损伤部位发炎血管,考察不同制剂的体外靶向性。实验结果显示经LPS诱导的HUVEC细胞对RM-LIP的吸附量相比PEG-LIP明显增加,而对封闭组（Blocked RM-LIP）（提前使用抗体对RM-LIP上Mac-1和Integrinα4进行封闭）的吸附量并没有明显提高,证明RM-LIP主要是通过Mac-1和Integrinα4实现与发炎血管内皮的特异性结合。为考察RM-LIP的体内靶向性,我们构建了小鼠脊髓挫伤模型,通过离体荧光成像和组织分布实验考察了各组制剂在SCI小鼠脊髓及各个组织的分布情况。实验结果显示RM-LIP在SCI小鼠脊髓受损部位的聚集量明显高于PEG-LIP和Blocked RM-LIP,证实RM-LIP对SCI具有主动靶向性。组织荧光切片显示RM-LIP能很好渗透进脊髓组织内部。此外,体内外实验均显示RM-LIP,RM1-LIP和RM2-LIP三种制剂对SCI的靶向递送能力相似,说明巨噬细胞极化未对巨噬细胞膜包裹脂质体的主动靶向性产生显着影响。本文第三部分考察了RM-LIP/MC的体内外药效及安全性。以LPS刺激BV2细胞构建体外神经炎症模型。ELISA分析结果显示经LPS刺激后的BV2细胞与RM-LIP/MC共孵育后,细胞释放炎症因子TNF-α和IL-6的量明显减少。体内药效实验显示,给药24 h后,与其他治疗组小鼠相比,RM-LIP/MC组小鼠脊髓损伤部位TNF-α和IL-6的浓度显着降低,细胞焦亡明显减少,继发性损伤得到有效抑制。在脊髓受损49天后,RM-LIP/MC组小鼠运动功能明显改善,后肢可较协调且持续的脚掌触地行走,脊髓受损部位空洞面积减少,胶质瘢痕生成受抑制且神经轴突坏死减少。连续给药7天后,MC·HCl组小鼠血清中肌酐（CREA）和尿素（UREA）的含量明显升高,肾脏组织出现病变,而RM-LIP/MC组小鼠未出现明显异样,说明RM-LIP递送降低了高剂量给药MC·HCl带来的肾脏毒性,且RMLIP本身也具有良好的生物安全性。综上所述,本文基于脊髓受损后巨噬细胞可浸润至脊髓损伤部位的病理现象,设计了一种巨噬细胞膜包裹脂质体的仿生递送系统用于脊髓损伤的靶向递送治疗,其不仅保留了脂质体良好载药能力,也能延迟RES的清除并主动靶向脊髓损伤部位,表现出优异的SCI治疗效果。此外,本文还初步考察了巨噬细胞极化对巨噬细胞膜包裹脂质体的靶向递送能力的影响。
李芳[6]（2021）在《ADSCs通过调控神经细胞TGF-β1/Smad/PLOD2信号通路修复脊髓损伤的机制研究》文中提出研究背景脊髓损伤（Spinal Cord Injury,SCI）是指由于外界直接或间接因素导致的中枢神经系统疾病,受累神经细胞的结构和功能受损,最终导致损伤部位以下运动功能和感觉的缺失,严重影响患者生活质量,降低患者生命预期,给家庭和社会带来沉重的负担。由于神经细胞的再生能力较低,损伤后微环境改变等不良因素,脊髓损伤治疗预后较差,使脊髓损伤的治疗成为了世界性的医学难题。传统的脊髓损伤治疗方法手术减压、药物对症治疗及术后康复治疗,不能促进神经细胞和轴突的再生,没有从根本上恢复神经功能,因此需要联用新的有效治疗方法共同作用。随着近几年分子生物学和细胞生物学研究的巨大进步,细胞移植作为脊髓损伤的一种新型治疗手段受到了广泛关注和研究,间充质干细胞（mesenchymal stromal cells,MSCs）由于其低免疫原性,体外容易培养,能分泌大量生物活性分子,成为研究的热点。体内外实验表明,脂肪来源的间充质干细胞（adipose tissue-derived stromal cells,ADSCs）移植在治疗脊髓损伤中具有良好的应用前景。在脊髓损伤动物模型中,与骨髓间充质干细胞相比,脂肪来源的间充质干细胞体内移植到脊髓损伤部位时具有更高的存活率。也有研究表明,ADSCs可以通过分泌细胞因子和生长因子,促进轴突再生,减少炎症细胞的浸润和空洞形成,从而促进脊髓损伤的恢复。尽管已有研究证明ADSCs在治疗脊髓损伤中的作用,但ADSCs促进脊髓损伤修复的具体机制尚不完全清楚。Torres-Espin等研究发现,大鼠脊髓损伤后MSCs体内移植可促进前胶原赖氨酸-2-酮戊二酸 5-双加氧酶 2（procollagen-lysine,2-oxoglutarate 5-dioxygenase 2,PLOD2）表达,PLOD2可能通过促进胶原纤维的交联和细胞外基质重塑起到组织修复的作用。越来越多的研究表明,在肿瘤的侵袭和迁移过程中,HIF-1α、TGF-β1 和 microRNA-26a/b 等分子通过 PI3K-AKT、TGF-β/Smad 信号通路,调控PLOD2的表达。但是PLOD2在治疗脊髓损伤中发挥的作用,目前还未见文献报道。ADSCs可以通过分泌多种细胞因子促进脊髓损伤的修复,TGF-β1作为ADSCs分泌的重要因子,具有抗炎、修复和神经保护功能。ADSCs能否通过分泌TGF-β1,上调PLOD2的表达,进而促进脊髓损伤的恢复,成为本研究的重点。本研究分为三个部分,第一部分:ADSCs体外共培养对损伤神经细胞的修复作用,第二部分:ADSCs通过调控神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进损伤神经细胞的修复,第三部分:ADSCs通过激活神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进脊髓损伤大鼠功能恢复。第一部分ADSCs体外共培养对损伤神经细胞的修复作用研究目的1.从人脂肪组织中分离培养间充质干细胞,通过成脂成骨分化能力和细胞表面标志的表达对其进行鉴定。2.培养PC12细胞和大鼠皮质神经元原代细胞,体外建立神经细胞机械损伤模型。3.体外建立ADSCs和损伤神经细胞共培养体系,通过相关检测,明确ADSCs对损伤神经细胞的修复作用,以及PLOD2在ADSCs治疗神经损伤中的表达变化。研究方法1.ADSCs的分离培养及鉴定间充质干细胞从健康志愿者脂肪组织培养获得。P3-P5代的细胞用于后续实验。ADSCs经成脂成骨诱导分化后,Oil Red O染色,观察成脂诱导分化情况,Alizarin Red S和Von Kossa染色,观察成骨诱导分化情况。流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达情况。2.神经细胞机械损伤模型制备（mechanical injury,MI）150ng/mLNGF诱导PC12细胞向神经细胞分化,MAP2染色鉴定。取Wistar新生鼠大脑皮质,分离培养原代神经细胞,NeuN染色鉴定。使用10ul枪尖于6孔板内“井”字划割,造成神经元机械性损伤。3.ADSCs共培养对损伤神经细胞的影响ADSCs接种Transwell上室,每孔接种3×105细胞,接种24h后与机械损伤的PC12细胞或大鼠皮质神经元共培养3天,EdU实验检测ADSCs对神经细胞的促增殖情况。微板试剂盒检测细胞培养上清中LDH表达变化,qRT-PCR和western blot检测PLOD2和神经相关分子MAP2、NSE、GAP43和GFAP的表达。研究结果1.ADSCs的分离培养及鉴定镜下观察从脂肪组织中分离出的细胞,呈典型的成纤维样梭形细胞;经成脂和成骨诱导培养基诱导分化后,Oil Red O染色成阳性,表明ADSCs具有成脂分化的能力,Alizarin Red S和Von Kossa染色成阳性,表明ADSCs具有成骨分化的能力;流式细胞仪检测其表面抗原的表达,结果显示ADSCs高表达CD13、CD44、CD73、CD90 和 CD105,低表达 HLA-DR、CD34 和 CD45。2.神经细胞的培养及鉴定PC12细胞经150ng/mL NGF诱导分化5-7天后,有神经突起长出,细胞形态类似于神经细胞,MAP2染色结果阳性。大鼠皮质神经元体外培养6-8天,细胞体较小,从胞体延伸出轴突和树突,轴突细长,NeuN染色结果阳性。3.ADSCs共培养促进损伤神经细胞的修复ADSCs与损伤神经细胞共培养三天,结果显示神经细胞伤口愈合率显着升高;EdU结果显示,ADSCs共培养能促进大鼠皮质神经元的增殖;LDH检测结果显示,ADSCs共培养可以抑制神经细胞LDH的释放;qRT-PCR和western blot结果显示,ADSCs共培养可以促进PLOD2和神经细胞相关分子MAP2、NSE和GAP43的表达,降低GFAP表达。研究结论1.我们成功地从脂肪组织中分离出间充质干细胞。2.ADSCs共培养可以提高损伤神经细胞伤口愈合率,促进大鼠皮质神经元的增殖。ADSCs共培养可以促进损伤神经细胞神经相关分子MAP2、NSE和GAP43的表达,降低GFAP表达。提示ADSCs可能通过提高神经元的存活率,促进神经细胞生长和轴突再生,减少胶质瘢痕的形成而促进损伤神经细胞的恢复。3.神经细胞机械损伤以后,PLOD2表达降低,ADSCs共培养可以促进损伤神经细胞PLOD2的表达。第二部分ADSCs通过调控神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进损伤神经细胞的修复研究目的1.通过米诺地尔抑制神经细胞PLOD2的表达,检测抑制PLOD2表达对ADSCs神经修复作用的影响。2.ELISA检测共培养体系中TGF-β1的表达情况,同时使用外源性TGF-β1作用于损伤的神经细胞,明确TGF-β1的神经修复作用。3.SB431542 抑制 TGF-β1/Smad 信号通路,LY294002 抑制 PI3K/AKT 信号通路,明确PLOD2具体的信号调控通路。研究方法1.米诺地尔抑制神经细胞PLOD2的表达,检测PLOD2下调对ADSCs神经修复作用的影响不同浓度米诺地尔（0.25mM,0.5mM,1.0mM）作用于PC12细胞,筛选米诺地尔抑制PLOD2表达的最佳作用浓度。在ADSCs与神经细胞共培养体系中加入米诺地尔,免疫细胞化学技术、EdU实验和LDH释放实验检测抑制PLOD2基因表达对ADSCs神经保护作用的影响,qRT-PCR和western blot检测PLOD2以及神经相关分子MAP2、NSE、GAP43和GFAP的表达变化。2.TGF-β1对受损神经细胞的修复作用ELISA检测损伤神经细胞及ADSCs共培养上清中TGF-β1的表达。外源性TGF-β1（浓度分别为 0.31,0.62,1.25,2.5,5.0,10,20 ng/mL）作用于划痕损伤的 PC12 细胞,qRT-PCR 和 western blot 检测 PLOD2、P-AKT、AKT、P-Smad3和Smad2/3的表达变化。3.抑制TGF-β1/Smad、PI3K/AKT信号通路,对PLOD2表达的调控ADSCs与损伤神经细胞共培养体系中加入SB431542,抑制TGF-β1/Smad信号通路。PC12细胞经NGF诱导分化后,加入LY294002抑制PI3K/AKT信号通路。ELISA检测上清中TGF-β1的表达变化,qRT-PCR和western blot检测PLOD2、TGF-β1、P-Smad3、Smad2/3、P-AKT、AKT 和神经相关分子 MAP2、NSE、GAP43、GFAP的表达变化。研究结果1.抑制PLOD2的基因表达,体外实验结果显示ADSCs的神经细胞修复作用减弱根据qRT-PCR及western blot结果,我们最终确定米诺地尔实验浓度为0.5mM。在共培养体系中,MAP2的免疫荧光染色结果显示,抑制PLOD2表达,ADSCs的神经修复作用减弱。EdU结果显示,米诺地尔可以降低ADSCs对大鼠皮质神经元增殖的刺激作用。LDH释放实验表明,米诺地尔可增加共培养体系中LDH含量。qRT-PCR和western blot实验进一步证实,米诺地尔可以抑制神经细胞PLOD2、MAP2、NSE和GAP43的表达,促进GFAP表达。2.TGF-β1在修复神经细胞损伤中的作用ELISA检测结果显示,ADSCs共培养可以提高损伤神经细胞培养上清中TGF-β1含量。qRT-PCR和western blot检测结果显示,外源性TGF-β1作用于划痕损伤的PC12细胞,低浓度TGF-β1（0.31-2.5 ng/mL）促进PLOD2的表达,当TGF-β1浓度达到5 ng/mL时这一作用减弱,当TGF-β1浓度为10和20 ng/mL时则抑制PLOD2表达。Western blot检测结果显示,低浓度TGF-β1抑制P-AKT的表达,促进P-Smad3的表达,而高浓度TGF-β1则相反。3.TGF-β1/Smad信号通路在ADSCs促进损伤神经细胞修复中的作用共培养体系中加入SB431542可以降低共培养上清中TGF-β1的含量,抑制神经细胞TGF-β1、P-Smad3和PLOD2的表达,降低神经相关分子MAP2、NSE、GAP43的表达,提高GFAP表达水平。加入LY294002抑制P-AKT表达后,PLOD2表达下降。上述结果进一步证实了 AKT信号通路可以调控PLOD2的表达,但是当低浓度TGF-β1存在时,PLOD2主要受TGF-β1/Smad信号通路调控。研究结论1.米诺地尔抑制神经细胞PLOD2基因表达后,ADSCs的神经细胞修复作用减弱,提示PLOD2在ADSCs修复神经细胞损伤中发挥重要作用。2.ADSCs共培养可以增加细胞培养上清中TGF-β1的含量,低浓度TGF-β1抑制P-AKT的表达,促进P-Smad3和PLOD2的表达,而高浓度TGF-β1则相反。3.体外实验显示SB431542抑制TGF-β1/Smad信号通路后,降低ADSCs神经修复作用及PLOD2表达。ADSCs通过分泌低剂量TGF-β1,激活Smad3信号通路促进PLOD2表达,发挥神经修复作用。第三部分ADSCs通过激活神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进脊髓损伤大鼠功能恢复研究目的1.建立脊髓损伤动物模型,体内实验验证ADSCs输注对脊髓损伤动物模型的治疗作用。2.大鼠体内输注SB431542,验证ADSCs通过激活神经细胞TGF-β1/Smad/PLOD2信号通路促进脊髓损伤功能恢复的作用。研究方法1.大鼠脊髓损伤模型制备大鼠腹腔麻醉后,以大鼠T8-T10棘突为中心取后正中切口切开,剥离并咬除棘突、椎板暴露脊髓,血管夹夹击脊髓30s,建立脊髓损伤模型。2.实验分组脊髓损伤模型制备成功3天后,大鼠分别给予PBS、ADSCs和SB431542原位注射。实验具体分为5组:假手术组,PBS对照组,ADSCs治疗组,ADSCs治疗+SB431542 组,SB431542 组。3.ADSCs输注对脊髓损伤的治疗作用在治疗后 3、7、14、21、28 天根据 BBB（Basso,Beattie,and Bresnahan）量化评分标准对所有动物运动功能进行评定。大鼠心脏取血,离心收集血清,ELISA检测血清中TGF-β1的含量。移植后3天随机取各组动物,取出脊髓组织,4%多聚甲醛固定,制作石蜡和冰冻切片,进行HE染色,尼氏染色,免疫组织化学染色检测脊髓组织中MAP2的表达。取出治疗3天后的脊髓组织,提取总RNA和总蛋白。qRT-PCR和western blot检测神经细胞相关分子（MAP2、NSE、GAP43和 GFAP）和 PLOD2、TGF-β1、P-Smad3 和 Smad2/3 的表达变化。研究结果1.ADSCs移植可以促进脊髓损伤大鼠功能恢复ADSCs移植可以促进大鼠运动功能的恢复,减少脊髓病变体积及空泡的形成,增加尼氏小体数量,促进脊髓神经细胞神经相关分子MAP2、NSE和GAP43表达,抑制GFAP表达。2.ADSCs通过激活神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进脊髓损伤大鼠功能恢复ADSCs移植可以显着提高大鼠血清中TGF-β1的含量,促进脊髓神经细胞PLOD2、TGF-β1、P-Smad3的基因和蛋白表达。抑制剂SB431542输注明显抑制ADSCs对大鼠运动功能的恢复作用,脊髓组织结构损伤加重,神经细胞PLOD2、TGF-β1、P-Smad3 和神经相关分子（MAP2、NSE、GAP43）表达降低,GFAP表达增加,ADSCs的神经修复作用减弱。研究结论1.脊髓损伤动物实验研究结果显示,ADSCs移植可以促进脊髓损伤大鼠运动功能的恢复,同时也能促进神经元的存活,促进损伤结构的恢复。2.体内实验表明,ADSCs的治疗作用会被SB431542抑制。体内实验进一步证实ADSCs通过激活TGF-β1/Smad3信号通路促进神经细胞PLOD2表达,从而促进脊髓损伤的修复。
吴承杰[7]（2021）在《基于NgR/RhoA/ROCK通路探究温肾通督方促进脊髓损伤修复的机制》文中研究指明目的:观察损伤神经元Nogo受体（NgR）的动态表达变化及温肾通督方（脊髓康）对脊髓损伤的干预作用,探究温肾通督方通过调控NgR/RhoA/ROCK信号通路促进脊髓损伤修复的机制。方法:第一部分:以浸泡时间、加水量、煎煮时间、煎煮次数为影响因素,通过正交试验进行分组。采用高效液相色谱法测定黄芪甲苷、丹参酮ⅡA,并结合出膏率分析各因素对温肾通督方水提工艺的影响。第二部分:大鼠神经元体外分离后,进行纯化培养,使用免疫荧光法对其神经核抗原（NeuN）进行鉴定。采用谷氨酸制备神经元损伤模型,并使用TUNEL法进行鉴定。实验分为1d、3d、7d、14d、对照组,使用NgR与NeuN免疫荧光双重标记染色、Western blot、qPCR观察损伤神经元表达NgR的情况;采用PC12细胞替代神经元,制备损伤模型后分别使用大鼠含药血清（空白对照组、强的松组、温肾通督方组）干预,并于1d、3d、7d进行NgR免疫荧光标记染色、qPCR观察NgR的表达情况。第三部分:采用改良Allen’s法制备SD大鼠脊髓损伤模型,将实验分为模型组、强的松组、温肾通督方组、假手术组。大鼠的运动功能采用BBB评分和斜板试验评价,高尔基染色和透射电镜观察神经组织的微观结构,TUNEL与NeuN的荧光双标法检测神经元的凋亡。第四部分:制备大鼠脊髓损伤模型,将实验分为模型组、强的松组、温肾通督方组、假手术组。采用NeuN与NgR的荧光双标法检测局部NgR的表达与定位,免疫组化、Western blot、qPCR检测损伤区NgR、RhoA、ROCK 的表达。结果:第一部分:温肾通督方的最佳水提工艺为浸泡时间1h,加12倍水量,煎煮3次,每次1h。第二部分:免疫荧光、Western blot、qPCR结果均表明损伤神经元在1d时NgR表达最高,与对照组相比具有明显差异（P<0.05）,3d、7d、14d逐渐下降;免疫荧光、qPCR结果均表明温肾通督方组的PC12细胞在7d时NgR表达减少,与空白对照组相比具有明显差异（P<0.05）。第三部分:在28d与模型组相比,BBB评分和斜板试验均表明温肾通督方可促进脊髓损伤大鼠运动功能的恢复（P<0.05）;高尔基染色和透射电镜均提示温肾通督方可改善脊髓损伤大鼠神经元的微观结构（线粒体、内质网、树突棘等）;TUNEL与NeuN的荧光双标表明温肾通督方可降低脊髓损伤大鼠神经元的凋亡率（P<0.05）。第四部分:NeuN与NgR的荧光双标法表明温肾通督方可抑制脊髓损伤大鼠神经元NgR的表达（P<0.05）;免疫组化、Western blot、qPCR表明温肾通督方可抑制脊髓损伤大鼠损伤区NgR、RhoA和ROCK的表达（P<0.05）。结论:温肾通督方的最佳水提工艺为浸泡时间1h,加12倍水,煎煮3次,每次1h;温肾通督方可通过抑制NgR/RhoA/ROCK通路促进神经元轴突再生,进而改善脊髓损伤大鼠的运动功能。
邓怡平[8]（2021）在《穿心莲活性成分高值化加工利用应用基础研究》文中研究说明穿心莲（Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees）为一年生草本,药用部位为其地上部分,具有清热解毒,凉血消肿之效,是我国的传统中药。其主要成分穿心莲内酯（Andrographolide,AD）是一种二萜内酯类化合物,具有抗炎、抗病毒、抗血栓生成、镇静、抗生育、保肝、抗癌、调节免疫和糖尿病的作用。尤其是以它的高抗炎作用,以及对上呼吸道感染的治疗特性而被广泛认可,有“中药消炎药”、“天然抗生素”的美誉。但其脂溶性较低、水溶性极低,生物利用度低,这制约了其药效的发挥。且穿心莲内酯味极苦,服用较大剂量时会导致胃脘不适。将其制备成聚合物后,可以改善穿心莲内酯的吸收和分布,同时提高肺部和结肠的抗炎效果,降低毒副作用,丰富穿心莲内酯的剂型选择,提高穿心莲内酯稳定性;还可以减少病人用量,节约中药资源,进而可以减少穿心莲栽培量,节约宝贵的土地资源。为了达到穿心莲有效成分高值化利用的目的,本研究中选用穿心莲叶为原料,利用超声微波辅助胶束提取法来提取穿心莲有效成分,并将其中的穿心莲内酯进行纯化。将穿心莲内酯与甘露低聚糖进行共价连接形成两亲性的聚合物,其可以在水中形成稳定的胶束,并考察了其理化表征、体外和体内评价以及抗炎活性。本研究中选择十二烷基二甲基甜菜碱作为表面活性剂并利用超声微波辅助胶束提取法来提取穿心莲有效成分。在超声功率为固定的50 W的基础上,最终确定了穿心莲提取的最优条件为:表面活性剂用量为3%,料液比为1:20,微波功率为800 W,微波时间为8 min。在该条件下,最终的穿心莲内酯提取率为2.41%,脱水穿心莲内酯的提取率为1.32%。将穿心莲提取液用盐沉降后,所得的提取液用乙酸乙酯萃取,并经过脱色纯化后,得到了纯度为97.85%的穿心莲内酯结晶,总收率为70.62%。将穿心莲内酯与琥珀酸酯反应形成脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯（DAS）,与甘露低聚糖链通过共价键连接形成两亲性聚合物结构,即脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯-甘露低聚糖聚合物（DAS-Man）。通过高效液相色谱、红外光谱和核磁共振氢谱检测其化学结构,发现制备成的DAS-Man成功将甘露低聚糖和穿心莲内酯通过琥珀酸酐连接到了一起。以DAS-Man的临界胶束浓度作为考察标准,确定了 DAS-Man的最佳制备比例为,穿心莲内酯和甘露低聚糖单个糖单元之间的摩尔比例为2:1,反溶剂类型为乙酸乙酯,所得产物的收率为28.79%,载药量为9.78%,临界胶束浓度为0.43 mg/mL。通过激光粒度仪的检测可以发现,DAS-Man胶束的平均粒径为115.1±13.74 nm,冻干后复溶的DAS-Man胶束的平均粒径为133.0±11.86 nm。电镜结果表明,DAS-Man粉体为40-70 nm小微粒构成的疏松的块状,DAS-Man胶束粒子为球形,部分粒子可以观察到明显的核壳结构,冻干使DAS-Man胶束的粒径变大,但对其分散性和溶解性无明显影响。XRD和DSC图谱中显示出,穿心莲内酯是典型的晶体结构,DAS-Man和DAS-Man冻干粉是以无定形态存在。穿心莲内酯吸热时伴随着失重,说明穿心莲内酯在熔融过程中同时伴有分解。DAS-Man和冻干DAS-Man的失重曲线与甘露低聚糖的类似,其原因可能是穿心莲内酯在DAS-Man中的载药量偏低导致。同时说明,DAS-Man溶解冻干后对其热稳定性无明显影响。DAS-Man中乙酸乙酯和DMSO的残留量分别为0.06%和0.09%,远小于中国药典中对Ⅲ类溶剂的要求,可以安全使用。体外溶出、释放、稳定性和模拟消化结果表明,DAS-Man可在水溶液中形成稳定的胶束,且在去离子水,人工胃液和人工肠液中的溶出度均接近完全溶出,在人工胃液中的释放率低于其他两种介质。DAS-Man的化学键和其形成的胶束在这三种溶剂体系中均稳定存在,其结构不易在水中被破坏,这有助于其以整体的胶束状态被摄入细胞,同时有助于其以完整状态进入结肠发挥作用。体外模拟消化实验表明,DAS-Man在模拟体液中以胶束状态存在。在经历了口腔、胃、小肠、大肠阶段的模拟消化以后,口腔中的游离的穿心莲内酯含量仅为投药量的 0.02±0.01%,在胃中为 0.17±0.02%,在小肠中为 0.63±0.02%,在大肠中为 16.63 ±1.82%。DAS-Man在口腔、胃、小肠中的粒径稳定,释放量低;在大肠中粒径变大、游离药物量增加,其原因可能是聚合物结构受到模拟大肠液中的细菌作用,部分共价键被破坏,穿心莲内酯被释放出来一部分,同时其胶束结构也受到影响,粒径增大。说明DAS-Man的胶束结构和聚合物结构在口腔到小肠阶段中非常稳定,而在大肠阶段中在细菌作用下被破坏,穿心莲内酯被释放,达到结肠给药的效果。生物利用度结果表明,DAS组和DAS-Man组的AUC值分别是是穿心莲内酯组的0.59倍和1.85倍,DAS-Man出峰时间比穿心莲内酯组晚,且存在双峰现象。组织分布实验结果表明,穿心莲内酯组在达到脾脏、肾脏和小肠峰值的时间为0.5 h,达到心脏、肝脏、肺脏中的达峰时间为1h,在脑、脊髓、大肠中达到峰值的时间为4 h。DAS-Man组在心脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠中的达峰时间为1h,在肝脏中的达峰时间为2 h,在大鼠脑、脊髓、大肠中的达峰时间为4 h。其原因可能是有部分DAS-Man以聚合物或者胶束的状态被摄取入细胞,并在肝脏中代谢成游离穿心莲内酯,另外有一部分在大肠中被分解后形成游离穿心莲内酯后再进入血液循环。DAS-Man组的肝肾中药物含量高于穿心莲内酯组,原因可能是其血流丰富,同时其也是穿心莲内酯的代谢部位。除肝肾外,DAS-Man在肺中的穿心莲内酯含量也高于穿心莲内酯组,其原因除了血药浓度高于穿心莲内酯组外,穿心莲内酯连接的亲水端甘露糖对肺部的靶向性也应该是其中一个原因,这对其在用于肺部炎症和感染的时候提高药效有一定作用。以脂多糖（LPS）致肺炎小鼠和恶唑酮（OXZ）致结肠炎作小鼠为模型动物对穿心莲内酯和DAS-Man的抗炎作用进行了考察。DAS-Man和穿心莲内酯能够降低LPS致急性肺炎小鼠肺组织的湿/干比、脾脏系数和髓过氧化物酶（MPO）活性,同时也能够降低血清和组织中的TNF-α、IL-6和IL-1β炎症因子含量,改善肺组织病理状态。DAS-Man 和穿心莲内酯能够延长 OXZ 致结肠炎小鼠生存时间,降低炎症小鼠结肠组织的DAI评分,减轻结肠缩短,降低脾脏系数,同时也能够降低血清和组织中的MPO活性、NO、TNF-α、IL-4和IL-1β炎症因子含量,降低水肿程度,改善结肠病理状态。DAS-Man对肺炎小鼠和结肠炎小鼠抗炎效果好于穿心莲内酯,提示DAS-Man对LPS所致的急性肺损伤和OXZ所致的结肠炎症具有一定的保护作用,其作用机制可能与穿心莲内酯可以抑制细胞炎症因子分泌有关。
程杰[9]（2021）在《鼠尾草酸抑制铁死亡减轻脊髓损伤的实验研究》文中提出目的:脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）后损伤部位出现各种病理级联反应,导致一系列细胞死亡的发生。反之,死亡的细胞释放众多危险信号,进而加重继发性损伤,形成一种恶行循环。铁死亡是一种新明确的细胞死亡形式,广泛参与中枢神经系统相关疾病的发生发展。鼠尾草酸（carnosic acid,CA）是一种双萜类小分子化合物,具有抗氧化、神经保护等作用,但目前尚缺乏鼠尾草酸对脊髓损伤保护性效应的研究。故本研究的主要目的是:1)制备大鼠脊髓损伤模型,探究铁死亡在脊髓损伤后的表现及其时间进程;2)借用PC12细胞拟神经元细胞构建铁死亡模型,在体外环境中探究鼠尾草酸能否抑制铁死亡;3)探索鼠尾草酸抑制铁死亡的作用机制;4)体内实验探究鼠尾草酸能否促进SCI大鼠神经功能恢复,及其具体机制。方法:1)将SD大鼠随机分为6个组:假手术组、SCI-6h组、SCI-1d组、SCI-3d组、SCI-7d组和SCI-14d组。利用改良的Allen’s重物坠落法制备大鼠脊髓损伤模型。利用生物信息学对脊髓损伤和铁死亡共同靶点进行分析,借用RT-q PCR技术对铁死亡特异性基因PTGS2、RPL8F、HMGB1、ATP5G3、IREB2和CS进行定量分析,免疫印迹（western blot,WB）检测各组中ACSL4、FPN、FTH1、GPX4和x CT的蛋白质表达水平,利用普鲁士蓝染色和铁离子试剂盒测量各组脊髓组织中铁离子水平,试剂盒检测各组GPX4酶活性水平,借用FJB染色分析变性神经元细胞情况;2)细胞增殖活性检测试剂盒（CCK-8）检测不同浓度的鼠尾草酸和erastin对PC12细胞活性的影响,确定后续实验所需药物浓度。实验分为6个组:对照组、模型组、阳性对照组（Fer-1组）、低、中、高剂量鼠尾草酸组。试剂盒检测各组中丙二醛（malonaldehyde,MDA）、谷胱甘肽（glutathione,GSH）、二价铁离子(Fe2+)和谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4,GPX4）活性的水平。利用流式细胞技术检测鼠尾草酸对细胞内ROS水平的影响。利用Mito-Tracker Red染色及醋酸双氧铀和枸橼酸铅双染色观察鼠尾草酸对线粒体膜电位和形态的影响;3)实验分为九个组:对照组、模型组、低剂量CA干预组、中剂量CA干预组、高剂量CA干预组和Nrf2抑制剂组。采用WB和免疫荧光（immunofluorescence,IF）技术检测鼠尾草酸对Nrf2表达水平和分布的影响,利用RT-q PCR和WB分别检测鼠尾草酸对Nrf2、x CT、GCLM、GCLC、GSS、GPX4、FTH1和FPN的m RNA和蛋白质表达的影响。试剂盒检测鼠尾草酸对MDA、GSH、Fe2+和GPX4酶活性的影响;4)将SD大鼠随机分为4个组:假手术组、模型组、鼠尾草酸低剂量组、鼠尾草酸高剂量组。借用BBB评分和斜板实验评估大鼠的运动功能,采用HE染色观察脊髓形态的变化,利用FJB染色和尼氏染色观察鼠尾草酸对脊髓损伤后神经元细胞状态的影响,利用试剂盒检测鼠尾草酸对脊髓损伤后MDA、GSH、Fe2+和GPX4酶活性的影响,借用RT-q PCR和WB技术分别检测鼠尾草酸对脊髓损伤后铁死亡相关靶点的m RNA水平和蛋白质水平的影响。结果:1)RT-q PCR结果显示,脊髓损伤后PTGS2、RPL8F和HMGB1的m RNA水平高于假手术组（P<0.01）,其中PTGS2在脊髓损伤后6小时表达最高,RPL8F和HMGB1约在第三天达到峰值。WB结果显示,术后第3天ACSL4的表达水平较假手术组显着升高（P<0.01）;脊髓损伤后FPN的表达水平显着降低（P<0.01）,术后第3天表达最低,而FTH1在术后第3天表达水平显着升高（P<0.01）;脊髓损伤后第1天,GPX4和x CT的表达较假手术组显着降低（P<0.01）。脊髓组织铁离子检测结果显示,脊髓损伤后6小时,铁离子水平显着增加（P<0.01）,第3天达到最高峰。术后第1天,GPX4酶活性较假手术组显着降低（P<0.01）,第3天达到最低值。FJB染色结果显示术后6h,变性的神经元数量即显着增加（P<0.01）,术后第3天达到峰值;2)CCK-8结果显示,鼠尾草酸浓度≤20μM对PC12细胞无明显毒性作用（P>0.5）,选择浓度为1、5和10μM的鼠尾草酸用于后续实验。结果显示,鼠尾草酸能够恢复erastin诱导的PC12细胞活力下降。Erastin刺激诱导PC12细胞,能够明显地降低细胞内GSH水平和GPX4酶活力（P<0.01）,同时增加细胞内MDA的含量（P<0.01）,而鼠尾草酸能够逆转erastin所产生的效应。流式结果显示erastin能够增加PC12细胞内ROS水平（P<0.01）,而鼠尾草酸能够降低ROS的含量（P<0.01）。线粒体形态观察结果显示,erastin能够降低线粒体膜电位,导致线粒体皱缩、线粒体嵴减少或消失,而鼠尾草酸能够明显地改善线粒体膜电位和形态的变化;3)RT-q PCR结果显示,鼠尾草酸对PC12细胞内Nrf2的m RNA水平无明显作用,但WB和IF结果显示,与模型组相比,鼠尾草酸显着增加了细胞内Nrf2蛋白质水平,同时促进了其向细胞核内聚积。RT-q PCR和WB的结果显示,鼠尾草酸能够显着地上调PC12细胞内x CT、GCLM、GCLC、GSS、GPX4、FTH1和FPN的m RNA及蛋白质表达水平,而Nrf2特异性抑制剂ML385能够削弱鼠尾草酸的上调效应;4)BBB运动学评分结果显示,术后第7天,SCI+H-CA组的BBB评分优于SCI组（P<0.05）,从术后第14天开始,SCI+L-CA组和SCI+H-CA组的BBB评分高于SCI组。斜板实验结果显示,术后第3天,SCI+H-CA组的斜坡角度大于SCI组（P<0.05）,从术后第7天开始,SCI+L-CA组和SCI+H-CA组的斜坡角度明显优于SCI组（P<0.01）。与SCI组相比,鼠尾草酸能够减轻脊髓组织形态病理学改变,减少变性神经元数量（P<0.01）,增加存活的神经元数目（P<0.01）。鼠尾草酸能够逆转脊髓损伤后高水平的PTGS2的m RNA含量、ACSL4的蛋白质含量、MDA含量和铁离子含量,以及低表达的GSH含量和GPX4酶活性水平。RT-q PCR和WB实验结果显示,与SCI组相比,鼠尾草酸能够上调Nrf2、x CT、GCLC、GCLM、GSS、GPX4、FPN和FTH1的m RNA表达水平及蛋白质表达量。结论:1)铁死亡参与脊髓继发性损伤过程,并且在损伤早期（6 h）即可出现铁死亡现象,于术后第3天最显着;2)鼠尾草酸能够抑制erastin诱导的PC12细胞铁死亡的发生;3)鼠尾草酸能够通过激活Nrf2通路,上调GSH-GPX4轴,同时增加FTH1和FPN的表达水平,提高细胞内源性抗氧化能力,进而抑制铁死亡的发生;4)鼠尾草酸能够通过激活Nrf2通路,抑制铁死亡的发生,增加存活的神经元细胞,减轻脊髓损伤,促进神经功能的恢复。
张琴[10]（2020）在《温针灸对脊髓损伤大鼠Shh/Gli-1信号通路影响的实验研究》文中研究说明目的:本实验通过对脊髓损伤模型大鼠施予艾条温针灸,观察艾条温针灸干预对脊髓损伤模型大鼠行为学,脊髓损伤处不同时间段Shh（sonic hedgehog,简称Shh）和Gli-1（glima-associated oncogene homolog-1,简称Gli-1）的mRNA（messenger ribonucleic acid,简称mRNA）与蛋白表达情况,探索温针灸对脊髓损伤修复的作用与Shh/Gli-1信号通路之间的关系,以探讨温针灸治疗脊髓损伤的作用机制,为临床温针灸治疗脊髓损伤提供实验理论依据。方法:本实验采用随机分组,平行对照的设计方法展开研究。参照改良Allen’s的重物打击法制备平第10胸椎（T10）脊髓损伤大鼠模型54只,然后,将造模成功的54只大鼠按照信封随机法分为四个大组,分别为急性期艾条温针灸治疗组、恢复期艾条温针灸治疗组、持续艾条温针灸治疗组和模型对照组,其中,持续治疗组和模型对照组又各有两个亚组,即持续艾条温针灸治疗7天组、持续艾条温针灸治疗14天组和模型对照7天组、模型对照14天组,另设置1组正常空白对照组,共7组,每组均为9只,总共63只大鼠。各治疗组按照不同时间段的划分予以温针灸治疗,同时在造模后24小时、第7天、第14天利用BBB（Basso,Beattie&Bresnahan,简称BBB）评分法分别进行大鼠双后肢的运动功能评分。造模后第7天对模型对照7天组及持续治疗7天组进行脊髓损伤处脊髓样本取材,余组脊髓损伤处脊髓样本取材在第14天治疗结束且完成BBB评分后进行。取材成功后利用实时荧光定量PCR（polymerase chain reaction,简称PCR）法检测各组大鼠Shh mRNA与Gli-1 mRNA的表达,利用Western blot法检测各组大鼠Shh与Gli-1蛋白的表达。所有实验数据采用SPSS22.0统计软件进行统计分析,当P≥0.05表示无统计学意义,P<0.05表示其差异有统计学意义,P<0.01表示具有极显着性统计学意义。结果:1.各组大鼠行为学指标观察各组于术后3个时间点BBB评分结果显示:术后第1天各组大鼠BBB评分均为0分,造模较成功;第7天,已经介入温针灸治疗的大鼠BBB评分显着高于模型对照组（P<0.05）;第14天,所有治疗组大鼠的BBB评分都明显高于模型对照组（P<0.05）,各治疗组间比较,恢复期治疗组评分低于其他两个治疗组,且有统计学上的差异（P<0.05）,持续治疗组BBB评分稍高于急性期治疗组,但无明显差异（P>0.05）。2.各组大鼠Shh和Gli-1的mRNA表达情况观察各组大鼠Shh与Gli-1的mRNA表达结果显示:与正常对照组相比较,模型对照组和温针灸治疗组Shh、Gli-1 mRNA表达均有增多,其差异具有统计学意义（P<0.05）;第7天、第14天这两个时间段,持续治疗组Shh、Gli-1 mRNA的表达均高于模型对照组,且P<0.05;模型7天组Shh、Gli-1 mRNA的表达与模型14天组比较无明显差异（P>0.05）;恢复期治疗组Shh mRNA表达较模型14天组虽有小幅上升,但其差异不具有统计学意义（P>0.05）,急性期治疗组Shh mRNA表达较模型14天组有显着增多,P<0.05。各治疗组Gli-1 mRNA表达均高于模型14天组,差异具有统计学意义（P<0.05）;同时间段各治疗组之间比较,急性期治疗组Shh、Gli-1 mRNA表达高于恢复期治疗组,但低于持续治疗14天组,其差异具有统计学意义（P<0.05）。3.各组大鼠Shh和Gli-1的蛋白表达情况观察各组大鼠Shh与Gli-1的蛋白表达结果显示:模型7天组大鼠Shh、Gli-1蛋白表达与正常对照组大鼠比较,其差异无统计学意义（P>0.05）;模型14天组大鼠Shh、Gli-1蛋白表达较正常组有较明显的增多（P<0.05）;各治疗组的Shh、Gli-1蛋白表达均比正常对照组明显提高,差异显着（P<0.05）;持续治疗7天组大鼠Shh蛋白表达和同时间段的模型对照组相比明显增多（P<0.05）,与此同时,持续治疗7天组Gli-1蛋白表达虽较模型7天组稍多,但差异无统计学意义（P>0.05）;持续治疗14天组大鼠Shh、Gli-1蛋白表达和同时间段的模型对照组相比,明显增多（P<0.05）;与模型14天组比较,急性期治疗组大鼠Shh、Gli-1蛋白表达明显增多,其差异有统计学意义（P<0.05）,恢复期治疗组Shh、Gli-1蛋白表达亦稍高于模型组,但其差异不具有统计学意义（P>0.05）;同时间段各治疗组间比较,急性期治疗组Shh蛋白表达明显高于恢复期治疗组,具有统计学意义（P<0.05）,但稍低于持续治疗14天组,其差异无统计学意义（P>0.05）;持续治疗14天组大鼠Shh蛋白表达明显高于持续治疗7天组,其差异有统计学意义（P<0.05）。与此同时,虽然持续治疗14天组大鼠Gli-1蛋白表达高于恢复期治疗组,且差异具有统计学意义（P<0.05）;但是急性期治疗组大鼠Gli-1蛋白表达虽高于恢复期治疗组,低于持续治疗14天组,但均无统计学意义上的差异（P>0.05）。结论:1.温针灸干预可以有效改善脊髓损伤模型大鼠的行为学指标,温针灸有促进脊髓损伤后肢体运动神经功能恢复的治疗作用。2.在大鼠脊髓损伤后,其自身可激活Shh、Gli-1的表达以达到机体自身的缓慢修复。3.温针灸可以促进Shh/Gli-1信号通路中Shh、Gli-1的表达,进而有效促进神经干细胞的增殖分化,这可能是其治疗脊髓损伤的一个重要作用机制。4.脊髓损伤后温针灸的越早介入和持续介入能更有助于增加Shh、Gli-1的mRNA和蛋白表达,更有利于脊髓损伤运动神经功能恢复。
二、脊髓损伤模型制备及评价的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、脊髓损伤模型制备及评价的研究进展（论文提纲范文）
（1）基于含硒纳米材料的构建及其治疗脊髓损伤的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 SCI治疗的研究进展 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 SCI的病理生理特征 |
| 2.3 SCI的治疗策略 |
| 2.3.1 药物治疗 |
| 2.3.2 手术治疗 |
| 2.3.3 生物材料治疗 |
| 2.3.4 电刺激治疗 |
| 2.3.5 细胞移植治疗 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 硒-碳量子点(Se-CQDs)构建及其治疗SCI的实验研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 主要仪器设备 |
| 3.3 实验细胞和动物 |
| 3.3.1 实验细胞及细胞培养 |
| 3.3.2 实验动物 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.4.1 Se-CQDs的制备 |
| 3.4.2 Se-CQDs表征 |
| 3.4.3 Se-CQDs清除氧自由基 |
| 3.4.4 Se-CQDs的生物相容性 |
| 3.4.5 体外H_2O_2诱导的细胞毒性及其对氧化应激的保护作用.. |
| 3.4.6 Se-CQDs抑制炎症的体外实验 |
| 3.4.7 SCI挫伤动物模型制备 |
| 3.4.8 行为学分析 |
| 3.4.9 SCI H&E、LFB和免疫荧光染色的脊髓组织获取 |
| 3.4.10 H&E染色实验方法 |
| 3.4.11 Luxol fast blue(LFB)染色实验方法 |
| 3.4.12 脊髓髓鞘微观结构 |
| 3.4.13 脊髓组织免疫荧光染色 |
| 3.4.14 Se-CQDs对体内继发性损伤的抗凋亡作用 |
| 3.4.15 统计分析 |
| 3.5 结果 |
| 3.5.1 Se-CQDs制备与表征 |
| 3.5.2 Se-CQDs的生物相容性 |
| 3.5.3 Se-CQDs在H_2O_2模拟的氧化应激环境下对细胞的保护作用 |
| 3.5.4 Se-CQDs对LPS诱导BV2细胞表达促炎因子的影响 |
| 3.5.5 Se-CQDs对SCI大鼠模型的治疗作用 |
| 3.5.6 不同治疗组对脊髓组织形态学的影响 |
| 3.5.7 不同治疗组脊髓组织神经元及轴突的保护性作用 |
| 3.5.8 Se-CQDs在体内的抗炎作用及减少胶质瘢痕能力。 |
| 3.5.9 Se-CQDs在体内的抗细胞凋亡能力。 |
| 3.6 讨论 |
| 3.6.1 生物材料通过清除ROS治疗SCI |
| 3.6.2 清除ROS有助于促进SCI功能恢复 |
| 3.7 本章小结 |
| 第四章 透明质酸-硒(Hyaluronic Acid-Selenium,HA-Se)纳米粒子构建及其治疗SCI的实验研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 主要仪器设备 |
| 4.3 实验细胞和动物 |
| 4.3.1 实验细胞及细胞培养 |
| 4.3.2 实验动物 |
| 4.4 实验方法 |
| 4.4.1 HA-Se纳米粒子的制备 |
| 4.4.2 HA-Se纳米粒子表征 |
| 4.4.3 HA-Se纳米粒子清除氧自由基 |
| 4.4.4 HA-Se纳米粒子的生物相容性 |
| 4.4.5 体外H_2O_2诱导的细胞毒性及其对氧化应激的保护作用.. |
| 4.4.6 HA-Se纳米粒子抑制炎症的体外实验 |
| 4.4.7 创伤性SCI挫伤动物模型制备 |
| 4.4.8 行为学分析 |
| 4.4.9 SCI后H&E、LFB和免疫荧光染色的脊髓组织获取 |
| 4.4.10 H&E染色实验方法 |
| 4.4.11 Luxol fast blue(LFB)染色实验方法 |
| 4.4.12 脊髓髓鞘微观结构 |
| 4.4.13 脊髓组织免疫荧光染色 |
| 4.4.14 HA-Se纳米粒子对体内继发性损伤的抗凋亡作用 |
| 4.4.15 统计分析 |
| 4.5 结果 |
| 4.5.1 HA-Se纳米粒子制备与表征 |
| 4.5.2 HA-Se纳米粒子的生物相容性 |
| 4.5.3 HA-Se纳米粒子在H_2O_2模拟的氧化应激环境下对细胞的保护 |
| 4.5.4 HA-Se纳米粒子抑制炎症的作用 |
| 4.5.6 SCI后CD44 表达 |
| 4.5.7 星形胶质细胞对HA-Se纳米粒子的内吞 |
| 4.5.8 HA-Se纳米粒子体内分布 |
| 4.5.9 HA-Se纳米粒子疗效分析 |
| 4.5.10 HA-Se纳米粒子体内抑制炎症的作用 |
| 4.5.11 HA-Se纳米粒子体内抗凋亡的作用 |
| 4.5.12 HA-Se纳米粒子体内安全性评价 |
| 4.6 讨论 |
| 4.6.1 靶向性纳米粒子治疗脊髓损伤 |
| 4.6.2 纳米粒子减轻继发性SCI促进神经功能恢复 |
| 4.7 小结 |
| 第五章 结论和展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在读期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）PLGA载药微球缓释体系的研发及其在脊髓损伤修复中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 脊髓损伤简介 |
| 1.2 脊髓损伤治疗 |
| 1.3 生物支架材料 |
| 1.3.1 水凝胶 |
| 1.3.2 纳米粒子 |
| 1.3.3 纳米纤维 |
| 1.4 载药微球体系 |
| 1.4.1 微球的特性 |
| 1.4.2 现有的微球制备方法 |
| 1.4.3 医学应用 |
| 1.5 选题目的、意义和创新点 |
| 第二章 电喷雾法制备壳聚糖/明胶载药微球及PLGA载药微球 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 原料与试剂 |
| 2.2.2 仪器与设备 |
| 2.2.3 壳聚糖/明胶复合微球及其载药微球的制备 |
| 2.2.4 壳聚糖/明胶共混液电导率及黏度的测定 |
| 2.2.5 PLGA微球及其载药微球的制备 |
| 2.2.6 形貌观察 |
| 2.2.7 微球药物包封率的测定 |
| 2.2.8 体外释放实验 |
| 2.2.9 圆二色光谱分析 |
| 2.2.10 体外细胞毒性实验 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 壳聚糖明胶共混液性质对微球形貌、粒径及其分布的影响 |
| 2.3.2 PLGA溶液浓度对微球形貌、粒径及其分布的影响 |
| 2.3.3 壳聚糖/明胶载药微球及PLGA载药微球药物释放分析 |
| 2.3.4 壳聚糖/明胶载药微球及PLGA载药微球的生物活性 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 PLA/NGF-PLGA/CS复合膜的制备及性能研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 原料与试剂 |
| 3.2.2 仪器与设备 |
| 3.2.3 PLA纤维膜的制备 |
| 3.2.4 CS纤维膜的制备 |
| 3.2.5 PLA/NGF-PLGA/CS复合膜的制备 |
| 3.2.6 形貌观察 |
| 3.2.7 PLA/NGF-PLGA/CS复合膜的力学性能 |
| 3.2.8 复合膜载药量及体外释放实验 |
| 3.2.9 体外细胞毒性实验 |
| 3.2.10 细胞分化实验 |
| 3.2.11 大鼠Allen's脊髓损伤模型的建立 |
| 3.2.12 复合膜的给药 |
| 3.2.13 行为评估 |
| 3.2.14 组织切片处理 |
| 3.2.15 苏木精伊红(HE)染色 |
| 3.2.16 免疫组织化学和免疫荧光检测 |
| 3.2.17 统计分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 复合膜中各层的制备与优化 |
| 3.3.2 力学性能 |
| 3.3.3 体外释药研究及生物相容性研究 |
| 3.3.4 PLA/NGF-PLGA/CS复合膜体外诱导PC-12细胞分化 |
| 3.3.5 功能性运动恢复 |
| 3.3.6 免疫组织化学和免疫荧光研究 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 负载NGF-PLGA微球温敏性水凝胶的制备及性能研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 原料与试剂 |
| 4.2.2 仪器与设备 |
| 4.2.3 P407/P188/SA复合凝胶的制备 |
| 4.2.4 NGF-PLGA/P407/P188/SA复合凝胶的制备 |
| 4.2.5 P407/P188/SA复合凝胶凝胶化时间及凝胶化温度的测定 |
| 4.2.6 复合凝胶的形貌观察 |
| 4.2.7 复合凝胶的流变学特性表征 |
| 4.2.8 体外释放实验 |
| 4.2.9 体外细胞毒性实验 |
| 4.2.10 细胞分化实验 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 P407/P188/SA复合凝胶的温敏性研究 |
| 4.3.2 P407/P188/SA复合凝胶的稳定性研究 |
| 4.3.4 NGF-PLGA/P407/P188/SA复合凝胶的形貌表征 |
| 4.3.5 体外释药研究及生物相容性研究 |
| 4.3.6 NGF-PLGA/P407/P188/SA复合凝胶体外诱导PC-12细胞分化 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 研究成果 |
| 致谢 |
（3）负载神经干细胞和多奈哌齐的导电水凝胶系统对脊髓损伤修复作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 脊髓损伤概述 |
| 1.1.1 脊髓损伤研究背景及意义 |
| 1.1.2 脊髓损伤后的病理生理改变 |
| 1.1.3 脊髓损伤治疗的研究现状 |
| 1.2 水凝胶治疗脊髓损伤的研究进展 |
| 1.2.1 水凝胶搭载干细胞治疗脊髓损伤 |
| 1.2.2 水凝胶搭载药物治疗脊髓损伤 |
| 1.2.3 导电水凝胶治疗脊髓损伤 |
| 1.3 多奈哌齐(DPL)在神经系统疾病中的应用 |
| 第二章 可注射型导电水凝胶的合成和表征测定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要实验试剂 |
| 2.2.2 主要实验仪器 |
| 2.2.3 实验动物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 材料合成 |
| 2.3.2 凝胶外像和微观结构 |
| 2.3.3 动态流变学分析 |
| 2.3.4 水凝胶的电活性 |
| 2.3.5 水凝胶的可注射性 |
| 2.3.6 水凝胶的自修复性 |
| 2.3.7 水凝胶的体外降解 |
| 2.3.8 水凝胶的体内降解及生物相容性评价 |
| 2.3.9 水凝胶的药物缓释 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 水凝胶的制备及表征 |
| 2.4.2 水凝胶的流变性质 |
| 2.4.3 水凝胶的电活性 |
| 2.4.4 水凝胶的可注射性 |
| 2.4.5 水凝胶的自修复性 |
| 2.4.6 水凝胶的降解性 |
| 2.4.7 水凝胶的生物相容性 |
| 2.4.8 水凝胶的药物缓释 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 水凝胶环境中多奈哌齐对NSC的生物学效应 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 主要实验试剂 |
| 3.2.2 主要实验仪器 |
| 3.2.3 实验动物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 NSC的提取,培养和鉴定 |
| 3.3.2 检测水凝胶的细胞毒性 |
| 3.3.3 检测水凝胶环境中DPL对NSC增殖效应 |
| 3.3.4 检测水凝胶环境中DPL对NSC分化效应 |
| 3.3.6 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 NSC的提取,培养和鉴定 |
| 3.4.2 水凝胶的细胞毒性 |
| 3.4.3 水凝胶环境中DPL对NSC增殖效应 |
| 3.4.4 水凝胶环境中DPL对NSC分化效应 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 水凝胶搭载NSC和DPL修复脊髓损伤 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 主要实验试剂 |
| 4.2.2 主要实验仪器 |
| 4.2.3 实验动物 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 大鼠T9脊髓全切动物模型构建 |
| 4.3.2 大鼠运动功能评价 |
| 4.3.3 大鼠神经电生理检测 |
| 4.3.4 大鼠脊髓组织灌注取材 |
| 4.3.5 切片组织学染色 |
| 4.3.6 统计学分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 大鼠的BBB运动功能评分 |
| 4.4.2 大鼠的神经电生理 |
| 4.4.3 大鼠脊髓损伤后组织修复情况 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 全文结论和创新点 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及攻读学位期间发表学术论文 |
| 致谢 |
（4）中西医协同治疗视神经脊髓炎相关性视神经炎的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 视神经脊髓炎相关性视神经炎实验模型的建立及应用研究进展 |
| 1 前言 |
| 2 动物实验模型 |
| 3 离体组织实验模型 |
| 4 细胞实验模型 |
| 5 结语 |
| 参考文献 |
| 综述二 视神经脊髓炎谱系疾病发病相关抗体的研究进展 |
| 1 NMO概述 |
| 2 AQP4-IgG |
| 3 MOG-IgG |
| 4 GFAP抗体 |
| 5 AQP1-IgG |
| 6 其他相关性抗体 |
| 7 结语 |
| 参考文献 |
| 综述三 细胞因子与视神经脊髓炎谱系疾病 |
| 1 前言 |
| 2 Th17细胞相关的细胞因子 |
| 3 Th2细胞相关细胞因子 |
| 4 Treg细胞相关细胞因子 |
| 5 其他细胞因子 |
| 6 结语 |
| 参考文献 |
| 综述四 非侵入性电刺激在眼科应用的研究进展 |
| 1 前言 |
| 2 经角膜电刺激 |
| 3 经眼眶电刺激 |
| 4 经眼睑电刺激 |
| 5 结语 |
| 参考文献 |
| 第二部分 临床研究视神经脊髓炎相关性视神经炎患者临床特点及疗效分析 |
| 研究背景 |
| (一) 视神经脊髓炎相关性视神经炎患者的临床特点分析 |
| 1 研究方案 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 诊断标准 |
| 1.3 纳入标准 |
| 1.4 排除标准 |
| 1.5 临床评估 |
| 1.6 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 一般资料 |
| 2.2 临床特点 |
| 2.3 实验室检查 |
| 2.4 影像学特点 |
| (二) 针刺联合中药治疗NMO所致视神经萎缩的临床疗效 |
| 1 临床资料 |
| 1.1 视神经萎缩诊断标准 |
| 1.2 纳入标准 |
| 1.3 排除标准 |
| 2 治疗方案 |
| 3 疗效指标 |
| 3.1 最佳矫正视力 |
| 3.2 动态视野 |
| 3.3 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 NMO视神经萎缩患者一般资料 |
| 4.2 临床表现 |
| 4.3 治疗前后最佳矫正视力比较 |
| 4.4 针刺治疗前后动态视野变化 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 实验研究 视神经脊髓炎相关视神经炎大鼠模型的构建与评价 |
| 研究背景 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验用动物及患者血清 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验方案 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 模型诱导后视神经内AQP4-IgG的沉积 |
| 2.2 大鼠视神经功能学变化 |
| 2.3 视神经光镜观察结果 |
| 2.4 视神经LFB染色结果 |
| 2.5 脊髓光镜观察结果 |
| 2.6 脊髓组织形态LFB染色结果 |
| 2.7 大脑光镜及HE染色观察结果 |
| 2.8 视网膜的光镜观察结果 |
| 2.9 视神经电镜超微结构观察 |
| 2.10 视神经NFL免疫荧光结果 |
| 2.11 视神经内CD68免疫荧光结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 NMO-ON动物模型构建国内外进展 |
| 3.2 本研究的主要结果与未来展望 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 实验研究 调肝活络法治疗视神经脊髓炎相关性视神经炎的疗效及机制探究 |
| 研究背景 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验用动物及血清 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 大鼠视神经F-VEP变化 |
| 2.2 大鼠视神经PLR变化 |
| 2.3 大鼠视网膜Brn3a变化 |
| 2.4 大鼠视神经形态学变化(HE染色) |
| 2.5 大鼠视神经超微结构变化(电镜) |
| 2.6 大鼠视神经组织免疫荧光染色结果 |
| 2.7 Western Blotting法检测视神经内目标蛋白阳性表达结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 NMO-ON的中西医防治现状 |
| 3.2 NMO-ON发病机制研究进展 |
| 3.3 调肝活络防治NMO-ON的疗效及潜在机制 |
| 4 结论 |
| 5 本研究主要创新、局限及未来展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间主要研究成果 |
（5）巨噬细胞膜包裹脂质体靶向治疗脊髓损伤的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 文献综述 脊髓损伤药物治疗的研究进展 |
| 1 脊髓损伤的病理生理特征 |
| 2 脊髓损伤的药物治疗 |
| 2.1 免疫调节 |
| 2.2 细胞凋亡 |
| 2.3 血管损伤 |
| 2.4 氧化应激 |
| 2.5 神经再生 |
| 3 脊髓损伤的药物递送系统 |
| 3.1 水凝胶药物递送系统 |
| 3.2 纳米粒药物递送系统 |
| 4 总结与展望 |
| 绪论 |
| 1 研究背景 |
| 2 课题设计与研究思路 |
| 2.1 研究目的及内容 |
| 2.2 课题创新点 |
| 第1章 巨噬细胞膜包裹脂质体的制备及表征 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验细胞 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 巨噬细胞膜的提取 |
| 2.2 内核脂质体的制备 |
| 2.3 巨噬细胞膜包裹脂质体的制备 |
| 2.4 盐酸米诺环素分析方法的建立 |
| 2.5 理化性质表征 |
| 2.6 功能蛋白表达 |
| 2.7 不同表型巨噬细胞膜包覆脂质体的制备及表征 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 理化性质表征 |
| 3.2 功能蛋白表征 |
| 3.3 不同极化表型巨噬细胞膜包裹脂质体的表征 |
| 本章小结 |
| 第2章 巨噬细胞膜包裹脂质体长循环及主动靶向性评价 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验细胞 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 巨噬细胞摄取 |
| 2.2 体内药代动力学研究 |
| 2.3 体外靶向性研究 |
| 2.4 离体成像研究 |
| 2.5 组织分布 |
| 2.6 组织荧光切片 |
| 2.7 不同表型巨噬细胞膜包裹脂质体的体内外靶向性 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 体外长循环作用研究 |
| 3.2 体内药代动力学研究 |
| 3.3 体外靶向性评价 |
| 3.4 体内靶向性评价 |
| 3.5 巨噬细胞极化分型对巨噬细胞包裹脂质体靶向性的影响 |
| 本章小结 |
| 第3章 巨噬细胞膜包裹载药脂质体药效及初步安全性评价 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验细胞 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 体外抗炎效果 |
| 2.2 体内药效评价 |
| 2.3 体内安全性初步评价 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 体外抗炎 |
| 3.2 体内药效 |
| 3.3 体内安全性初步评价 |
| 本章小结 |
| 全文结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在校期间科研成果 |
（6）ADSCs通过调控神经细胞TGF-β1/Smad/PLOD2信号通路修复脊髓损伤的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 ADSCs体外共培养对损伤神经细胞的修复作用 |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 ADSCs通过调控神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进损伤神经细胞的修复 |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分 ADSCs通过激活神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进脊髓损伤大鼠功能恢复 |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 五、总论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 文献综述 间充质干细胞治疗脊髓损伤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文一 |
| 外文论文二 |
（7）基于NgR/RhoA/ROCK通路探究温肾通督方促进脊髓损伤修复的机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 温肾通督方水提工艺的优化 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验药材 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 正交试验分组及药液制备 |
| 2.2 浸膏得率的测定 |
| 2.3 黄芪甲苷的含量测定 |
| 2.4 丹参酮ⅡA的含量测定 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 小结 |
| 第二部分 脊髓损伤后神经元表面NgR的动态表达及含药血清的干预作用 |
| 1 脊髓损伤后神经元表面NgR的动态表达情况 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 大鼠原代神经元的分离及培养 |
| 1.2.2 大鼠原代神经元的形态观察及免疫荧光鉴定 |
| 1.2.3 大鼠损伤神经元模型的制备及TUNEL法鉴定 |
| 1.2.4 免疫荧光双重标记染色法检测损伤神经元NgR蛋白的表达 |
| 1.2.5 蛋白免疫印迹法(Western blot)检测损伤神经元NgR蛋白的表达 |
| 1.2.6 实时荧光定量法(qPCR)检测损伤神经元NgR mRNA的表达 |
| 1.2.7 统计学分析 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 大鼠原代神经元的形态观察及鉴定结果 |
| 1.3.2 大鼠原代损伤神经元的鉴定结果 |
| 1.3.3 大鼠原代损伤神经元NgR蛋白的表达情况 |
| 1.3.4 大鼠原代损伤神经元NgR mRNA的表达情况 |
| 1.4 小结 |
| 2 温肾通督方含药血清对神经元样PC12细胞NgR表达的干预作用 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验细胞 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大鼠含药血清的制备 |
| 2.2.2 PC12细胞的培养及诱导分化 |
| 2.2.3 CCK-8法检测不同浓度谷氨酸对神经元样PC12细胞增殖的影响 |
| 2.2.4 神经元样PC12细胞的模型制备及含药血清干预 |
| 2.2.5 免疫荧光标记染色法检测神经元样PC12细胞NgR蛋白的表达 |
| 2.2.6 实时荧光定量法检测神经元样PC12细胞NgR mRNA的表达 |
| 2.2.7 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 PC12细胞诱导前后的形态观察 |
| 2.3.2 不同浓度谷氨酸对神经元样PC12细胞存活率的影响 |
| 2.3.3 含药血清干预后神经元样PC12细胞NgR蛋白的表达情况 |
| 2.3.4 含药血清干预后神经元样PC12细胞NgRmRNA的表达情况 |
| 2.4 小结 |
| 第三部分 温肾通督方对脊髓损伤大鼠运动功能及脊髓组织病理结构的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 脊髓损伤大鼠模型的制备及药物干预 |
| 2.2 Basso,Beattie和Bresnahan (BBB)运动量表评分 |
| 2.3 斜板测试 |
| 2.4 高尔基染色观察脊髓损伤大鼠脊髓组织的病理结构 |
| 2.5 透射电镜观察脊髓损伤大鼠神经元的显微结构 |
| 2.6 免疫荧光标记染色法检测神经元的凋亡情况 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 脊髓损伤大鼠运动功能的恢复情况 |
| 3.2 脊髓损伤大鼠脊髓组织的病理结构观察 |
| 3.3 脊髓损伤大鼠神经元的微观结构观察 |
| 3.4 脊髓损伤大鼠神经元的凋亡率分析 |
| 4 小结 |
| 第四部分 温肾通督方通过调控NgR/RhoA/ROCK通路促进脊髓损伤修复的机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 脊髓损伤大鼠模型的制备及药物干预 |
| 2.2 免疫荧光染色标记法检测神经元NgR蛋白的表达 |
| 2.3 免疫组化法检测脊髓组织NgR蛋白的表达 |
| 2.4 蛋白免疫印迹法(Western blot)检测NgR、RhoA、ROCK蛋白的表达 |
| 2.5 实时荧光定量法(qPCR)检测NgR、RhoA、ROCK mRNA的表达 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 脊髓损伤大鼠神经元NgR蛋白的表达情况 |
| 3.2 脊髓损伤大鼠脊髓组织NgR、RhoA、 ROCK蛋白的表达情况 |
| 3.3 脊髓损伤大鼠脊髓组织NgR、RhoA、ROCK mRNA的表达情况 |
| 4 小结 |
| 第五部分 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略词 |
| 脊髓损伤后神经源性肠道功能障碍发生机制及诊疗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
（8）穿心莲活性成分高值化加工利用应用基础研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 穿心莲简介 |
| 1.2.1 穿心莲的生物学特性 |
| 1.2.2 穿心莲的生长特性 |
| 1.2.3 穿心莲资源分布 |
| 1.2.4 穿心莲化学成分研究 |
| 1.2.5 穿心莲有效成分含量的影响因素 |
| 1.2.6 穿心莲的药理作用 |
| 1.2.7 穿心莲有效成分的提取方法 |
| 1.3 穿心莲内酯研究概况 |
| 1.3.1 穿心莲内酯结构和理化性质 |
| 1.3.2 穿心莲内酯的药理作用及其临床应用 |
| 1.4 聚合物胶束研究进展 |
| 1.4.1 pH响应性聚合物胶束 |
| 1.4.2 还原响应性聚合物胶束 |
| 1.4.3 温度响应性聚合物胶束 |
| 1.4.4 光响应性聚合物胶束 |
| 1.4.5 酶响应性聚合物胶束 |
| 1.4.6 多响应性聚合物胶束 |
| 1.4.7 聚合物前药胶束 |
| 1.5 课题研究意义、内容及技术路线 |
| 1.5.1 研究意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 1.5.3 研究技术路线 |
| 2 穿心莲中有效成分的提取和纯化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料和仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 HPLC法检测穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯含量 |
| 2.3.2 穿心莲原料内有效成分含量的确定 |
| 2.3.3 表面活性剂的选择 |
| 2.3.4 超声微波辅助胶束提取穿心莲有效成分的工艺优化 |
| 2.3.5 提取率计算 |
| 2.3.6 穿心莲内酯的纯化 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯标准曲线的绘制 |
| 2.4.2 穿心莲原料中有效成分含量测定 |
| 2.4.3 提取工艺优化结果 |
| 2.4.4 穿心莲内酯纯化结果 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯-甘露低聚糖聚合物(DAS-Man)的制备 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯的制备 |
| 3.3.2 DAS-Man的制备 |
| 3.3.3 制备体系中高沸点溶剂的去除 |
| 3.3.4 DAS-Man制备条件优化 |
| 3.4 材料表征和评价方法 |
| 3.4.1 HPLC法检测脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯含量 |
| 3.4.2 傅里叶红外光谱的检测(FTIR) |
| 3.4.3 紫外吸收光谱检测 |
| 3.4.4 核磁共振氢谱检测(~1H NMR) |
| 3.4.5 临界胶束浓度(CMC)的测定 |
| 3.5 实验结果与讨论 |
| 3.5.1 DAS标准曲线的绘制 |
| 3.5.2 脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯的合成结果 |
| 3.5.3 DAS-Man的合成结果和收率 |
| 3.5.4 DAS-Man的红外光谱 |
| 3.5.5 DAS-Man的紫外光谱 |
| 3.5.6 DAS-Man的核磁共振氢谱结果 |
| 3.5.7 临界胶束浓度(CMC)的测定结果 |
| 3.6 本章小结 |
| 4 DAS-Man的理化性质和溶剂残留 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 粒径检测 |
| 4.3.2 扫描电镜检测(SEM) |
| 4.3.3 透射电镜检测(TEM) |
| 4.3.4 原子力显微镜检测(AFM) |
| 4.3.5 X射线衍射检测(XRD) |
| 4.3.6 示差扫描热量分析(DSC) |
| 4.3.7 热重分析(TG) |
| 4.3.8 溶剂残留检测 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 粒径检测结果 |
| 4.4.2 扫描电镜结果 |
| 4.4.3 透射电镜结果 |
| 4.4.4 原子力显微镜结果 |
| 4.4.5 X射线衍射结果 |
| 4.4.6 示差扫描热量分析结果 |
| 4.4.7 热重分析结果 |
| 4.4.8 溶剂残留检测结果 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 DAS-Man自组装胶束的体外评价 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与仪器 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 HPLC法和UV法检测药物浓度 |
| 5.3.2 穿心莲内酯的饱和溶解度检测 |
| 5.3.3 溶出度检测 |
| 5.3.4 释放率检测 |
| 5.3.5 稳定性检测 |
| 5.3.6 体外消化稳定性 |
| 5.3.7 体外毒性检测 |
| 5.4 实验结果与讨论 |
| 5.4.1 DAS-Man标准曲线的绘制 |
| 5.4.2 饱和溶解度检测 |
| 5.4.3 溶出度检测 |
| 5.4.4 释放率检测结果 |
| 5.4.5 稳定性检测结果 |
| 5.4.6 体外模拟消化结果 |
| 5.4.7 毒性实验结果 |
| 5.5 本章小结 |
| 6 DAS-Man胶束的体内药代动力学研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料与仪器 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.2 实验仪器 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 HPLC法检测药物浓度 |
| 6.3.2 生物利用度测定 |
| 6.3.3 组织分布测定 |
| 6.4 实验结果与讨论 |
| 6.4.1 生物利用度测定结果 |
| 6.4.2 组织分布测定结果 |
| 6.5 本章小结 |
| 7 DAS-Man胶束对LPS致肺炎小鼠的抗炎活性评价 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 实验材料与仪器 |
| 7.2.1 实验材料 |
| 7.2.2 实验仪器 |
| 7.3 实验方法 |
| 7.3.1 LPS致小鼠肺炎模型的制备和给药 |
| 7.3.2 样品处理和含量测定 |
| 7.3.3 含量测定 |
| 7.4 实验结果与讨论 |
| 7.4.1 小鼠肝脏系数检测结果 |
| 7.4.2 小鼠脾脏系数检测结果 |
| 7.4.3 肺湿/干比检测结果 |
| 7.4.4 MPO含量测定 |
| 7.4.5 NO含量测定 |
| 7.4.6 TNF-α含量测定 |
| 7.4.7 IL-6含量测定 |
| 7.4.8 IL-1β含量测定 |
| 7.4.9 肺脏HE染色结果 |
| 7.5 本章小结 |
| 8 DAS-Man胶束对恶唑酮致结肠炎小鼠的抗炎活性评价 |
| 8.1 引言 |
| 8.2 实验材料与仪器 |
| 8.2.1 实验材料 |
| 8.2.2 实验仪器 |
| 8.3 实验方法 |
| 8.3.1 OXZ致小鼠结肠炎模型的制备和给药 |
| 8.3.2 疾病活动指数评价(DAI) |
| 8.3.3 样品处理 |
| 8.3.4 含量测定 |
| 8.4 实验结果与讨论 |
| 8.4.1 小鼠存活数量 |
| 8.4.2 小鼠DAI评分 |
| 8.4.3 小鼠结肠形态 |
| 8.4.4 小鼠肝脏系数检测结果 |
| 8.4.5 小鼠脾脏系数检测结果 |
| 8.4.6 MPO含量测定 |
| 8.4.7 NO含量测定 |
| 8.4.8 TNF-α含量测定 |
| 8.4.9 IL-4含量测定 |
| 8.4.10 IL-1β含量测定 |
| 8.4.11 结肠HE染色结果 |
| 8.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 东北林业大学 博士学位论文修改情况确认表 |
（9）鼠尾草酸抑制铁死亡减轻脊髓损伤的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 大鼠脊髓损伤模型中铁死亡表现的实验研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 鼠尾草酸抑制铁死亡减轻PC12 细胞损伤的实验研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 鼠尾草酸抑制铁死亡的分子机制研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 统计方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四部分 鼠尾草酸改善大鼠脊髓损伤的实验研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 统计方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 铁死亡在创伤性脑和脊髓损伤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简介 |
| 导师评阅表 |
（10）温针灸对脊髓损伤大鼠Shh/Gli-1信号通路影响的实验研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 外文缩略语表 |
| 引言 |
| 历史回顾 |
| 文献综述 针灸治疗脊髓损伤的临床实验研究及Shh信号通路与神经干细胞关系研究进展 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 1.4 其他实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 制备脊髓损伤大鼠模型 |
| 2.2 分组 |
| 2.3 各组处理方法 |
| 2.4 采集脊髓样本 |
| 2.5 检测指标及方法 |
| 3 统计方法 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 各组大鼠行为学观察 |
| 4.2 各组大鼠实时荧光定量PCR结果 |
| 4.3 各组大鼠Shh和Gli-1的蛋白表达情况 |
| 5 讨论 |
| 5.1 疾病选择的依据 |
| 5.2 动物模型选择的依据 |
| 5.3 治疗方法选择的依据 |
| 5.4 指标选择的依据 |
| 5.5 实验指标结果分析及评价 |
| 5.6 存在的问题和启示 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附件 BBB评分 |
| 个人简介 |
四、脊髓损伤模型制备及评价的研究进展（论文参考文献）
- [1]基于含硒纳米材料的构建及其治疗脊髓损伤的实验研究[D]. 罗文琪. 吉林大学, 2021(01)
- [2]PLGA载药微球缓释体系的研发及其在脊髓损伤修复中的应用[D]. 许月. 扬州大学, 2021(08)
- [3]负载神经干细胞和多奈哌齐的导电水凝胶系统对脊髓损伤修复作用研究[D]. 李鸿儒. 吉林大学, 2021(01)
- [4]中西医协同治疗视神经脊髓炎相关性视神经炎的应用研究[D]. 韩梦雨. 北京中医药大学, 2021(01)
- [5]巨噬细胞膜包裹脂质体靶向治疗脊髓损伤的初步研究[D]. 唐维. 西南大学, 2021(01)
- [6]ADSCs通过调控神经细胞TGF-β1/Smad/PLOD2信号通路修复脊髓损伤的机制研究[D]. 李芳. 山东大学, 2021(11)
- [7]基于NgR/RhoA/ROCK通路探究温肾通督方促进脊髓损伤修复的机制[D]. 吴承杰. 南京中医药大学, 2021(01)
- [8]穿心莲活性成分高值化加工利用应用基础研究[D]. 邓怡平. 东北林业大学, 2021(09)
- [9]鼠尾草酸抑制铁死亡减轻脊髓损伤的实验研究[D]. 程杰. 新疆医科大学, 2021(08)
- [10]温针灸对脊髓损伤大鼠Shh/Gli-1信号通路影响的实验研究[D]. 张琴. 江西中医药大学, 2020(05)