一、外源RNA对小鼠白蛋白基因表达及DNaseⅠ敏感性的影响（论文文献综述）
石超群[1]（2021）在《基于CRISPR/Cas9的猪Mx1基因编辑的研究》文中研究说明猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）是一种引起仔猪先天性震颤和多器官衰竭综合征的病毒,给养猪业带来严重的经济损失。如何降低PCV2给养猪业造成的损失变得越来越重要。近几年CRISPR/Cas9系统在遗传育种、基因治疗方面不断得到应用,利用CRISPR/Cas9系统生产具PCV2抗性猪对于猪产业具有重要意义。病毒抗性蛋白A（Mx1）是干扰素（IFN）诱导蛋白之一,该蛋白具有抗多种病毒的活性。本课题组前期的研究,莱芜猪Mx1基因启动子区在-547 bp处存在275 bp的插入,与莱芜猪对PCV2不敏感有关。该研究利用CRISPR/Cas 9和Cre-Lox P系统对PK15细胞进行了Mx1基因启动子区275bp的定点敲入,并验证了其对Mx1表达及抑制PCV2复制的能力。主要结果如下:（1）猪Mx1基因CRISPR/Cas9同源重组载体和打靶载体的构建。以PLV-m Cherry载体为骨架,依据猪Mx1基因启动子区275bp插入位点的差别设计同源臂,并引入绿色荧光蛋白和嘌呤霉素抗性基因,并在两端加入同向的Lox P序列,获得CRISPR/Cas9同源重组载体。利用Lenti CRISPR v2慢病毒载体构建出针对莱芜猪的Mx1基因启动子区的打靶载体,并通过酶切测定出了打靶载体的活性。（2）猪PK-15细胞同源重组单克隆细胞的鉴定。利用同源重组载体和打靶载体的慢病毒液感染猪PK-15细胞,通过细胞的绿色荧光的表达情况,同时利用嘌呤霉素进行筛选,挑取了12组单克隆细胞,进一步经PCR鉴定得到两个发生同源重组的单克隆细胞群。（3）标记基因的去除。通过向发绿色荧光的单克隆细胞中转染表达Cre酶的载体,在荧光显微镜下发现发光的细胞明显减少,流式细胞术分析证明绿色荧光的发光比例下降（16.3%）,证明了Cre-Lox P系统同向切割功能,并去除了细胞中的筛选抗性基因。（4）单克隆细胞Mx1的表达及对PCV2复制的抑制。对Mx1启动子区275bp插入的单克隆细胞,在接种PCV2后48h Mx1的表达水平显着升高,而PCV2的病毒拷贝数显着降低。说明猪Mx1启动子区275bp的插入具有促进Mx1表达和抑制PCV2复制的功能。
闫丽芳[2]（2021）在《无内毒素SINE RNA的制备及其影响人晶状体上皮细胞ROS的分子机理》文中提出第一部分无内毒素SINE RNA的制备目的:基因工程RNA是研究基因表达的关键工具,但使用基因工程大肠杆菌制备的RNA会受到内毒素污染的限制。因此,本研究探讨了一种从基因工程RNA中去除内毒素并保持较高RNA产量的技术方法。方法:将含有小鼠基因组短串联散布核元件（Short interspersed nuclear elements,SINE）B1元件的质粒转化BL21 DE3大肠杆菌,然后从RNA的产量、纯度、内毒素的含量以及B1 RNA的含量方面评估了四种RNA提取方法（SDS-Na Cl过滤法、SDS-Na Cl离心法、TRIzol提取法和SDS-热酚提取法）。发现这四种RNA制备方法中,SDS-Na Cl过滤法,可有效去除内毒素,并获得较高的RNA产量。因此,在SDS-Na Cl过滤法的基础上,又使用Triton X-114进一步去除内毒素。在Triton X-114去除内毒素的系统中,比较了不同浓度的乙酸钠（Na Ac）、不同浓度的磷酸缓冲液（phosphate buffer,PB）以及PB溶液的不同p H值对内毒素去除效率的影响。使用最终确定的提取方法制备RNA,进行兔热原实验,观察是否引起兔的发热。结果:本文的研究结果显示SDS-Na Cl过滤法提取的RNA中内毒素含量最低（P<0.05）,是SDS-热苯酚提取RNA中内毒素含量的1/100,是SDS-Na Cl的1/10,是TRIzol提取法的1/6。另外,SDS-Na Cl过滤法提取的基因工程RNA中纯B1 RNA的含量也较高,是TRIzol提取法的3.44倍。在SDS-Na Cl过滤法的基础上,又使用Triton X-114进一步去除内毒素,发现0.1M PB（p H 6.5）比用Na Ac作为介质去除内毒素的效率更高,RNA产量也更高。此外,本方法制备的基因工程RNA没有引起新西兰兔发热。结论:SDS-Na Cl过滤法结合Triton X-114相分离（0.1M PB,p H 6.5为介质）,可明显去除基因工程大肠杆菌SINE RNA中的内毒素,而保证较高的RNA产量,同时本方法制备的RNA内毒素量符合《中华人民共和国药典》2010年版热原检查法（兔法）的规定。第二部分Alu RNA影响人晶状体上皮细胞ROS的分子机理目的:晶状体的老化、氧化应激和晶状体蛋白修饰是诱发白内障的主要因素。Alu RNA在氧化应激时增多,体外转染靶向Alu RNA的反向寡核苷酸可预防年龄相关性黄斑变性的发生。因此,在本研究中探讨体外转染Alu RNA对白内障细胞模型的影响。丙酮醛（Methylglyoxal,MGO）处理的人晶状体上皮细胞（Human lens epithelial cells,HLECs）是研究白内障常用的细胞模型。根据本课题第一部分的研究,利用SDS-Na Cl过滤结合Triton X-114相分离（0.1M PB,p H 6.5为介质）,制备出了人源化的SINE RNA（Alu RNA）,包括Alu正义RNA（Alu RNA）和Alu反义RNA（Aluas RNA）,将这些RNA转染HLECs,研究Alu RNA以及Aluas RNA影响丙酮醛引起的HLECs中活性氧的分子机理。方法:使用磷酸钙转染法,分别用Aluas RNA、Alu RNA、t RNA（无关RNA对照）或磷酸钙转染试剂转染HLECs细胞。转染后,用不同浓度的MGO处理HLECs。收集细胞,采用细胞计数试剂盒（Cell Counting Kit–8,CCK-8）检测细胞活力;采用calcein-AM/PI双染色试剂盒检测细胞存活/死亡;采用活性氧（Reactive oxygen species,ROS）检测试剂盒检测细胞内ROS水平;逆转录实时定量PCR（RT-q PCR）检测核因子E2相关因子2（Nuclear factor erythroid 2 related factor,Nrf2）、Kelch样ECH关联蛋白1（kelch like ECH associated protein 1,Keap1）的m RNA表达,-△△CT法分析实验数据。结果:MGO随着其浓度的上升,提高了HLECs细胞的死亡率和ROS的生成量。研究的结果发现Aluas RNA与Alu RNA、t RNA和CPT试剂相比,能够减少MGO诱导的ROS水平,并降低HLECs的死亡率,同时,Aluas RNA能够增加Nrf2 m RNA表达水平,降低Keap1 m RNA的表达。结论:Aluas RNA通过激活与白内障相关的Nrf2/Keap1通路,减少MGO引起的HLECs细胞中的ROS,并减少细胞死亡。
杨爽爽,曹洪益,闫丽芳,KHAN Murad,吉宁,刘鑫,宋志学,张东明,王秀芳,吕占军[3]（2020）在《无内毒素污染的基因工程鼠源SINE RNA的制备》文中提出目的研究从大肠埃希菌宿主提取基因工程RNA同时去除内毒素的条件。方法将串联的小鼠短散布核元件（short interspersed nuclear elements,SINE）B1插入pET-28a（pET）构建pET-B1×16反序质粒（pET-B1as）,转化大肠埃希菌BL21（DE3）,获得pET-B1as-DE3菌。用TRlzol法、SDS-热酚法、SDS-NaCl离心法和SDS-NaCl过滤法从p ET-B1as-DE3菌制备基因工程RNA,Triton X-114相分离法进一步去除内毒素,检测制备的RNA中内毒素含量及RNA产量、纯度、完整性,并进行小鼠体内毒性试验和家兔热源试验。结果 TRlzol法制备的RNA产量低;SDS-热酚法制备的RNA中内毒素含量高;SDS-NaCl过滤法去除内毒素的效果优于SDS-NaCl离心法,同时具有较高的RNA产量及较好的RNA完整性。小鼠静脉注射用SDS-热酚法和SDS-NaCl过滤法制备的RNA,前者引起小鼠不良反应,后者未引起小鼠不良反应。用Triton X-114相分离能进一步去除由SDS-NaCl过滤法制备的RNA中的内毒素,家兔热源试验证明SDS-NaCl过滤法联合Triton X-114相分离法制备的RNA,其热原符合动物体内试验要求。结论建立了用SDS-NaCl过滤法联合Triton X-114相分离法制备基因工程RNA的方法,可有效去除RNA中污染的内毒素。
李硕磊[4]（2019）在《rs3091244调控CRP基因表达机制及其与癌症风险的关系》文中研究表明C-反应蛋白（C-reactive protein,CRP）是一个进化上高度保守的血浆蛋白,在人体急性期反应中CRP血浆浓度会急剧上升,在临床上通常作为非特异性炎症标识物。在众多肿瘤形成的过程中都能够发现慢性炎症是驱动肿瘤发生发展的一个重要诱因,癌症病人CRP血浆浓度相较于正常人群的1mg/L能够达到10-40mg/L。CRP是先天免疫中的重要组分并参与到炎症反应中,在肿瘤微环境中也能发现CRP明显增多,但是CRP与癌症形成发展过程之间的因果关系仍没有形成共识。已有报道发现CRP相关SNPs能够影响CRP的基线水平,但是这些SNP不能确定是否都为功能型SNPs,其中与CRP表达关联度最高的多态性位点rs3091244的T等位可以结合USF促进CRP的表达。但是rs3091244T等位在欧洲人群中为主,亚洲人群中主要是A等位。我们对人群CRP血浆浓度调查发现,A等位活性显着高于T等位,至于A等位如何影响CRP基因表达仍不清楚。我们的研究发现rs3091244能够通过Apex1的偏向性结合调控CRP表达,无论在体内还是体外都发现该Apex1更倾向于结合C/T等位而不是A等位,同时Apex1对CRP的表达主要起抑制作用,表明Apex1除了DNA损伤修复和氧化还原功能外,还具有全新的转录抑制活性。之前研究CRP基因多态性与癌症风险关系主要在欧洲人群中开展,而是否与癌症风险存在关联仍是矛盾重重。其中我们进一步证实的功能型位点rs3091244受限于三等位因素（ref C,minor A/T）难以通过taqman探针检测,因而被研究的很少,而且该位点T等位在欧洲人群占很大比例,亚洲与之相反以A等位为主。因此,我们选择功能性SNP rs3091244采用一代测序更可靠的方式检测人群多态性和taqman探针法检测两个被广泛报道的SNPs（rs1205和rs2794521）,探究在中国甘肃人群中SNPs导致的CRP浓度改变是否会影响患癌风险。甘肃地区健康人群中,rs3091244和rs1205次要等位能够显着的影响CRP水平,rs3091244的A等位能将CRP血浆水平提高29.54%±6.48%,T等位能提高26.03%±8.61%,而rs1205的A次要等位则会把CRP血浆水平降低24.94%±10.56%;rs2794521的次要等位G只能把血浆CRP水平提高6.98%。使用年龄,性别和BMI（body mass index）矫正之后得到rs3091244与整体癌症的风险比OR=0.766（95%CI:0.319-1.838）,rs1205与整体癌症的风险比OR=1.133（95%CI:0.47-2.735）,rs2794521与整体癌症的风险比OR=1.441（95%CI:0.624-3.328）。三种SNPs与整体癌症风险之间并无显着关联,即使将每种癌症单独分类出来进行风险比分析也没有发现SNPs与某种特定癌症之间存在显着性相关。似乎表明CRP难以成为癌症发生的驱动作用,但是,我们发现在癌症病人中SNPs基因型与循环系统中CRP浓度相关性明显减弱,可能主要是癌症患者炎症分子（如IL-6）显着高调有关,而这些炎症因子正是CRP转录调控的关键因素。正由于SNPs相对于炎症因子对血浆水平CRP贡献有限,故难以通过SNP判断CRP在癌症发生中的因果关系,CRP在癌症发生发展过程中的作用仍有待进一步研究。
王侃侃[5]（2018）在《基于CRISPR/Cas9的猪胚胎成纤维细胞基因组编辑及MSTN基因遗传修饰猪的制备》文中进行了进一步梳理遗传修饰猪在农业和生物医学领域发挥了重要的作用。通过遗传修饰,人们可以加速改良猪的生长性状、抗病性能和肉质品质。另一方面,遗传修饰猪可以作为人类疾病模型和异种器官移植供体,为人类健康做出贡献。CRISPR/Cas9是最新开发的一种基因组编辑工具,在gRNA的指导下,Cas9核酸内切酶在基因组特定位点产生DNA双链断裂。经过细胞自身不同的修复机制,基因组会产生多种突变模式。由于编辑效率高、构建简单等优势,CRISPR/Cas9已经成为最受欢迎的基因编辑技术,目前已成功应用于线虫、小鼠、果蝇、羊等多个物种。MSTN是转化生长因子-β超家族的成员之一,主要作用是负向调控骨骼肌的生长发育。MSTN基因缺陷小鼠出现由肌纤维增生和肥大引起的肌肉量显着增加,携带MSTN基因自然突变的牛也呈现以肌肉量增加为特征的双肌表型。这些研究表明MSTN可以作为提高猪生长表现的重要候选基因,对猪MSTN基因进行遗传修饰有望培育出高瘦肉率的新品种。本实验着重研究了CRISPR/Cas9在猪胚胎成纤维细胞中的基因编辑,以此为基础,构建了灵活高效的猪基因组编辑平台。首先,通过优化电转染参数及介质,大幅度将猪胚胎成纤维细胞（PFFs）的转染效率提升至90%,进而显着提高了Cas9/gRNA的基因编辑效率。研究发现,Cas9/gRNA可以在PFFs的MSTN位点实现多种基因编辑模式,包括单独Cas9/gRNA介导的随机插入或缺失,成对Cas9/g RNA介导的DNA片段删除或倒位突变,以及ssODN介导的同源重组修复。成对Cas9/g RNA介导的整体突变效率超过30%,显着高于单独Cas9/gRNA。随后,通过优化ssODN修复模板的转染浓度及长度,我们在PFFs中实现了高效的单碱基编辑。阿兹海默症及帕金森症的致病点突变被分别引入猪基因组APP和LRRK2位点,效率均超过10%。有趣的是,在鉴定PFFs单克隆细胞时发现了不完整的HDR现象。仅靠近Cas9切割位点的部分点突变发生了重组。通过二代测序,我们深入研究了ssODN模板中点突变的相对位置与整合效率的关系。结果显示,距离Cas9切割位点较远的点突变具有较低的整合效率。最后,我们通过有限稀释法筛选获得了携带多种MSTN基因突变类型且不含筛选标记的PFFs单克隆细胞。通过SCNT,本课题制备了多种遗传修饰猪,包括携带MSTN基因C313Y突变的大白猪,MSTN基因敲除长白猪以及二花脸猪。敲除长白猪表现出肌间沟及舌头增大等双肌表型,同时有肌纤维增生的趋势。敲除二花脸猪相比野生型克隆猪具有更明显的肌肉突起以及更宽的背部和臀部。此外,针对这些基因编辑猪,我们检测了脱靶效应及外源基因整合情况。综上所述,本研究在CRISPR/Cas9基础上对基因编辑猪制备平台进行了优化和应用,为实现更精确的育种改良和疾病模型构建奠定了基础。
尹舒贤,赵月华,刘超,吕占军,王秀芳[6]（2017）在《人源Alu RNA工程菌的构建和表达》文中研究指明目的:外源RNA导入细胞特异性上调或下调基因表达,目前外源RNA的制备方法主要有化学合成、体外转录、细胞提取。Alu DNA和Alu RNA是人基因组和转录组中最重要的成分,参与基因表达调节。建立工程菌制备基因工程人源Alu RNA（Alu RNA）的技术,所提取的RNA满足一般生物学实验要求。方法和结果:将人Alu序列插入pET-28α质粒（pET）,转化BL-21菌,探讨不同条件对Alu RNA产生的影响。用pET-Alu×8质粒转化BMBL-21（DE3）感受态细胞（简称DE3）,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导减弱细菌生长;用IPTG诱导2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h和16h,用Northern杂交检测Alu RNA的量,发现诱导4小时RNA产量最高;1、2、4、8、14拷贝的Alu序列插入pET,转化DE3菌,随拷贝数增加Alu RNA产量上升;pET-Alu×8 DE3菌液,不加IPTG诱导,没有Alu RNA产生,0.10.4mg/ml IPTG诱导时,Alu RNA产量没有区别,偏离该浓度时,RNA产量略下降;34℃、37℃和40℃培养pET-Alu×8 DE3菌液,IPTG诱导4h,在37℃培养条件下,RNA产量最高;将pET-Alu×8质粒转化3种BL-21感受态细胞,包括DE3、BMBL21-DE3-pLysS（简称pLysS）和Trans BL 21（简称TransBL）,发现转化DE3感受态细胞后Alu RNA产量最高。结论:建立了基因工程制备Alu RNA的技术:pET-Alu×14质粒转化DE3菌,37℃培养至600nm OD为1.0时,加入终浓度为0.2mg/ml的IPTG诱导4h,获得最高Alu RNA产量,纯Alu RNA在提取的RNA中的含量达15.8%,每100ml菌液纯Alu RNA产量平均为0.46mg。
宋蕾[7]（2016）在《通过RNAi制备不同AFP表达水平的大鼠肝癌细胞》文中进行了进一步梳理目的:肝癌是全球发病率第六的恶性肿瘤,每年约有70万人被诊断为肝癌。在癌症引起的死亡中30%为肝癌,近年来其病死率呈逐年上升的趋势,已经对人类健康构成了极大的威胁。肝癌是涉及多基因、多过程的复杂疾病,其致病机理仍不清楚。目前,手术切除治疗仍然是肝癌最有效的治疗方法,然而肝癌切除术或肝移植术后患者预后情况往往并不理想,其主要原因之一就是肿瘤的复发和转移。因此探讨肝癌细胞转移发生、发展的分子生物学机制对肝癌的治疗具有重要意义,也是肝癌研究的热点和难点。另外,建立与人类肝癌临床特征相近的动物模型对于研究肝癌机理寻找新的治疗方法也具有重要的现实意义。甲胎蛋白（alpha—fetoprotein,AFP）是目前已知的与肝癌关系最密切的基因之一,约70%的肝癌患者高表达AFP,AFP作为血清标记物已广泛应用于肝癌的临床诊断、治疗及预后判断。AFP主要在胎儿时期合成,出生后1-2年降至成人水平,健康成年人肝脏失去产生AFP的能力。但是,当成年人患肝癌或者肝切除时,肝脏恢复合成AFP的能力,AFP的合成量与胎儿肝脏或者肝细胞再生的分裂细胞数呈正相关,因此认为AFP是分裂增殖的肝细胞产生,靶向Afp的治疗能同时针对所有的肝癌细胞。近年研究表明,AFP在肝癌细胞的生长、分化、增殖和迁移中发挥重要作用,是肝癌进展过程中一个重要的调节因子。RNA干扰（RNA Interference）通过双链RNA在mRNA水平部分或者完全抑制特异性基因表达。RNAi在生物体内广泛存在能同时抑制多个基因,并且操作简单、特异性高、能快速使靶向基因功能抑制,为肝癌的基因治疗带来了希望。本研究采用DEN和NMOR联合诱导大鼠产生肝癌,通过组织培养、克隆,筛选出具有高、低转移潜能的大鼠肝癌细胞各1株。并以得到的高转移潜能大鼠肝癌细胞为研究对象,构建靶向Afp的shRNA并用脂质体法转染细胞,干扰其AFP表达,分析不同AFP表达水平对细胞迁移率和克隆形成能力的影响。不同AFP表达水平的细胞的获得可为制备相应的大鼠肝癌模型做准备,从而为肝癌的转移、复发机理研究及新药治疗效果评价等提供与临床相一致的动物模型。方法:无菌取诱导20周肝癌大鼠肝脏肿瘤进行原代培养,收取细胞后经Transwell筛选获得AFP高表达的高、低转移潜能的肝癌细胞株Wrh-f2和Wrh-s2,分析细胞生物学特性;将靶向AFP的4个shRNA载体及阴性载体转染AFP高表达的Wrh-f2细胞,实验分为空白对照组、阴性对照组、转染AFP-si RNA组,获得5个稳定转染细胞株。通过Real-time PCR和Western blot方法检测各组细胞Afp mRNA和AFP的表达变化,采用t检验和方差分析进行比较。选择干扰效果最好的8号细胞,检测细胞克隆形成率和迁移率。结果:1 DEN和NMOR联合诱导大鼠于20周末获得诱发性肝癌模型,肝脏有大的肿瘤块;肿块经培养、克隆获得肝癌细胞。2经Transwell筛选获得高、低转移潜能的肝癌细胞株Wrh-f2和Wrh-s2,AFP表达均为阳性。Wrh-f2细胞具有更高的迁移率和克隆形成率,有多核细胞,异常核分裂相多见,其特征与病人肝癌组织相同。经染色体核型分析发现Wrh-s2株细胞为超2倍体,众数为55;Wrh-f2细胞大部分核型为超4倍体,各细胞内部差异较大,f2众数为83。且高转移潜能细胞Wrh-f2易发生肺部转移,这与人体内的肝癌细胞特性相近。3合成针对Afp的shRNA4个分别为5、6、7、8号,另有阴性对照0号,转染Wrh-f2细胞,获得稳转细胞。Real-time PCR和Western blot定量结果显示,转染8号shRNA的细胞mRNA及蛋白表达水平均显着降低,因此选择8号细胞进行下面实验。4经检测Wrh-f2、0号、8号细胞克隆形成率分别为:（85.7±7.2）%、（59±5.8）%、（5.5±0.7）%,差异极显着;细胞迁移率结果显示Wrh-f2、0号、8号平均穿膜细胞数分别为98±12,45±15,30±10,差异显着。结论:1经Transwell筛选获得Wrh-f2和Wrh-s2细胞分别为高、低转移潜能的肝癌细胞株,AFP表达均为阳性。Wrh-f2细胞具有更高的迁移率和克隆形成率,且从形态学及染色体分析发现Wrh-f2分化水平较低,恶化程度较高,且高转移潜能细胞Wrh-f2易发生肺部转移,这与人体内的肝癌细胞特性相近。2合成的4组shRNA均可靶向抑制Afp mRNA的表达量,其中8号可同时显着抑制蛋白的表达,且干扰效果最好。经试验8号可以有效降低肝癌细胞的转移能力。
程健君[8]（2014）在《RNA序列、位置及短序列增强子突变影响报告基因表达》文中认为目的：在人和哺乳动物基因组中存在大量非编码DNA序列（non-coding DNA，ncDNA），其功能绝大部分还不清楚。研究非编码序列对基因表达调节的机制，进而探寻非编码序列新的生物学功能，对于认识人和哺乳动物的生物学行为，包括分化和衰老，有重要价值。由ncDNA转录得到的非蛋白编码RNA（non-protein coding RNA，ncRNA）数量巨大，有研究显示RNA具有活化基因的作用；本研究室以前的研究也发现外源RNA可促进小鼠白蛋白基因表达并增加该基因对DNaseⅠ消化的敏感性，另外生物信息学分析同样也证实了RNA可以活化基因。虽然已发现某些ncRNA序列具有活化基因和其它生物学效应，但大多数ncRNA序列的功能是未知的。在本项研究中，用能够产生RNA的诱导质粒（来自pcDNA3.1载体）和携带GFP基因的报告质粒（来自pEGFP-C1载体）转染HeLa细胞，研究RNA可能作为一种反式调节因子对GFP报告基因表达的影响。观察RNA的长度、序列和产生位置是否对GFP报告基因表达有不同的影响。在三个层次检测RNA产生位置对GFP报告基因表达的影响，这三个层次分别是在GFP基因下游插入序列，插入序列与GFP基因受同一启动子驱动（相当于与GFP属于同一基因）；在质粒的插入序列下游再插入CMV启动子，再于CMV启动子的下游插入不同序列（插入序列与GFP基因受不同的启动子驱动，相当于顺式邻近基因的影响）；第三个层次观察共转染的诱导质粒上的插入序列产生的RNA对报告质粒的GFP基因表达的影响（相当于位于不同染色体的基因产生的RNA的影响）。用生物信息学方法比较正在分化的淋巴细胞与静止的淋巴细胞，观察这些细胞中高表达基因内含子大小是否有差异，从而提示内含子RNA是否影响基因表达。增强子是活化基因的顺式元件，在基因表达调节中起重要作用。增强子突变会导致其功能发生改变。本研究室的前期工作发现：将14个Alu同向串联（Alu×14）后插入到pEGFP-C1质粒的GFP基因下游，构建C1-Alu×14质粒，瞬时转染HeLa细胞，Alu×14序列显着抑制GFP基因表达；再将SV40PolyA正、反序列插入到C1-Alu×14质粒的GFP和Alu×14之间，结果显示SV40PolyA序列能解除Alu×14对GFP基因的抑制作用。通过删减SV40PolyA得到一段长22bp的片段（简称22R，5＇-GTGAAAAAAATGCTTTATTTGT，结构见第二部分Fig.1），发现22R能活化基因，对22R进行点突变后获得4TMI （5＇-GTGAAATAAATGCTTTTTTTGT），发现4TMI有更强的活化基因作用。22R和4TMI均有对称结构，可能形成不稳定茎环（unstable stem-loopstructure），而22R的另一突变体4T （5＇-GTGAAAAAAATGCTTTTTTTGT）不活化基因，其序列可形成稳定的茎环，因此推测增强子活化基因能力与序列形成不稳定茎环或一定的结构有关。为了进一步探讨22R活化基因的机理，本研究对22R序列3核苷酸环（loop）的碱基进行了突变，包括野生型共128个（其中正序插入64个，反序64个），选择C1-Alu×14作为表达载体构建的基础，在Alu重复序列上游插入短序列增强子构建表达载体；然后转染HeLa细胞，通过荧光显微镜、流式细胞术、Northern杂交检测GFP表达情况，观察分析这128种序列对GFP报告基因表达的影响。所得实验结果结合生物信息学分析，探讨3碱基loop中碱基类型对基因表达影响的规律，对阐明DNA结构在基因表达调节中的作用有重要意义。不稳定茎-环结构调节基因表达可能是非编码序列的新功能。方法：1引物及模板DNA片段的合成。委托DNA合成公司合成带适当酶切位点的引物和带有不同突变位点的DNA模板。论文附表中列出了所使用的引物及模板序列及其名称。2重组报告质粒和诱导质粒的构建PCR扩增目的片段，目的片段包括质粒中的DNA序列和合成的DNA片段，酶切后插入pEGFP-C1质粒，获得插有一个片段报告质粒，利用XbaⅠ/NheⅠ酶切位点可以用T4DNA连接酶连接，但是连接以后的序列不能被其中的任何一个酶切断的特性制备同向二串联体，或多个拷贝的插入序列串联体的质粒。HindIII/Kpn I酶切pcDNA3.1，琼脂糖电泳胶分离大片段，带有串联体的报告质粒用Hind III/Kpn I酶切，胶分离插入串联体中的小片段，连接大小片段，获得正向插入串联体的诱导质粒；Kpn I/Xba I酶切pcDNA3.1，琼脂糖电泳胶分离大片段，带有串联体的报告质粒用Kpn I/Xba I酶切，胶分离插入串联体中的小片段，连接大小片段，获得反向插入串联体的诱导质粒。3细胞转染用LipofectamineTM2000瞬时转染HeLa细胞，包括报告质粒转染和报告质粒与诱导质粒共转染两种转染方法，详见论文正文。4荧光显微镜观察将重组质粒转染Hela细胞后荧光显微镜下计数GFP荧光阳性细胞数。5Northern杂交用9N随机引物和大肠杆菌DNA聚合酶大片段，将α-32P-dCTP掺入DNA中制备GFP探针。提取转染细胞总RNA，甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，将RNA转移到尼龙膜。32P标记的GFP探针杂交、冲洗后通过放射自显影记录实验结果。然后，这种杂交过的尼龙膜用剥离液处理，去除32P-GFP探针，用检测neo RNA的探针再次杂交，放射自显影作为转染效率的对照。6流式细胞分析委托河北医科大学第四医院完成。7PAGE电泳区别DNA寡核苷酸构象合成的不同DNA单链小片段（22nt，带有单碱基突变）用20%的变性胶在室温进行PAGE，银染，观察不同DNA小片段泳动速度，然后用非变性胶电泳（改变温度和离子强度），观察DNA小片段电泳速度，推测它们是否形成了不同的空间构象。8生物信息学分析从UniGene库获得基因表达数据。从UniGene库获得基因表达数据（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/lbrowse2.cgi?TAXID=9606&CUTOFF=1000）。选择高表达的基因，从人类基因组资源库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/）获得内含子和外显子数据，使用微软Excel软件对内含子的长度和数量进行统计学分析。结果：1重组诱导质粒及报告质粒构建和鉴定所有构建成功用于实验的质粒，均通过酶切和测序鉴定正确。2RNA以长度和序列依赖的方式影响基因表达诱导质粒与报告质粒共转染，发现诱导质粒以长度和序列依赖方式影响基因表达，例如诱导质粒pcAlu×14能引起报告质粒C1-Alu×8中的GFP的表达，但是诱导质粒pc280-1×14不能引起报告质粒C1-Alu×8中的GFP的表达，说明诱导质粒的插入序列不同对报告质粒的GFP基因影响不同。RNA活化GFP报告基因也具有长度依赖性，例如pcAlu×14诱导质粒引起的报告质粒的GFP基因的阳性细胞率显着高于pcAlu×1（p<0.05）。以上结果说明：诱导质粒产生RNA以序列和长度依赖的方式影响基因的表达。3RNA以位置依赖的方式活化基因为了进一步研究RNA产生的位置（与GFP同一基因及顺式临近基因）对GFP报告基因表达的影响，把目的基因分别插入到GFP基因下游及邻近部位，研究基因的重复序列是否可以激活GFP基因的表达。质粒C1-Alu×1-Alu×14比质粒C1-280-1×1-280-1×14有更强的基因抑制作用;在具有增强子4TMI时，Alu序列（C1-Alu×1-4TMI×2-Alu×14）诱导GFP基因表达比280-1（C1-280-1×1-4TMI×2-280-1×14）更强;分析下游序列对GFP基因表达的的影响与产生的RNAs（从基因本身产生的RNA影响其自身表达）有关。在C1-280-1×14载体中280-1×14的下游插入CMV，然后在CMV启动子的下游插入不同的序列，构建质粒（相当于改变GFP基因相邻基因的序列）。结果表明，质粒C1-280-1×14-CMV-280-1×2中CMV下游插入的2个280-1正和Alu-280-1正比其他序列有活化GFP报告基因作用。插入含有两个相同序列的诱导质粒对C1-280-1×14中的GFP基因表达没有显着影响（数据见论文第一部分）。同一基因和临近基因序列对GFP报告基因产生明显影响，但是诱导质粒中的同样序列产生影响较弱。这些结果说明， RNA产生的位置是影响报告基因表达的因素。当这些重复序列分别插入pcDNA3.1载体中构造诱导质粒与相应报告质粒进行共转染时，他们没有激活报告基因，这些结果表明，RNA序列和RNA产生位置是影响基因表达的重要因素。4在分化细胞中大基因高表达通过生物信息学分析比较胸腺细胞和T细胞，生发中心B细胞和B细胞中高表达基因中大基因（≥60000bp）的数量，比较高表达基因中内含子的大小，发现在未分化细胞中大基因数量多，平均每个内含子的碱基多。522R序列loop3碱基突变体（正序）对GFP报告基因表达的影响22R序列（5＇-GTGAAAAAAATGCTTTATTTGT）及其loop3碱基的突变体（正序）分别插入到C1-Alu×14载体的Alu序列上游，构建表达载体，转染HeLa细胞。流式细胞仪检测结果和荧光显微镜分析及Northern Blot均表明，loop环3碱基突变可明显影响增强子的活性。例如：GTG质粒（5＇-GTGAAAAAAAGTGTTTATTTGT）荧光阳性率为3.77%，AAA质粒（5＇-GTGAAAAAAAAAATTTATTTGT）荧光阳性率为0.24%。622R序列loop3碱基突变体反序列对GFP报告基因表达的影响将两拷贝的22R序列loop3碱基突变体反序构建表达载体，转染HeLa细胞，用流式细胞仪检测GFP阳性细胞，22R突变体反序大部分的荧光阳性百分数和平均荧光强度高于其正序，如：CTG正序百分数为43.23，平均荧光强度为6.5，反序百分数为65.06，平均荧光强度为25.2荧光强度平均数的比值（反序/正序）为3.88；AGG正序百分数为52.85，平均荧光强度为11.9，反序百分数为60.75，平均荧光强度为25.4，荧光强度平均数的比值（反序/正序）为2.84；仅有一个例外，AGC正序百分数为67.17，平均荧光强度为18.8，反序百分数为60.75，平均荧光强度为25.4，荧光强度平均数的比值（反序/正序）为1.35，说明突变体的反序活化基因作用强于其正序。7PAGE电泳区别DNA寡核苷酸构象用20%的变性胶在室温进行PAGE，发现所有的寡核苷酸的电泳迁移率基本相同。而在低温和增大离子强度时富含T碱基的序列迁移率受影响较小，所以用富含T的序列作为分子量对照，在室温，1×TBE缓冲液中电泳，TAA、TAT、TAC、TAG和CTA序列的泳动速度最快，而其他序列的迁移率相当。在更低温度（4℃）下1×TBE缓冲液中进行电泳，虽然不同序列的迁移率有更大的差别，但是TAA、TAT、TAC、TAG和CTA序列的泳动速度还是最快的。这些结果说明loop位碱基影响序列的次级结构，可能涉及到增强子活性。结论：1RNA以长度和序列依赖的方式特异性影响基因表达，诱导质粒的插入序列和长度不同对报告质粒的GFP基因影响不同。2RNA产生位置显着影响基因表达，同一基因和临近基因序列对GFP报告基因产生明显影响，但是诱导质粒中的同样序列产生影响较弱。322R Loop的碱基类型影响序列的次级结构，显着影响增强子活性。422R突变体正反序对GFP基因表达的影响不同，反序大部分的荧光阳性百分数和平均荧光强度高于其正序。5PAGE电泳显示，22R及其突变体单链在低温和非变性胶条件下可以形成次级结构。6生物信息学表明正在分化和分裂的细胞大基因高表达，提示产生更多的内含子RNA。
韩雪洁[9]（2013）在《猪体细胞转人凝血因子IX和hfat-1基因的研究》文中研究说明猪在解剖学,神经生物学、心脏血管、胃肠道和基因组方面与人相似,因此在研究人类疾病时,猪被认为是更好的动物模型,还可作为异种器官移植的供体。由于异种器官移植的深入研究,又将转基因猪的研究推向一个新的高峰。本研究构建两种表达载体,并转染细胞,获得转基因细胞,为生产转基因克隆猪做准备。1、人凝血因子Ⅸ基因和hfat-1基因表达载体的构建（1）从人胎儿肝脏中提取RNA并扩增出人凝血因子Ⅸ （human coagulation factor Ⅸ, hFIX） cDNA序列,同时,PCR扩增出牛生长激素（BGH）polyA序列,将hFIX的cDNA序列与BGH polyA序列分别连接到表达载体pbCSN2-RC的牛酪蛋白（CSN2）启动子之后,构建带有新霉素抗性和红色荧光蛋白双筛选标记的乳腺特异性表达载体pbCSN2-hFIX-pA-RC。（2）改造pCAGDNA3,在Mlu Ⅰ后面,CAGG启动子前端添加Pac Ⅰ、Fse Ⅰ和SfiⅠ三个酶切位点,扩增LoxP-pGK-neo-BGHpA-LoxP并连入pCAGDNA3-CAGG骨架,将人源化的hfat-1基因连入骨架载体构成pC-PGK-neo-hfat-1表达载体。2、猪乳腺上皮细胞和猪胎儿成纤维细胞的分离培养（1）组织块种植法培养猪乳腺细胞,并通过控时消化、分离纯化得到猪乳腺上皮细胞。通过形态观察、免疫荧光染色、染色体数目分析,确定获得了纯化的猪乳腺上皮细胞。（2）用胶原酶消化法获得猪胎儿成纤维细胞,所获得的胎儿成纤维细胞具有正常的染色体数目。同时,对猪胎儿成纤维细胞的性别也通过SRY基因PCR方法进行了鉴定。3、转染细胞（1）脂质体法将表达载体pbCSN2-hFIX-pA-RC以相同的条件分别导入猪乳腺上皮细胞和雌性猪胎儿成纤维细胞,结果发现：在两种细胞中的转染效率没有明显差异,线性化质粒为600ng,脂质体为3uL时的条件为最优条件。（2）电穿孔法将pC-PGK-neo-hfat-1表达载体导入猪胎儿成纤维细胞中,经DNA. RNA水平的鉴定后,Cre重组酶特异识别Loxp位点,将两个Loxp位点之间的PGK-neo片段删除,用Puromycin筛选,获得hfat-1-neo-阳性细胞。4、转基因细胞的鉴定（1）经实时定量RT-PCR鉴定,hFⅨ在乳腺上皮细胞和猪胎儿成纤维细胞中均有表达,hFⅨ的表达量在乳腺上皮细胞中显着高于成纤维细胞。（2）经实时定量RT-PCR鉴定hfat-1-neo+、hfat-1-neo-转基因细胞,结果表明未经Cre处理的转hfat-1细胞的表达量明显高于Cre处理的细胞。高效气相色谱分析显示：与野生型细胞相比n-6/n-3的比值在转基因细胞中显着降低,Cre处理过的转hfat-1的细胞降低的更明显。
陈建文[10]（2012）在《利用RNA干扰和乳腺生物反应器生产抗腹泻病转基因猪育种新材料的研究》文中提出仔猪腹泻是养猪业中常见的疾病，给世界养猪业造成了极大地经济损失。传统预防和治疗猪腹泻的方法如改善环境、服食抗菌素和免疫接种等缺点日渐明显，存在很多风险和问题，因此，迫切需要我们用新的方法和手段来有效控制这种疾病的发生。随着分子生物学技术的快速发展，通过转基因操作改良性状的生物育种方法，直接针对育种目标，目的性强、周期短，直接跨越基因互作的消极影响，可以同时改良多个重要经济性状，这是一种新的富有生命力的疾病控制方法，具有传统的免疫学方法控制疾病所无法比拟的优势。因此，利用转基因技术开展猪抗病育种研究，开发出具有自主知识产权和抗腹泻病转基因猪抗病新品种，提高疾病控制水平，有效控制这种疾病，意义重大。本研究主要从两个方面入手创制转基因抗病育种新材料：一是通过RNAi技术，培育特殊抗病力（ETEC F18）的转基因猪生物育种新材料；二是通过乳腺生物反应器模型培育一般抗病力抗病转基因猪生物育种新材料。主要结果如下：1.通过RNAi技术培育转基因猪育种新材料的工作如下：1)建立了一种基于Cre-LoxP的多启动子介导多个shRNA的方法，获得了干扰FUT1的转基因囊胚；2)建立了一种由慢病毒介导shRNA的方法，获得了7头转基因猪，并从其相关免疫学指标及小肠粘附抑制等生物学功能进行了抗病性研究；3)利用2)中获得的慢病毒感染猪小肠上皮细胞（IPEC-J2），结果显示RNA干扰前后F18大肠杆菌对小肠上皮细胞的粘附能力无显着差异，结合国内外研究，证明了FUT1不是F18大肠杆菌致病的主要受体基因；2.通过乳腺生物反应器模型培育转基因猪育种新材料的工作如下：1)为探讨转pBD-1基因小鼠在疾病方面的抗病作用，利用小鼠可以在SPF这一环境下饲养的这一优势，开展pBD-1在动物水平群体抗病性及上的功能研究，建立了一种猪防御素-1（pBD-1）转基因小鼠模型，为建立大动物抗病育种模型奠定了基础；2)为了评估表达载体设计的合理性和高效性，为进一步开展利用乳腺生物反应器模型培育一般抗病力的生物新品种奠定基础，建立了一种乳腺生物反应器载体验证的细胞模型，同时通过细胞模型预测转基因成体动物相关免疫应答通路奠定了基础及建立了研究模型；3)建立了转人溶菌酶的转基因细胞系，并进行移植，获得了9头胎儿；4)建立了转pBD-1的转基因细胞系，并进行移植，获得了转基因囊胚。本研究的创新点：首次建立了一种由4启动子介导4个shRNA的全部筛选标记可去除的表达载体，并首次获得了干扰FUT1的转基因囊胚；首次通过体细胞核移植获得了慢病毒介导的RNA干扰的大动物模型；首次在细胞学水平上证明了FUT1不是导致仔猪腹泻与水肿病的主效受体基因；首次利用细胞模型对猪防御素进行了研究，初步建立了一种乳腺生物反应器的细胞模型；首次获得了转pBD-1的转基因小鼠与转基因猪囊胚。
二、外源RNA对小鼠白蛋白基因表达及DNaseⅠ敏感性的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、外源RNA对小鼠白蛋白基因表达及DNaseⅠ敏感性的影响（论文提纲范文）
（1）基于CRISPR/Cas9的猪Mx1基因编辑的研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1.1 CRISPR/Cas9 系统的研究进展 |
| 1.1.1 CRISPR/Cas系统的研究历史 |
| 1.1.2 CRISPR/Cas系统的机构和分类 |
| 1.1.3 CRISPR/Cas的作用机制 |
| 1.1.4 CRISPR/Cas9 系统的应用 |
| 1.2 猪圆环病毒 |
| 1.2.1 猪圆环病毒的发现 |
| 1.2.2 猪圆环病毒的研究进展 |
| 1.2.3 猪感染PCV2 后的临床症状 |
| 1.2.4 PCV2 的基因型 |
| 1.2.5 PCV2 的致病机理和传播特点 |
| 1.2.6 不同品种的猪感染PVC2 之后的差别 |
| 1.3 Mx1 基因研究进展 |
| 1.3.1 Mx1 的基本信息 |
| 1.3.2 猪Mx1 基因抗病能力的研究 |
| 1.4 Cre-LoxP系统的研究进展 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株和载体 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要试剂和来源 |
| 2.1.4 常用试剂的配制 |
| 2.1.5 主要数据库和生物学软件 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 同源重组载体的构建 |
| 2.2.2 CRISPR/Cas9 靶向载体的构建 |
| 2.2.3 同源重组载体和靶向载体的共转染 |
| 2.2.4 表达Cre酶载体对单克隆细胞的处理 |
| 2.2.5 单克隆细胞的抗病毒能力的处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 同源重组载体的构建 |
| 3.1.1 同源臂扩增 |
| 3.1.2 骨架载体的酶切 |
| 3.1.3 多克隆位点MCS的设计 |
| 3.1.4 筛选标记基因的扩增 |
| 3.1.5 同源重组载体包装慢病毒 |
| 3.1.6 荧光计数法测定的同源重组载体的慢病毒滴度 |
| 3.2 Lenti CRISPR-v2 靶向载体的构建 |
| 3.2.1 Lenti CRISPR-v2 酶切 |
| 3.2.2 sgRNA活性的鉴定 |
| 3.3 同源重组载体和靶向载体共转染 |
| 3.3.1 单克隆细胞的筛选 |
| 3.3.2 单克隆细胞的鉴定 |
| 3.3.3 表达Cre酶的载体处理 |
| 3.4 抗病毒能力的验证 |
| 3.4.1 接种病毒后Mx1 蛋白的表达 |
| 3.4.2 PCV2 病毒的拷贝数测定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 CRISPR/Cas9 系统存在的脱靶效应 |
| 4.2 CRISPR/Cas9 系统的递送形式 |
| 4.3 Mx1 的抗病毒效应 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 致谢 |
（2）无内毒素SINE RNA的制备及其影响人晶状体上皮细胞ROS的分子机理（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 无内毒素SINE RNA的制备 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 Alu RNA影响人晶状体上皮细胞ROS的分子机理 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 年龄相关性白内障的发生机制与新研究方向 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）无内毒素污染的基因工程鼠源SINE RNA的制备（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒、菌株及细胞 |
| 1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 p ET-B1as质粒的构建 |
| 1.5 p ET-B1as质粒的诱导表达 |
| 1.6 RNA制备 |
| 1.6.1 SDS-Na Cl过滤法（以下简称过滤法） |
| 1.6.2 SDS-Na Cl离心法（以下简称离心法） |
| 1.6.3 SDS-热酚法 |
| 1.6.4 TRlzol法 |
| 1.7 RNA中内毒素含量检测 |
| 1.8 RNA纯度检测 |
| 1.9 RNA产量及完整性检测 |
| 1.1 0 B1as RNA产量的检测 |
| 1.1 1 内毒素的进一步去除 |
| 1.1 2 小鼠体内毒性试验 |
| 1.1 3 家兔热原试验 |
| 1.1 4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 p ET-B1as质粒的鉴定 |
| 2.2 不同RNA提取方法对制备的RNA内毒素含量及纯度的影响 |
| 2.3 离心法和过滤法对制备的RNA内毒素含量及纯度的影响 |
| 2.4 过滤法中Na Cl浓度对制备的RNA内毒素含量及产量的影响 |
| 2.5 不同保护剂对RNA质量的影响 |
| 2.6 不同方法制备的总RNA和B1as RNA产量 |
| 2.7 Triton X-114相分离法进一步去除内毒素 |
| 2.8 小鼠体内毒性试验 |
| 2.9 家兔热原试验 |
| 3 讨论 |
（4）rs3091244调控CRP基因表达机制及其与癌症风险的关系（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 CRP(C-reactive protein)C反应蛋白 |
| 1.1.1 CRP的结构 |
| 1.1.2 炎症反应中的CRP |
| 1.2 CRP与疾病 |
| 1.2.1 CRP与心血管疾病 |
| 1.2.2 CRP血浆水平与癌症 |
| 1.3 CRP基因调控 |
| 1.3.1 CRP调控中的细胞因子和转录因子 |
| 1.3.2 CRP转录后调控 |
| 1.3.3 CRP调控中的表观修饰 |
| 1.3.4 增强子对CRP的调控 |
| 1.4 SNP与 C反应蛋白 |
| 1.4.1 SNP概述 |
| 1.4.2 SNP与特定疾病或性状的相关性分析 |
| 1.4.3 CRP表达相关SNP |
| 1.4.4 CRP基因多态性与CRP血浆水平差异相关 |
| 1.4.5 CRP基因多态性与疾病状态 |
| 1.4.6 CRP基因相关SNPs与癌症风险 |
| 1.5 本论文研究的目的及意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞和血液样品 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验药品和试剂 |
| 2.2 荧光素酶报告基因实验方法 |
| 2.2.1 超级感受态细胞的制备 |
| 2.2.2 构建载体 |
| 2.2.3 提取质粒 |
| 2.2.4 Hep3B细胞的复苏与扩大培养 |
| 2.2.5 Hep3B细胞的冻存 |
| 2.2.6 Hep3B细胞铺板与转染 |
| 2.2.7 荧光素酶报告基因试验 |
| 2.3 血液样品基本信息的调取 |
| 2.4 血液样品DNA提取与测序 |
| 2.4.1 血液样品总DNA的提取 |
| 2.4.2 血液样品SNP位点基因型测序 |
| 2.5 血液样品CRP含量测定 |
| 2.6 核酸-蛋白互作实验 |
| 2.6.1 细胞和蛋白的提取 |
| 2.6.2 BCA法测量蛋白浓度 |
| 2.6.3 探针制备 |
| 2.6.4 核酸-蛋白pull-down实验 |
| 2.6.5 考马斯亮蓝染色/银染实验 |
| 2.6.6 目的条带的胶内酶解与质谱分析 |
| 2.7 Apex1 作为转录因子的鉴定 |
| 2.7.1 WB定性定量鉴定pull-down产物 |
| 2.7.2 WEMSA试验 |
| 2.7.3 Apex1 高表达/敲低实验 |
| 2.7.4 Apex1 功能结构域突变试验 |
| 2.7.5 ChIP试验验证Apex1 在体内与rs3091244 不同等位亲和性 |
| 2.7.6 Co-IP试验 |
| 2.8 SNP与癌症风险分析 |
| 2.8.1 血浆水平CRP相关SNPs的连锁不平衡(LD)分析 |
| 2.8.2 CRP基因多样性与癌症风险的meta-analysis |
| 2.8.3 数据分析 |
| 第三章 结果与结论 |
| 3.1 CRP表达相关SNPs |
| 3.2 不同SNPs次要等位对CRP血浆水平贡献不同 |
| 3.2.1 甘肃地区人群等位频率与亚洲人群等位频率相同 |
| 3.2.2 rs3091244 等位频率在全球的分布情况 |
| 3.2.3 血浆CRP相关SNPs能够影响CRP血浆水平 |
| 3.2.4 多态性基因次要等位对CRP血浆水平影响较大 |
| 3.2.5 SNPs不同基因型对血浆CRP水平影响程度不同 |
| 3.2.6 SNPs不同基因型组合对CRP血浆水平影响差异较大 |
| 3.3 转录因子Apex1 能够影响CRP的表达调控 |
| 3.3.1 rs3091244 次要等位转录活性不同 |
| 3.3.2 转录因子Apex1 的发现 |
| 3.3.3 Apex1 高表达/敲低影响CRP表达水平 |
| 3.3.4 Apex1 能够影响rs3091244 不同等位转录活性 |
| 3.3.5 Apex1 发挥转录因子作用并不依赖其氧化还原结构域、内切酶结构域以及AP位点识别结构域 |
| 3.4 Apex1 通过对rs3091244 结合偏向性影响CRP表达 |
| 3.4.1 体外实验证明Apex1对rs3091244 三种等位结合具有偏向性 |
| 3.4.2 在体条件下Apex1对rs3091244 三种等位亲和力不同 |
| 3.5 Apex1 发挥负调控因子作用不依赖其他转录因子 |
| 3.6 癌症病人血浆CRP水平与SNPs基因型关系 |
| 3.6.1 癌症病人血浆CRP水平升高 |
| 3.6.2 癌症病人血浆CRP水平与SNPs基因型关联减弱 |
| 3.7 CRP相关SNPs与总体癌症发病风险无关 |
| 3.8 CRP相关SNPs与特定类型癌症发病风险无关 |
| 3.9 Meta-analysis证实SNPs与癌症风险无关 |
| 3.10 讨论与主要结论 |
| 参考文献 |
| 在学期间研究成果 |
| 致谢 |
（5）基于CRISPR/Cas9的猪胚胎成纤维细胞基因组编辑及MSTN基因遗传修饰猪的制备（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 转基因技术研究进展 |
| 1.1 受精卵原核注射 |
| 1.2 精子载体法 |
| 1.3 病毒介导的转基因技术 |
| 1.4 体细胞核移植技术 |
| 第2章 基因编辑研究进展 |
| 2.1 锌指核酸酶 |
| 2.2 类转录激活因子效应物核酸酶 |
| 2.3 CRISPR/Cas |
| 2.4 基因编辑猪的应用 |
| 第3章 MSTN研究进展 |
| 3.1 MSTN的结构与表达 |
| 3.2 MSTN的调控 |
| 3.3 MSTN的相关信号通路 |
| 3.4 MSTN的功能 |
| 3.5 MSTN在畜牧中的应用 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 基于CRISPR/Cas9的猪基因组编辑平台 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 基于CRISPR/Cas9的精确基因编辑 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 MSTN基因遗传修饰猪的制备 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（6）人源Alu RNA工程菌的构建和表达（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂和耗材 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 p ET-Alu质粒构建 |
| 1.2.2 BL-21转化及IPTG诱导 |
| 1.2.3 Alu RNA制备 |
| 1.2.4 Northern检测Alu RNA |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 表达载体构建及酶切鉴定 |
| 2.2 IPTG诱导和不诱导细菌生长曲线 |
| 2.3 IPTG诱导时间的作用 |
| 2.4 IPTG浓度对RNA产量的影响 |
| 2.5 插入Alu拷贝数的作用 |
| 2.6 工程菌的培养温度对RNA产量的影响 |
| 2.7 宿主菌类型对RNA产量的影响 |
| 2.8 DNA酶和RNA酶消化Alu RNA |
| 2.9 Alu RNA产量的估算 |
| 3 讨论 |
（7）通过RNAi制备不同AFP表达水平的大鼠肝癌细胞（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 RNAi技术在肝癌治疗中的应用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）RNA序列、位置及短序列增强子突变影响报告基因表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 RNA 以长度、位置和序列依赖的方式特异性影响基因表达 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 22R 增强子 3 核苷酸 loop 单碱基突变对 GFP 报告基因表达的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 22R 反序重组表达载体的构建及其对 GFP 报告基因表达的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述一 染色质相关的非编码 RNA 及其作用 |
| 参考文献 |
| 综述二 RNA 调节基因表达影响衰老分化 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）猪体细胞转人凝血因子IX和hfat-1基因的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一部分 实验部分 |
| 第一章 人凝血因子Ⅸ乳腺特异表达载体的构建及细胞转染 |
| 1 材料 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 从人胎儿肝组织中分离扩增人凝血因子ⅨcDNA序列 |
| 2.2 hFⅨ乳腺特异表达载体的构建 |
| 2.3 猪乳腺上皮细胞的分离培养、染色体数目分析及免疫荧光染色 |
| 2.4 G418筛选猪乳腺上皮细胞 |
| 2.5 猪胎儿成纤维细胞的制备及染色体数目分析 |
| 2.6 猪胎儿成纤维细胞SRY基因的鉴定 |
| 2.7 6418筛选猪胎儿成纤维细胞 |
| 2.8 猪乳腺上皮细胞和猪胎儿成纤维细胞转染和鉴定 |
| 2.9 实时定量RT-PCR检测hFⅨ的表达情况 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCR扩增hFⅨ |
| 3.2 BGH PolyA的PCR扩增 |
| 3.3 BGH PolyA插入乳腺特异表达载体pbCSN2-RC |
| 3.4 hFⅨ插入pbCSN2-BGHpA-RC及其插入方向的确定 |
| 3.5 猪乳腺上皮细胞的分离 |
| 3.6 猪乳腺上皮细胞的免疫荧光染色结果 |
| 3.7 猪乳腺上皮细胞染色体数目分析 |
| 3.8 猪乳腺上皮细胞对G418的敏感性 |
| 3.9 在猪乳腺上皮细胞中不同比例的线性化质粒和脂质体组合的转染效率 |
| 3.10 猪胎儿成纤维细胞染色体数目分析 |
| 3.11 猪胎儿成纤维细胞SRY基因的鉴定 |
| 3.12 猪胎儿成纤维细胞对G418的敏感性 |
| 3.13 在猪胎儿成纤维细胞中不同比例的线性化质粒和脂质体组合的转染效率 |
| 3.14 实时定量PCR结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 附图：人凝血因子Ⅸ表达载体pbCSN2-hFⅨ-pA构建流程图 |
| 第二章 hfat-1表达载体的构建及细胞转染 |
| 1 材料 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 改造pCAGDNA3 |
| 2.2 构建pC-PGK-neo-pA |
| 2.3 合成人源化序列hfat1 |
| 2.4 构建pC-PGK-neo-hfat-1 |
| 2.5 载体pC-PGK-neo-hfat-1的大量制备 |
| 2.6 载体pC-PGK-neo-hfat-1的线性化 |
| 2.7 电穿孔法转染猪胎儿成纤维细胞 |
| 2.8 筛选稳定的转基因细胞 |
| 2.9 鉴定转基因的猪胎儿成纤维细胞 |
| 2.10 Cre重组酶将两个Loxp之间的DNA片段删除 |
| 2.11 实时定量RT-PCR检测hfat-1的表达情况 |
| 2.12 高效气相色谱分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 pCAGDNA3-CAGG菌落PCR及其酶切鉴定 |
| 3.2 pC-PGK-neo-pA菌落PCR及其酶切鉴定 |
| 3.3 pC-PGK-neo-hfat-1菌落PCR及其酶切鉴定 |
| 3.4 鉴定转基因的猪胎儿成纤维细胞 |
| 3.5 PCR鉴定：Cre重组酶将两个Loxp之间的DNA片段删除 |
| 3.6 实时定量PCR结果 |
| 3.7 高效气相色谱分析 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 附图：hfat-1表达载体pC-PGK-neo-hfat-1构建流程图 |
| 结论 |
| 第二部分 文献综述 转基因猪的研究进展和应用 |
| 转基因猪的研究进展 |
| 1、原核显微注射技术及在转基因猪中的应用 |
| 2、体细胞核移植技术及在转基因猪中的应用 |
| 3、胚胎干细胞介导技术及在转基因猪中的应用 |
| 4、逆转录病毒载体转染技术及在转基因猪中的应用 |
| 5、RNA干扰介导转基因技术及在转基因猪中的应用 |
| 6、精子载体技术及在转基因猪中的应用 |
| 转基因猪的应用 |
| 1、转基因育种 |
| 2、异种器官移植的供体 |
| 3、作为乳腺生物反应器 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
（10）利用RNA干扰和乳腺生物反应器生产抗腹泻病转基因猪育种新材料的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 插图（表）清单 |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 1 猪腹泻与水肿病概况 |
| 1.1 猪腹泻与水肿病现状 |
| 1.2 猪腹泻与水肿病病原学基础 |
| 1.2.1 肠毒素大肠杆菌 |
| 1.2.2 猪流行性腹泻病毒 |
| 1.3 猪腹泻与水肿病的免疫学与营养学调控基础 |
| 1.4 主要抗性与功能基因 |
| 1.4.1 ETEC 受体基因 |
| 1.4.2 抗菌肽基因 |
| 1.4.3 人溶菌酶基因 |
| 2 RNA 干扰技术与转基因育种研究概况 |
| 2.1 RNA 干扰技术的发现 |
| 2.2 RNA 干扰技术在畜禽哺乳类动物中的应用 |
| 2.2.1 RNAi 在口蹄疫中的应用 |
| 2.2.2 RNAi 在阮病毒中的应用 |
| 2.2.3 RNAi 在抗流感中的应用 |
| 2.2.4 RNAi 在其他疾病中的应用 |
| 2.2.5 RNAi 在肉质改良中的的应用 |
| 3 转基因猪研究概况 |
| 4 研究的目的和意义 |
| 第一章 利用 RNA 干扰技术生产抗仔猪腹泻与水肿病转基因猪育种新材料的研究 |
| 引言 |
| 第一节 利用 CRE-LOXP 介导的多启动子 RNA 干扰猪 FUT1 基因生产转基因克隆猪胚胎 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验仪器及耗材 |
| 1.2 细胞与载体 |
| 1.3 溶液配制与试剂 |
| 1.4 引物合成和 DNA 测序 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 FUT1 基因多启动子 RNAi 干扰载体的构建 |
| 2.1.1 FUT1 基因 RNAi 干扰载体靶点设计、合成和构建 |
| 2.1.2 表达载体的线性化 |
| 2.1.3 pGenesil1.1，pGenesil1.2，pGenesil1.3，pGenesil1.4 表达载体的构建 |
| 2.1.4 FUT1 基因多启动子 RNAi 干扰载体的构建 |
| 2.2 Cre-LoxP 介导的 FUT1 基因多启动子 RNAi 干扰载体的构建 |
| 2.2.1 MCS-3s-LoxP-GFP 多功能全标记去除骨架载体的构建 |
| 2.2.2 Cre-LoxP 介导的 FUT1 基因多启动子 RNAi 干扰载体的构建 |
| 2.3 猪胎儿成纤维细胞培养和转基因稳定细胞系的建立 |
| 2.3.1 猪胎儿成纤维细胞系的建立(组织块法) |
| 2.3.2 猪胎儿成纤维转基因细胞系的建立 |
| 2.3.3 猪胎儿成纤维细胞转基因细胞系目的基因整合检测 |
| 2.3.4 Real-time PCR 对转基因稳定细胞系的检测 |
| 2.4 卵母细胞的体外成熟 |
| 2.5 体细胞核移植显微操作 |
| 2.6 重构卵的融合与激活 |
| 2.7 转基因胚胎的鉴定 |
| 2.8 统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 FUT1 基因多启动子 RNAi 干扰载体的构建 |
| 3.2 Cre-LoxP 介导的 FUT1 基因多启动子 RNAi 干扰载体的构建 |
| 3.3 猪胎儿成纤维转基因细胞系的建立与鉴定 |
| 3.4 转基因克隆胚的构建与鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于 RNAi 研究策略 |
| 4.2 关于转基因动物生物安全 |
| 5 小结 |
| 第二节 慢病毒介导的 RNA 干扰猪 FUT1 基因生产转基因克隆猪 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验仪器及耗材 |
| 1.2 细胞、载体与菌株 |
| 1.3 溶液配制与试剂 |
| 1.4 引物合成和 DNA 测序 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 FUT1 基因 RNAi 干扰载体靶点设计、合成和构建 |
| 2.1.1 siRNA 的设计 |
| 2.1.2 双链 Oligo（ds oligo）的制备 |
| 2.1.3 FUT1 基因 RNAi 干扰载体的构建 |
| 2.2 FUT1 基因过表达载体的构建 |
| 2.2.1 FUT1 基因的克隆 |
| 2.2.2 pEGFP-N1-FUT1 表达载体的构建 |
| 2.3 RNA 干扰有效靶点筛选 |
| 2.3.1 RNA 干扰有效靶点 mRNA 水平的筛选 |
| 2.3.2 RNA 干扰有效靶点蛋白水平的验证 |
| 2.4 RNA 干扰有效靶点慢病毒表达载体的构建 |
| 2.4.1 miR-3 靶点慢病毒载体的构建 |
| 2.4.2 miR-1 靶点慢病毒载体的构建 |
| 2.5 慢病毒包装和病毒滴度的测定 |
| 2.5.1 慢病毒包装 |
| 2.5.2 慢病毒滴度测定 |
| 2.6 猪胎儿成纤维细胞培养和药物（Blasticidin）致死曲线的摸索 |
| 2.7 猪胎儿成纤维细胞转基因细胞系的建立 |
| 2.8 转基因细胞系整合与干扰效率检测 |
| 2.9 转基因细胞系相关通路基因检测 |
| 2.10 ELISA 检测转基因细胞上清液中干扰素和细胞因子应答反应 |
| 2.11 卵母细胞的体外成熟 |
| 2.12 体细胞核移植显微操作 |
| 2.13 重构卵的融合与激活 |
| 2.14 转基因核移植胚胎体外发育研究 |
| 2.15 转基因核移植胚胎移植和妊娠检测 |
| 2.16 转基因克隆猪的产生及鉴定 |
| 2.17 转基因克隆猪耳缘成纤维细胞系的建立 |
| 2.18 转基因猪相关基因组织表达谱检测 |
| 2.19 转基因猪生理生化指标检测 |
| 2.20 转基因猪相关免疫学指标检测 |
| 2.21 转基因猪小肠上皮细胞体外黏附抑制 |
| 2.22 猪小肠上皮细胞 IPEC-J2 转基因细胞系的建立 |
| 2.23 猪小肠上皮细胞 IPEC-J2 转基因黏附检测 |
| 2.24 统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 FUT1 基因 RNAi 干扰载体和过表达载体的构建 |
| 3.2 RNA 干扰有效靶点 mRNA 水平的筛选 |
| 3.2.1 RNA 干扰有效靶点 mRNA 水平的筛选 |
| 3.2.2 RNA 干扰有效靶点 mRNA 水平的筛选 |
| 3.3 RNA 干扰有效靶点慢病毒的包转及病毒滴度测定 |
| 3.4 猪胎儿成纤维转基因细胞系的建立 |
| 3.5 转基因细胞整合鉴定 |
| 3.6 猪胎儿成纤维转基因细胞干扰效率及凋亡基因检测 |
| 3.7 猪胎儿成纤维转基因细胞相关通路基因表达检测 |
| 3.8 猪胎儿成纤维转基因细胞上清液细胞因子及干扰素应答检测 |
| 3.9 转基因克隆胚胎体外发育 |
| 3.10 转基因克隆胚胎胚胎移植和产生 |
| 3.11 转基因克隆猪的鉴定 |
| 3.12 克隆猪耳成纤维细胞建系 |
| 3.14 转基因猪相关生理生化指标检测 |
| 3.15 转基因猪相关免疫学指标检测 |
| 3.16 转基因猪相关基因组织表达谱检测 |
| 3.17 转基因克隆猪小肠组织黏附实验 |
| 3.18 猪小肠上皮细胞 IPEC-J2 转基因细胞系的建立 |
| 3.19 猪小肠上皮细胞 IPEC-J2 转基因细胞系黏附实验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 RNAi 研究策略的选取 |
| 4.1.1 有效靶点筛选策略 |
| 4.1.2 RNAi 对照组的选取 |
| 4.1.3 RNAi 效应的检测 |
| 4.1.4 RNAi 系统的选择 |
| 4.1.5 RNAi 中细胞来源的选择 |
| 4.2 转基因细胞系质量评价 |
| 4.3 核移植程序改进 |
| 4.4 转基因克隆胚胎体外发育研究 |
| 4.5 转基因猪抗病验证 |
| 4.5.1 转基因猪免疫指标检测 |
| 4.5.2 重组菌与仔猪小肠上皮细胞的体外黏附抑制试验 |
| 4.6 F18 受体鉴定 |
| 5 小结 |
| 第二章 利用乳腺组织特异性表达技术生产抗仔猪腹泻与水肿病转基因猪育种新材料的研究 |
| 引言 |
| 第三节 乳腺特异性表达猪防御素转基因小鼠模型的建立 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验仪器及耗材 |
| 1.2 实验动物与载体 |
| 1.3 溶液配制与试剂 |
| 1.4 引物合成和 DNA 测序 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 pBD-1 基因片段的设计与合成 |
| 2.2 pBD-1 基因乳腺特异性表达载体的构建 |
| 2.3 pBD-1 基因乳腺特异性表达载体的提取与纯化 |
| 2.4 转基因小鼠的制备 |
| 2.4.1 Founder 转基因小鼠制备流程 |
| 2.4.2 Founder 转基因小鼠鉴定 |
| 2.4.3 F1~F2 代转基因鼠的产生与鉴定 |
| 2.4.4 转基因小鼠表达鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 pBD-1 基因乳腺特异性表达载体的鉴定 |
| 3.2 pBD-1 基因乳腺特异性表达载体显微注射 DNA 片段的获取 |
| 3.3 Founder 转基因小鼠鉴定 |
| 3.4 pBD-1 基因的遗传检测 |
| 3.5 pBD-1 基因的表达检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于乳腺特异性表达载体的构建 |
| 4.2 关于转基因小鼠的表达分析 |
| 5 小结 |
| 第四节 利用乳腺特异性表达人溶菌酶生产转基因猪克隆胎儿的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验仪器及耗材 |
| 1.2 细胞、载体与菌株 |
| 1.3 溶液配制与试剂 |
| 1.4 引物合成和 DNA 测序 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 小鼠乳腺癌细胞株 C127 药物 G418 致死曲线的摸索 |
| 2.2 小鼠乳腺癌细胞株 C127 的转染、筛选与整合鉴定 |
| 2.3 外源激素诱导 hLYZ 在转基因细胞中的表达及浓缩 |
| 2.4 hLYZ 在 C127 转基因细胞 mRNA 水平上的表达 |
| 2.5 hLYZ 在 C127 转基因细胞重组蛋白的表达 |
| 2.6 C127 转基因细胞上清液中重组人溶菌酶活性分析 |
| 2.7 猪胎儿成纤维细胞转染 hLYZ 基因稳定细胞系的建立与鉴定 |
| 2.8 卵母细胞的体外成熟 |
| 2.9 体细胞核移植显微操作 |
| 2.10 重构卵的融合与激活 |
| 2.11 转基因胚胎胚胎移植 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 乳腺表达载体的抽提及纯化 |
| 3.2 小鼠乳腺癌细胞株 C127 的转染与整合鉴定 |
| 3.3 RT-PCR 检测 hLYZ 基因在 C127 细胞中的表达 |
| 3.4 Western blotting 检测目的蛋白在转基因细胞中的分泌 |
| 3.5 重组人溶菌酶生物学活性检测 |
| 3.6 转 hLYZ 猪胎儿成纤维转基因细胞稳定细胞系的建立与胚胎移植 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五节 利用乳腺特异性表达猪防御素生产转基因猪克隆胚胎的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验仪器及耗材 |
| 1.2 细胞与载体 |
| 1.3 溶液配制与试剂 |
| 1.4 引物合成和 DNA 测序 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 小鼠乳腺癌细胞株 C127 的转染、筛选与表达验证 |
| 2.2 PBD-1 猪胎儿成纤维转基因细胞稳定细胞系的建立 |
| 2.3 转 PBD-1 基因克隆胚的构建 |
| 2.4 转 PBD-1 基因克隆胚的鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 小鼠乳腺癌细胞株 C127 的转染与表达鉴定 |
| 3.2 猪胎儿成纤维细胞转染 pBD-1 基因稳定细胞系的建立与鉴定 |
| 3.3 转 pBD-1 基因克隆胚的构建与鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于重组蛋白的检测和纯化 |
| 4.2 关于乳腺特异性表达载体的构建 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 下一步工作设想 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
四、外源RNA对小鼠白蛋白基因表达及DNaseⅠ敏感性的影响（论文参考文献）
- [1]基于CRISPR/Cas9的猪Mx1基因编辑的研究[D]. 石超群. 山东农业大学, 2021(01)
- [2]无内毒素SINE RNA的制备及其影响人晶状体上皮细胞ROS的分子机理[D]. 闫丽芳. 河北医科大学, 2021(02)
- [3]无内毒素污染的基因工程鼠源SINE RNA的制备[J]. 杨爽爽,曹洪益,闫丽芳,KHAN Murad,吉宁,刘鑫,宋志学,张东明,王秀芳,吕占军. 中国生物制品学杂志, 2020(11)
- [4]rs3091244调控CRP基因表达机制及其与癌症风险的关系[D]. 李硕磊. 兰州大学, 2019(08)
- [5]基于CRISPR/Cas9的猪胚胎成纤维细胞基因组编辑及MSTN基因遗传修饰猪的制备[D]. 王侃侃. 吉林大学, 2018(12)
- [6]人源Alu RNA工程菌的构建和表达[J]. 尹舒贤,赵月华,刘超,吕占军,王秀芳. 中国生物工程杂志, 2017(07)
- [7]通过RNAi制备不同AFP表达水平的大鼠肝癌细胞[D]. 宋蕾. 河北医科大学, 2016(04)
- [8]RNA序列、位置及短序列增强子突变影响报告基因表达[D]. 程健君. 河北医科大学, 2014(09)
- [9]猪体细胞转人凝血因子IX和hfat-1基因的研究[D]. 韩雪洁. 内蒙古大学, 2013(S2)
- [10]利用RNA干扰和乳腺生物反应器生产抗腹泻病转基因猪育种新材料的研究[D]. 陈建文. 安徽农业大学, 2012(07)