一、哈维氏弧菌的血清型与菌苗抗原性的关系（论文文献综述）
陈皓祥[1]（2021）在《花鲈哈维弧菌甲醛灭活疫苗的制备及其保护力研究》文中指出花鲈（Lateolabrax maculatus）是我国海水捕捞的重要对象之一,也是第二大海水养殖鱼种。但是海鲈病害频繁发生且日趋严重,给海鲈养殖产业造成极大的经济损失,严重制约了海鲈养殖业的发展。根据本课题组的流行病学调查;哈维弧菌（Vibrio harveyi）是海水花鲈养殖产业中最主要的病原菌之一。为防治花鲈哈维弧菌病。本课题组决定进行花鲈哈维弧菌甲醛灭活疫苗的实验室研制。1.本实验从实验室菌库中挑选出21株不同分子分型的哈维弧菌,并对21株哈维弧菌进行初筛,再从筛选出的菌株中进行复筛,最终筛选出疫苗菌株和备用菌株。最后检测疫苗菌株间的交叉保护效果。实验结果显示:从21株哈维弧菌中筛选出2株强毒株5#和16#作为疫苗制备菌株,1株次强毒株3#作为备用菌株;疫苗菌株间的交叉保护效果差,需要制备二价疫苗。2.对菌株的生物学性状及生长特性进行研究。绘制了菌株的生长曲线;利用单因素实验方法对温度、盐度、pH值以及培养基进行了筛选,同时利用正交实验的方法比较了温度、盐度、pH值对哈维弧菌生长的影响;最后测定菌株的半致死浓度。实验结果显示:菌株接种16h后即可进入平台期,菌液吸光度与菌液浓度的线性关系良好;在培养基为营养肉汤培养基,pH值为7,盐度为3%,培养温度28℃时,哈维弧菌生长情况最好,其中盐度对生长的影响最大,其次是温度,pH值的影响最小;在培养基筛选试验中,2216E培养基中菌株生长效果更好。3#、5#、16#菌株的半致死浓度分别是3.09×105CFU/g、4.04×105CFU/g、4.02×105CFU/g。3.研究了疫苗的安全性及免疫效力,确定最佳灭活条件;检测疫苗对鱼苗的安全性;研究疫苗对花鲈生长的影响;确定最小免疫剂量;测试疫苗的免疫保护期与相对保护率和受免鱼的血清抗体效价。结果显示:最佳灭活条件为甲醛终浓度0.4%、灭活时间24h、温度28℃、摇床转速200rmp。接种疫苗对花鲈安全,且不会影响花鲈的生长。疫苗浓度为9.6×107 CFU/g时,对花鲈的相对保护率最高。当疫苗最终注射剂量为4.78×107CFU/g时,第1周的相对保护率仅为21.4%,并在第2周对花鲈的相对保护率提升到了43.7%,从第7周开始,相对保护率超过50%,并且可以一直持续到第13周。即在第2周后的整个实验周期中,疫苗都可以为花鲈提供较好的相对保护效果,保护期为11周。免疫组血清抗体效价在第1周最低,为1:32～1:64,但已经和空白组、对照组差异显着;第2周快速上升,之后趋于平缓,但仍会处于一个较高的水平,此过程中血清抗体滴度最高可达1:2048,同时空白组和对照组的血清抗体效价一直比较稳定,处于1:8～1:32。综上所述,本实验为花鲈哈维弧菌甲醛灭活二价疫苗的后续研究提供了基础。
杨阿敏[2]（2021）在《哈维氏弧菌菌株的鉴定、基因分型及其灭活疫苗在大黄鱼中的免疫效果评价》文中研究说明哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）是一种重要的条件致病菌,它可以感染多种海洋鱼类和无脊椎动物。近年来,随着我国海水养殖业的扩大,哈维氏弧菌对水产养殖动物的影响日益增加,其宿主范围也在扩大。目前,已有多个针对哈维氏弧菌的商品化疫苗,但在不同地区使用时免疫效果存在差异,可能由于疫苗制备菌株与当地流行的致病株间存在抗原性差异所致。因此,探索在我国海洋养殖区域流行的哈维氏弧菌的遗传及抗原多样性,对于制备适用于我国海水养殖鱼类的弧菌病的疫苗具有重要的意义。基于本实验室在2014至2019年期间从浙江省和福建省等地的七种海水养殖动物中分离获得的待鉴定菌株,本研究分别采用弧菌属和哈维氏弧菌特异性PCR分子鉴定的方法,鉴定得到弧菌属的菌株123株,其中哈维氏弧菌54株。仅哈维氏弧菌用于进一步的分析,包括基于肠道细菌重复基因间共有序列PCR（ERIC-PCR）的基因分型分析、溶血性分析、质粒多样性分析、药物敏感性分析、毒力相关基因的检测等。基于以上分析结果,挑选10株哈维氏弧菌菌株,在大黄鱼模型中进行菌株的毒力分析。再从中选择了3个菌株,试探性地制备了三价灭活疫苗,初步分析了其浸泡接种的免疫效应。本论文的主要研究结果如下:（1）ERIC-PCR分子分型实验结果表明,从东部两个沿海省份的海洋养殖场中采集到的54株哈维氏弧菌分离株相似性指数在70%-100%之间,存在明显的种内遗传多样性。以90%的相似性指数为界划分,所有分离株可分为12个基因型。部分从不同的养殖场获得的分离株基因型一致且相似性为100%,这反映了某些哈维氏弧菌菌株在养殖场间传播的可能性。（2）溶血性检测结果显示,54株菌株中β溶血型（完全溶血）菌株为0%,α溶血型（不完全溶血）菌株为22.2%,γ溶血型（不溶血）菌株为77.8%。（3）质粒检测结果显示,61.1%的哈维氏弧菌（33/54）携带质粒,数量在1至11个之间,大小从1.3 kb至30 kb不等。其中,大黄鱼来源的菌株中有87.5%（14/16）携带质粒,且携带4个以上;而虎斑乌贼来源的菌株中仅有31.6%（7/19）携带质粒,且携带不到2个。（4）药敏实验结果显示,所有检测菌株均对阿莫西林、氨苄西林耐药,但均未表现出对四环素、氯霉素、氟苯尼考、诺氟沙星、恩诺沙星和复方新诺明的耐药性。质粒阳性菌株与阴性菌株之间的耐药性无明显差异,表明菌株对特定药物的耐药性并非来自于质粒编码的产物。（5）七个典型或非典型的弧菌毒力基因（chi A、vhp S、vhh、vhp A、vhp B、pap6和hly A）的检测结果显示所有菌株间均一致,潜在毒力DNA标记（pvm）阳性率为81.4%（44/54）。筛选的10株菌株的大黄鱼毒力分析结果表明菌株的毒力差异与上述基因的检测结果无关,但质粒阳性株的毒力显着高于阴性株（p<0.05）。（6）本研究所制备的三价灭活疫苗的浸泡接种免疫效应分析结果显示,从免疫保护率看,未能达到理想免疫效果。但基于血清和黏液的特异性Ig M抗体水平以及免疫相关基因的表达情况,该疫苗对大黄鱼的浸泡免疫刺激具有一定的效果,能诱导大黄鱼的局部及系统的适应性体液免疫应答。
张崇文,毛芝娟,于涟[3]（2012）在《大黄鱼三种病原弧菌外膜蛋白交叉保护性抗原筛选》文中研究指明弧菌是海水养殖环境中常见的条件性致病菌,弧菌病的暴发给水产养殖业造成了严重损失。鉴于水生动物尤其是鱼类弧菌病的发生常常是多种（血清型或亚种）弧菌的混合感染,筛选具有潜在的交叉保护性蛋白抗原,作为制备多价疫苗或联合疫苗的侯选成分具有重要意义。文中从患病大黄鱼中分离到8株弧菌,经生理生化和分子生物学鉴定分别为6株哈维氏弧菌Vibrio harveyi,1株溶藻弧菌Vibrio alginolyticus和1株副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus。选择典型的不同种的弧菌为代表,提取其外膜蛋白,经SDS-PAGE和Westernblotting分析,确定它们大约在45 kDa、35 kDa、22 kDa处出现了3条共同的免疫印迹条带,表明它们很有可能含有共同的能够彼此交叉保护的抗原。利用双向电泳和免疫印迹相结合的方法,借助于MALDI-TOF-MS质谱分析技术,发现溶藻弧菌V.alginolyticus的一种功能未知的孔蛋白（Porin,GenBank Accession No.ZP01260407）和副溶血弧菌V.parahaemolyticus的一种麦芽糖孔蛋白的前体蛋白（Maltoporin precursor,GenBank AccessionNo.NP801154）能够和哈维氏弧菌V.harveyi全菌多抗产生免疫反应,表明这两种蛋白可以作为3种弧菌的交叉保护性抗原,以此制备的疫苗可望对3种弧菌的感染产生交叉保护作用。
徐芝亮[4]（2012）在《哈维氏弧菌遗传多样性分析及毒力相关基因的检测》文中研究说明哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）是海水鱼类的一种主要的病原弧菌，可以感染多种海水鱼类，在世界许多国家均有报道过该弧菌病的爆发和流行，对水产养殖业造成了巨大危害，严重的影响着海水养殖业的发展。近年来，哈维氏弧菌引发的弧菌病在我国也频繁爆发，目前已报道感染了南美白对虾、大黄鱼、红笛鲷等重要的水产经济动物。然而对哈维氏弧菌所导致的病认识时间较短，流行病学研究尚不够深入；特别是国内缺乏对哈维氏弧菌的血清型、分子型分析的研究。本实验采集了广东省、海南省、广西自治区三地的患病海水鱼类或养殖水体经分离纯化得到425株弧菌，经过分子生物学方法、再生化方法鉴定确定出101株哈维氏弧菌，对其进行命名编号；并运用血清型和分子分型（RAPD分型和BOX分型）对101株哈维氏弧菌进行分型研究以及对哈维氏弧菌毒力相关基因进行检测；主要结果如下：1.用哈维氏弧菌对红笛鲷进行了致病性实验，发现101株哈维氏弧菌中有强毒株菌株有：1201、1203、1205、1206、1208、1213、1223、1236、1240、1243、1248、1251、1257、1260、1263、1277、1278、1279、1284、1285总计20株；弱毒株菌株有：1202、1204、1209、1215、1216、1219、1226、1227、1231、1258、1261、1264总计12株。2.血清型结果显示初步可以将实验中的101株V.harveyi划分为两种血清型，一种是以编号1261菌株为代表，可以与前8种血清（O1208、O1261、O1250、O1203、O1223、O1277、O1279、O1205）都反应；另一种就是以编号1247菌株为代表，只与血清O1263、O1211反应；另外还有1229、1246、1255、1260、1268、1269、1271、1272、1273、1275、1278、1281、1284、1287、1288、1290、1293、1296、1299因不与制备的10种血清中的任何一种反应，故无法对其进行划分，因此有必要采用其他方法进行分型研究。3.分子分型结果显示从10个RAPD引物中发现只有PM2引物的分辨率和重复性较好，出现15条不同RAPD条带，在相似度65%下，101株哈维氏弧菌可以分为18种不同型；BOX分型出现20条不同的条带，在相似度为40%的情况下，可以把101株哈维式弧菌分15种不同的型；综合RAPD PM2和BOX分型，发现在相似度50%下，101株哈维氏弧菌可分18种型。4.对哈维氏弧菌toxS，zot，tcpA，tdh，trh和tlh基因的检测，结果显示：toxS基因在101株哈维氏弧菌中的检出率为17.8%，在32株毒株中检出率为25%；zot基因检出率为6.9%，在毒株中检出率为12.5%；tlh基因检出率为14.9%，在毒株中检出率为3.1%；tdh基因在检出率为7.9%，在毒株中检出率为15.6%；而tcpA和trd基因没有检测出。发现zot、trh基因在广东菌株中分布比较广泛，toxS基因在广西和广东菌株出现较频繁，tdh基因则广泛出现在海南菌株中；而tcpA、tlh在三个地区的菌株中都没有检测出。
肖丹[5]（2011）在《射阳盐场地区鲫源嗜水气单胞菌分子流行病学研究》文中进行了进一步梳理细菌性败血症是银鲫的主要病害之一,此病流行时间长、流行地域广、危害性大,给银鲫养殖户带来了巨大的经济损失。本研究于2009年5月至2010年10月间对射阳盐场地区银鲫细菌性败血症的流行情况进行了调查,并对病原菌进行了分离鉴定,通过分子生物学方法对其进行基因分型,研究其与菌株致病能力及抗原性的关系,以期为银鲫细菌性败血症防控措施的制定奠定基础。本研究主要分为以下4个部分。1射阳盐场地区银鲫细菌性败血症流行病学调查及病原菌分离鉴定2009年5月-2010年10月对射阳地区银鲫细菌性败血症于20℃-34℃开始流行,29℃-33℃为发病高峰,主要危害0.2-0.4kg的当年鱼种及成鱼,分慢性型与急性型两种发病类型,水体中水温、溶氧的变化及较高的亚硝酸盐含量会使疾病病情恶化;从自然患病鱼体上共分离了17株病原菌,鉴定均为致病性嗜水气单胞菌; 17株病原菌生化表型、致病性间存在差异。17株病原菌耐药性严重,对阿莫西林、多西环素、氟苯尼考、土霉素等药物完全耐药;对左氟沙星、恩诺沙星、罗红霉素、新霉素、庆大霉素、复方新诺明、磺胺二甲嘧啶、多粘菌素等药物不同程度耐药。2鲫源嗜水气单胞菌的ERIC-PCR分型方法建立及应用本实验建立了一套嗜水气单胞菌ERIC-PCR分子分型方法,并对PCR体系、反应条件等关键点进行了优化,该方法稳定性好、可有效区分菌株遗传学背景的差异,适用于嗜水气单胞菌分子流行病学研究;用所建立的方法对2009-2010年射阳地区分离的17株致病性嗜水气单胞菌分离株及7株本实验室保藏的分离与其他地区的嗜水气单胞菌进行检测发现,24株鲫源嗜水气单胞菌可聚为3类,分别用A、B、C型表示。其中14株射阳地区分离株与江西株S2、浙江株BSK-10、广东株S3及80916同为B型,其余3株分离株基因型与浙江株H-1同为A型,说明射阳地区与这些地区可能存有致病性嗜水气单胞菌输出或输入现象;本研究还发现,从同一病例中分离的多株致病性嗜水气单胞菌株基因型存在差异,从同一发病池塘不同时间发病病例中分离的致病性嗜水气单胞菌株基因型间存在差异。3鲫源嗜水气单胞菌毒力因子分布及其与基因型的关系本实验建立了一套致病性嗜水气单胞菌5个主要毒力基因多重PCR检测方法,并对PCR体系、反应条件等关键点进行了优化,该方法特异性强、敏感性高、反应结果清晰且易判断,适用于大量样本的快速检测。用所建立的方法对2009-2010年射阳地区分离的17株致病性嗜水气单胞菌进行检测发现,不同菌株间5种毒力基因的携带情况存有差异,毒力基因型为aer+hly+alt+ahp+act+的菌株最多。此外,本研究发现菌株致病力与菌株毒力基因携带情况存在联系,毒力基因组成为aer + hly + alt +ahp +act+菌株毒力高于毒力基因缺失株,可能是急性型细菌性败血症的致病株,而毒力缺失株可能会导致慢性型的细菌性败血症;17株鲫源致病性嗜水气单胞菌分离株的致病力及毒力基因携带情况与ERIC-PCR基因型存有一定的关系,毒力基因型aer+hly+alt+ahp+act+的嗜水气单胞菌分离株ERIC-PCR基因型均为B型具有急性毒性,ERIC-PCR基因型为A型的嗜水气单胞菌分离株的5个毒力基因均有不同程度的缺失,毒性较弱。这表明B型嗜水气单胞菌多可能为强毒株,有必要加强对此类菌株的监测及防控,避免此类强毒株在大范围内流行。4鲫源嗜水气单胞菌抗原性及其与基因型的关系本实验通过研究17株鲫源嗜水气单胞菌的ERIC-PCR基因型与免疫原性进行研究,发现各菌株对同种基因型菌株交叉凝集效价显着高于对不同基因型间菌株的交叉凝集效价,说明ERIC-PCR基因型与菌株免疫原性间存一定关系,ERIC-PCR方法经标准化后可以传统克服血清分型法受到标准菌株限制、存在大量不可分型株、实验室间难以比较等缺点,成为嗜水气单胞菌疫苗株的筛选分析的新途径,为嗜水气单胞菌多价疫苗、亚单位疫苗的开发及疫苗预期效果评价奠定基础。
李研东[6]（2009）在《食品中弧菌免疫学筛检方法建立研究》文中进行了进一步梳理食物中毒菌的检测一直是食品安全领域的热点问题,随着海水养殖业的蓬勃发展,由致病性弧菌造成的食物中毒病例频繁发生。现行的弧菌检测方法要么针对样品单一、耗时费力;要么检测试剂昂贵,不利于推广。因此,建立一种广谱快速、低耗高效、灵敏便捷的弧菌筛检方法尤为重要。本研究旨在找到弧菌属细菌的共同抗原,以此抗原为靶标,建立可同步筛检多种弧菌的免疫学检测方法。弧菌外膜蛋白位于弧菌最外层,具有与外界广泛接触的机会;弧菌鞭毛主要由鞭毛丝蛋白组成,抗原性好,保守性高。这些特点使它们成为弧菌属细菌共同抗原的首选目标。OmpK为弧菌噬菌体KVP-40的受体,可能存在于多种海洋弧菌的外膜之中;鞭毛基因FlaA、FlaB、FlaF编码弧菌极鞭毛丝蛋白基因,鞭毛丝蛋白保守性高。首先,本实验从弧菌OmpK的基因入手,通过克隆获得5株弧菌标准株OmpK基因并测序比较,从分子水平证明OmpK基因为多种弧菌所共有。同时,本实验成功构建副溶血弧菌多联鞭毛丝蛋白结构基因F,通过PCR克隆获得副溶血弧菌鞭毛基因片段（FlaA﹑FlaB﹑FlaF）,用柔性Linker序列（Gly4Ser）进行串联,通过套叠PCR扩增出副溶血弧菌多联融合鞭毛基因F。其次,实验设计利用溶藻弧菌OmpK基因和多联融合基因F构建原核表达重组质粒pET22b-OmpK和pET22b-F,转化大肠杆菌BL21（DE3）,在IPTG诱导下获得高效表达。之后,通过纯化两种重组蛋白分别免疫豚鼠和獭兔制备多抗血清,经ELISA检测两种多抗血清效价分别为1:51200和1:6400。两种多抗血清均可与多种弧菌发生反应而与非弧菌类食物中毒菌不识别,说明两种血清均具有较好的弧菌属特异性。利用纯化的多抗建立可同时筛选多种弧菌的抗原捕获ELISA方法;同时,利用重组表达的OmpK免疫BALB/c小鼠,制备抗外膜蛋白K的单克隆抗体,旨在筛选出具有弧菌属特异性的单克隆抗体,进而有针对性的定位弧菌属特异性的抗原表位,为以后的实验工作奠定基础。
刘嘉[7]（2009）在《三种弧菌外膜蛋白K基因的克隆、表达及其潜在应用的研究》文中提出弧菌是海洋环境中普遍存在的一种革兰氏阴性细菌。许多弧菌,如哈维氏弧菌、副溶血弧菌、溶藻胶弧菌等是海洋养殖鱼类的重要致病菌。最近几年研究表明病原细菌的外膜蛋白（outer membrane proteins,简称OMPs）在机体中具有保护性抗原的作用,所以OMPs作为疫苗开发的对象特别引起了人们的关注。在具有潜在保护作用的弧菌外膜蛋白中,有一种组分值得我们注意,那就是外膜蛋白K（outer membrane protein K,简称OmpK）,它普遍存在于许多弧菌和发光细菌不同种中,是一种具有广泛宿主范围的噬菌体KVP40的受体。本研究根据哈维氏弧菌OmpK基因序列,3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因序列和酒精酵母菌表面展示质粒载体pYD1上的多克隆位点设计引物,从哈维氏弧菌基因组DNA和质粒pET-OmpK-GAPDH中通过PCR技术扩增外膜蛋白基因和融合基因OmpK-GAPDH,把该基因连接到表面展示质粒载体pYD1上,转化用于表面展示的酵母EBY100菌株中.以不含载体和含空载体的酵母菌为对照,加2%（w/v）的半乳糖诱导36 h后,利用免疫荧光法在荧光显微镜下检测到了展示在酵母菌细胞表面上的外膜蛋白。同时利用大肠杆菌表达载体pQE-30,构建了哈维氏弧菌,副溶血弧菌,溶藻胶弧菌三种弧菌外膜蛋白K的重组大肠杆菌,IPTG诱导4 h后能够在大肠杆菌M15中高效表达了的融合蛋白。通过诱导表达用Ni2+亲和柱纯化了重组的三种弧菌的外膜蛋白K,SDS-PAGE检测分子量分别为29 kDa,30 kDa,30 kDa。用展示有哈维氏弧菌外膜蛋白k的酵母菌细胞对大菱鲆进行注射免疫,采用间接ELISA的方法,利用上述制备的重组哈维氏弧菌外膜蛋白k检测免疫鱼类血清中抗体的产生;间接ELISA对大菱鲆特异抗体检测结果表明,实验组有效价,说明这种以酒精酵母为载体的活疫苗可以刺激鱼类产生一定得抗体,但其平均效价却很低。
李香平[8]（2008）在《宁波地区副溶血弧菌血清型和部分毒力基因的分布研究》文中研究指明副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）为革兰氏阴性的短杆菌,常存在鱼类和贝类等海产品中,分布于海岸线等世界各地。在沿海地区和国家,副溶血弧菌是引发食性疾病的重要病原菌。研究数据表明,50%-70%因食用海产品引发的腹泻病例是由副溶血弧菌引起的。此菌主要通过消化道感染,患者出现腹泻、腹部痉挛、恶心、呕吐、发热,甚至脱水、昏迷等症状。副溶血弧菌也是我国海水养殖鱼、虾、贝类的重要病原,每年由此菌引起的弧菌病给养殖业造成严重的损失。在浙江省沿海网箱养殖中,该菌与哈维氏弧菌、溶藻弧菌等重要病原弧菌一起,主要危害大黄鱼幼鱼,每年的高温季节可引起大量的死亡。致病微生物的快速检测与分离技术是致病微生物研究的热点之一。PCR能快速检测食品中存在的致病微生物,是一种有效的快速检测手段。建立副溶血弧菌的快速简便的鉴定和分子分型方法,对于开展海产品生产加工过程中副溶血弧菌污染源调查和控制,提高食品的微生物卫生质量具有重要意义。本文以具有副溶血弧菌种特异性的毒力调控基因toxR基因,建立聚合酶链式反应（PCR）方法以鉴别海产品中分离的的副溶血弧菌。71株分离菌以toxR基因为靶基因均能扩增出340bp的目的片段,并且存在于所有的分离菌株中,具有良好的保守性。以toxR作为靶基因的PCR法快速鉴定副溶血弧菌,灵敏度高、一致性和特异性较好。副溶血弧菌具有多种毒力因子,致病菌株能够产生热稳定性溶血素有热稳定直接溶血素（thermostable direct hemolysin,TDH）、热不稳定溶血素（thermolabilehemolysin,TLH）和相对热稳定直接溶血素（TDH-related hemolysin,TRH）。研究宁波地区副溶血弧菌不同血清型菌株主要毒力基因的分布情况,从贝类中分离并鉴定副溶血弧菌,得到副溶血弧菌菌株71株,并对主要毒力基因（TLH,TRH,TDH,toxR）进行了PCR检测。结果表明所有菌株均能扩增出340bp左右的toxR基因片段,除了参考菌株BJI.1997以外,所有菌株均没有扩增出TRH基因片段,所有菌株均KP阴性并没有扩增出269bp左右的TDH片段,TLH存在于所有分离菌株中。参照GBPT 478917-2003用标准血清进行副溶血弧菌血清学试验,用最小抑菌浓度（MIC）法进行了氨苄青霉素、硫酸新霉素、硫酸庆大霉素、壮观霉素、卡那霉素、硫酸土霉素、硫酸链霉素、盐酸四环素、利福平等对四种不同血清型的副溶血弧菌的药敏试验。结果表明分离到的20株副溶血性弧菌主要分属于2个血清群,分别为O1群占50%（10/20）、O5群占15%（3/20）,有35%（7/20）的菌株出现自凝现象。药敏试验结果显示:副溶血弧菌O1:KⅢ对卡那霉素敏感,所有菌株对氨苄青霉素耐受,对硫酸新霉素（Neomycin Sulfate,NEO）和硫酸链霉素（Streptomycin Sulfate,STR）敏感性无显着差异（t测验,P＞0.05）。经过96h鱼类急性毒性试验,检测不同副溶血弧菌血清型对异育银鲫的毒性。结果表明,不同血清型的副溶血弧菌对异育银鲫的毒性大小差异不显着。利用不同血清型的副溶血弧菌的福尔马林灭活全菌苗（FKC）注射异育银鲫,检测不同血清型菌株之间的免疫原性。结果表明,副溶血弧菌的福尔马林灭活全菌苗（FKC）能够有效的刺激抗体的产生,不同血清型的菌株之间的交叉抗体效价较低。福尔马林灭活的全菌苗能显着提高受免鱼白细胞的吞噬活性和溶菌酶活性（t测验,P＜0.05）。副溶血弧菌的福尔马林灭活全菌苗（FKC）能够起到良好的免疫保护作用。
刘青,赵恒寿[9]（2007）在《鱼类常用免疫指标及其检测技术》文中研究表明主要介绍攻毒成活率,免疫器官体指数,免疫细胞活性,以及组织、血液、体液中微观的免疫成分等反映机体免疫状况的指标及其检测方法。在研究鱼类免疫性能时,应采用攻毒成活率作为综合评价指标;免疫器官体指数、免疫细胞活性作为组织、细胞水平的免疫指标,检测方法相对简单易行;而微观的免疫成分检测较为复杂,可根据试验需要选择部分指标。上述指标与鱼体免疫机能正相关,检测方法在不同试验动物或试验条件下可适当调整。
刘勇[10]（2007）在《不同免疫刺激剂对水产动物免疫功能影响的研究》文中研究指明1本文报道用温酚法分别从柱状嗜纤维菌（Cytophaga columnaris）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）和叉尾鮰爱德华菌（Edwardsiella ictaluri）中提取的粗脂多糖（LPS）作为免疫原，分别接种斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus Rafinsque）后，通过测定受免鱼的交叉凝集抗体效价，头肾和血液中吞噬细胞的吞噬活性和对A．hydrophila活菌细胞内杀菌活性的方法，探讨鱼类3种致病菌的粗LPS对斑点叉尾鮰免疫原性的试验结果。试验结果表明，从3种致病菌中提取的粗LPS对斑点叉尾鮰均具有较强的免疫原性，受免鱼的血清中存在对3种致病菌的交叉凝集抗体，与对照鱼相比，头肾和血液中吞噬细胞对吞噬原的吞噬活性和对A．hydrophila活菌杀菌活性明显上升。说明在3种供试菌的粗LPS上不同程度地存在3种致病菌的共同保护性抗原。2从极端嗜冷细菌（Psychrophilic bacteria）中提取菌体脂多糖（lipopolysaccaride，LPS）和外膜蛋白（outer membrane protein，OMP），作为保护性抗原，注射接种鲫鱼（Carassius auratus）。不同时间后，通过测定受免鱼血清溶菌酶活性、抗菌活力，酚氧化酶活力和白细胞吞噬活性，以及接种后血液中白细胞的数量变化，检测二种抗原对鲫鱼免疫功能的影响。结果表明，二种抗原对鲫鱼均有较强的免疫原性，受免后各组之间进行比较，免疫组鲫鱼各指标均明显高于对照组。3在饲料中添加0.5％的虫草菌粉，以口服形式对日本沼虾（Macrobrachiumnipponensis）进行免疫。日本沼虾血淋巴白细胞吞噬活性、血清抗菌、溶菌活力及酚氧化酶活力均显着提高。经嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）攻毒后，试验组的免疫保护率也明显提高。因此，投喂虫草菌粉，能够明显地增强日本沼虾的免疫抵抗能力。4在饵料中添加不同含量的免疫增强剂（0.2％，0.5％，0.8％）连续投喂21d。在0，1，4，7，14，21d检测鲫鱼（Carassius auratus）血液白细胞的吞噬活性、血清和体表粘液的溶菌酶活性。结果表明，该免疫增强剂可使鲫鱼血液中白细胞吞噬活性、血清和体表粘液的溶菌酶活性都有明显提高。在停止投喂后7d，血清溶菌酶的活性逐渐降低与对照组无显着差异（P＞0.05），但白细胞吞噬活性依然显着差异于对照组（P＜0.05）。
二、哈维氏弧菌的血清型与菌苗抗原性的关系（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、哈维氏弧菌的血清型与菌苗抗原性的关系（论文提纲范文）
（1）花鲈哈维弧菌甲醛灭活疫苗的制备及其保护力研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 1.鱼用疫苗的研究进展 |
| 1.1 鱼用疫苗的分类 |
| 1.2 细菌性鱼用疫苗的研究进展 |
| 1.3 疫苗研制的关键 |
| 2 花鲈及其主要病原 |
| 2.1 花鲈 |
| 2.2 主要病原 |
| 3 花鲈疫苗的研究进展 |
| 4 哈维弧菌的研究进展 |
| 5 花鲈哈维弧菌疫苗研制的目的和意义 |
| 第1章 疫苗菌株的确定 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验菌株 |
| 1.1.2 实验用鱼 |
| 1.1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.1.5 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 疫苗候选菌株初筛 |
| 1.2.2 疫苗候选菌株复筛 |
| 1.2.3 疫苗菌株间的交叉保护效果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 疫苗菌株筛选 |
| 1.3.2 菌株间的交叉保护 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 菌株生物学性状及生长特性 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验菌株 |
| 2.1.2 实验试剂及耗材 |
| 2.1.3 实验用鱼 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 吸光度与菌落数标准曲线制备 |
| 2.2.2 菌株生长曲线 |
| 2.2.3 菌株生长特性 |
| 2.2.4 疫苗菌株和备用菌株半致死浓度(LD_(50))测定 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 吸光度与菌落数标准曲线 |
| 2.3.2 菌株生长曲线 |
| 2.3.3 菌株生长特性 |
| 2.3.4 菌株半致死浓度 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 疫苗的安全性及免疫效力 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验菌株 |
| 3.1.2 实验用鱼 |
| 3.1.3 实验试剂及耗材 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.1.5 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 灭活条件优化 |
| 3.2.2 疫苗的安全性 |
| 3.2.3 疫苗对花鲈生长的影响 |
| 3.2.4 疫苗的最小免疫剂量 |
| 3.2.5 疫苗的免疫保护期与相对保护率 |
| 3.2.6 受免鱼的血清抗体效价 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 灭活条件优化 |
| 3.3.2 最小免疫剂量 |
| 3.3.3 疫苗的免疫保护期与相对保护率 |
| 3.3.4 受免鱼的血清抗体效价 |
| 3.4 小结 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）哈维氏弧菌菌株的鉴定、基因分型及其灭活疫苗在大黄鱼中的免疫效果评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 第二章 综述 |
| 2.1 弧菌及弧菌病 |
| 2.1.1 弧菌的基本特征 |
| 2.1.2 弧菌的鉴定方法 |
| 2.1.3 常见弧菌病 |
| 2.2 哈维氏弧菌 |
| 2.2.1 哈维氏弧菌主要生物学特性 |
| 2.2.2 哈维氏弧菌的致病性因子研究 |
| 2.2.3 哈维氏弧菌耐药现状 |
| 2.3 细菌分型 |
| 2.3.1 表型分型方法 |
| 2.3.2 基因分型方法 |
| 2.4 常见针对弧菌病的疫苗 |
| 2.5 研究目的及意义 |
| 第三章 哈维氏弧菌鉴定、基因分型及表型分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验菌株 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 主要实验仪器 |
| 3.1.4 实验试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 哈维氏弧菌菌株的复苏培养与鉴定 |
| 3.2.2 哈维氏弧菌基因分型 |
| 3.2.3 溶血性检测 |
| 3.2.4 哈维氏弧菌菌株的质粒多样性分析 |
| 3.2.5 药物敏感性实验 |
| 3.2.6 哈维氏弧菌毒力基因PCR检测 |
| 3.2.7 哈维氏弧菌代表株毒力分析 |
| 3.2.8 数据分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 菌株鉴定结果 |
| 3.3.2 基因分型结果 |
| 3.3.3 溶血性检测结果 |
| 3.3.4 质粒多样性分析结果 |
| 3.3.5 药物敏感性实验分析结果 |
| 3.3.6 毒力基因PCR检测结果 |
| 3.3.7 哈维氏弧菌代表株毒力分析结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 哈维氏弧菌三价灭活疫苗对大黄鱼浸泡免疫及其效果评价 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验菌株 |
| 4.1.2 实验用鱼 |
| 4.1.3 主要实验仪器 |
| 4.1.4 实验试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 疫苗制备 |
| 4.2.2 浸泡免疫实验 |
| 4.2.3 血清及黏液样品采集 |
| 4.2.4 血清及黏液酶联免疫吸附实验(ELISA)分析 |
| 4.2.5 相对免疫保护率(RPS)检测 |
| 4.2.6 RNA的提取及逆转录至cDNA |
| 4.2.7 组织中抗原识别与递呈相关基因转录水平检测 |
| 4.2.8 数据处理 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 疫苗灭活及无菌性检验 |
| 4.3.2 血清及黏液ELISA分析结果 |
| 4.3.3 相对免疫保护率检测结果 |
| 4.3.4 TLR2在鳃、脾脏、后肠和皮肤中的表达 |
| 4.3.5 IL-1β在鳃、脾脏、后肠和皮肤中的表达 |
| 4.3.6 MHC Ⅰ-α在鳃、脾脏、后肠和皮肤中的表达 |
| 4.3.7 MHC Ⅱ-β在鳃、脾脏、后肠和皮肤中的表达 |
| 4.3.8 CD4在鳃、脾脏、后肠和皮肤中的表达 |
| 4.3.9 CD8α在鳃、脾脏、后肠和皮肤中的表达 |
| 4.3.10 IgM(H)在鳃、脾脏、后肠和皮肤中的表达 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 主要结论与创新点 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 创新点与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文及科研成果 |
（3）大黄鱼三种病原弧菌外膜蛋白交叉保护性抗原筛选（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病原菌的分离与鉴定 |
| 1.1.1 病原菌的生化鉴定 |
| 1.1.2 病原菌的分子生物学鉴定 |
| 1.2 哈维氏弧菌灭活及其抗血清制备 |
| 1.3 Sarcosyl法抽提外膜蛋白 |
| 1.4 凝胶电泳和免疫印迹 |
| 1.5 双向电泳 |
| 1.6 免疫印迹 |
| 1.7 质谱分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 病原菌的分离和生理生化鉴定 |
| 2.2 HSP60基因部分序列扩增及系统进化树分析 |
| 2.3 哈维氏弧菌的灭活及抗血清效价检测 |
| 2.4 凝胶电泳和免疫印迹 |
| 2.5 双向电泳及免疫印迹结果 |
| 2.6 质谱分析结果 |
| 3 讨论 |
（4）哈维氏弧菌遗传多样性分析及毒力相关基因的检测（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 哈维氏弧菌的生物学特性 |
| 1.1.1 菌名及分类地位 |
| 1.1.2 大小形状及培养特性 |
| 1.1.3 生化特性 |
| 1.2 哈维氏弧菌的致病性与致病机制 |
| 1.2.1 致病性 |
| 1.2.2 致病机制 |
| 1.3 toxS, zot, tcpA, tlh, tdh, trh 等在弧菌中的研究进展 |
| 1.3.1 toxS 基因 |
| 1.3.2 zot 基因 |
| 1.3.3 tcpA 基因 |
| 1.3.4 tlh, tdh, trh 基因 |
| 1.4 哈维氏弧菌鉴定方法研究 |
| 1.4.1 传统鉴定方法 |
| 1.4.2 分子鉴定方法 |
| 1.5 哈维氏弧菌分型方法研究 |
| 1.5.1 传统分型方法 |
| 1.5.2 基因分型方法 |
| 1.6 免疫防治的研究 |
| 1.7 研究目的与意义 |
| 2 哈维氏弧菌的分离、鉴定及其毒性的检测 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要仪器和设备 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 溶液配制 |
| 2.1.4 实验用鱼 |
| 2.1.5 供试菌来源 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 菌株分离、纯化以及扩大培养 |
| 2.2.2 弧菌鉴定 |
| 2.2.3 哈维式弧菌菌液的制备 |
| 2.2.4 攻毒实验 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 患病鱼细菌的分离及纯化 |
| 2.3.2 PCR 鉴定结果 |
| 2.3.3 生化鉴定结果 |
| 2.3.4 细菌 Biolog 鉴定结果 |
| 2.3.5 攻毒实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 3 哈维氏弧菌的血清性状的研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 试剂和仪器 |
| 3.1.2 供试菌来源 |
| 3.1.3 实验动物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 哈维氏弧菌的活化培养 |
| 3.2.2 哈维氏弧菌抗原的制备 |
| 3.2.3 哈维氏弧菌不同菌株疫苗的制备 |
| 3.2.4 哈维氏弧菌不同菌株菌株多抗血清的制备方案与操作 |
| 3.2.5 微量凝集反应测定的血清抗体效价 |
| 3.2.6 微量凝集反应 |
| 3.2.7 实验兔颈动脉采血及血清获取 |
| 3.2.8 血清交叉反应的分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 微量凝集反应测定的血清抗体效价 |
| 3.3.2 血清交叉反应的分析 |
| 3.4 讨论 |
| 4 哈维氏弧菌分子遗传多样性研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 菌株来源 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 菌株的培养与基因组 DNA 的准备 |
| 4.1.4 RAPD 分析 |
| 4.1.5 BOX 分析 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 RAPD 分型的结果 |
| 4.2.2 BOX 分型结果 |
| 4.2.3 RAPD 和 BOX 分型综合分析 |
| 4.3 讨论 |
| 5 哈维氏弧菌相关毒力基因的检测研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 菌株来源 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 菌株的培养与基因组 DNA 的准备 |
| 5.1.4 zot, toxS, tcpA, tlh, tdh, trh 基因的检测 |
| 5.2 结果及分析 |
| 5.2.1 toxS, zot, tcpA, tdh, trh, tlh 基因检测结果 |
| 5.2.2 毒力相关基因在不同地区菌株中的分布情况 |
| 5.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（5）射阳盐场地区鲫源嗜水气单胞菌分子流行病学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 射阳地区银鲫细菌性败血症流行病学调查及鲫源致病性嗜水气单胞菌分离鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 培养基 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 流行病学调查 |
| 2.2 病原菌的分离 |
| 2.3 人工感染试验 |
| 2.4 病原菌株的鉴定 |
| 2.5 致病菌株药敏特性的研究 |
| 3 结果 |
| 3.1 流行病学调查 |
| 3.2 临床症状 |
| 3.3 病原菌分离 |
| 3.4 人工感染试验 |
| 3.5 菌株的形态观察 |
| 3.6 菌株生理生化鉴定 |
| 3.7 16srDNA 片段扩增及序列分析 |
| 3.8 药敏试验 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 鲫源致病性嗜水气单胞菌ERIC-PCR 分型 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株来源 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 菌株培养 |
| 2.2 细菌模版DNA 提取 |
| 2.3 DNA 浓度检测 |
| 2.4 DNA 模版的稀释 |
| 2.5 引物设计 |
| 2.6 ERIC-PCR 扩增方法的建立与优化 |
| 2.7 稳定性试验 |
| 2.8 鲫源嗜水气单胞菌ERIC-PCR 扩增 |
| 2.9 结果分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 退火温度的优化 |
| 3.2 引物添加量的优化 |
| 3.3 dNTP mixture、Taq 酶添加量的优化 |
| 3.4 延伸时间的优化 |
| 3.5 循环次数的优化 |
| 3.6 稳定性检验 |
| 3.7 鲫源嗜水气单胞菌ERIC-PCR 指纹图谱 |
| 3.8 鲫源嗜水气单胞菌ERIC-PCR 聚类分析 |
| 3.9 菌株基因型与致病性的关系 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 鲫源嗜水气单胞菌主要毒力因子分布及其与ERIC-PCR 基因型相关性 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株来源 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 菌株培养 |
| 2.2 细菌模版DNA 提取 |
| 2.3 aer、alt、act、hly、ahp 5 个毒力基因单独扩增 |
| 2.4 aer、alt、act、hly、ahp 5 个毒力基因多重PCR 条件建立及优化 |
| 2.5 敏感性、特异性实验 |
| 2.6 射阳地区17 株鲫源致病性嗜水气单胞菌5 个毒力基因多重PCR 检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 aer、alt、act、hly、ahp 5 个毒力基因单独扩增结果 |
| 3.2 aer、alt、act、hly、ahp 5 个毒力基因多重PCR 条件建立及优化 |
| 3.3 敏感性、特异性实验结果 |
| 3.4 17 株鲫源致病性嗜水气单胞菌5 个毒力基因多重PCR 检测结果 |
| 3.5 菌株ERIC-PCR 基因型与毒力基因的相关性 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 鲫源嗜水气单胞菌免疫原性及其与ERIC-PCR 基因型的相关性 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株来源 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 免疫原的制备 |
| 2.2 抗血清的制备 |
| 2.3 凝集实验 |
| 3 结果 |
| 3.1 嗜水气单胞菌灭活条件 |
| 3.2 抗原抗体凝集实验 |
| 3.3 鲫源嗜水气单胞菌基因型与免疫原性的相关性 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 附录1 缩略表（Abbreviations） |
| 附录2 试剂的配制 |
| 致谢 |
（6）食品中弧菌免疫学筛检方法建立研究（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 弧菌鞭毛的研究进展 |
| 1.1 弧菌鞭毛的结构及组成 |
| 1.2 弧菌鞭毛的基因组成 |
| 1.3 弧菌鞭毛的功能 |
| 第2章 弧菌主要外膜蛋白的分子免疫学研究进展 |
| 2.1 弧菌外膜蛋白的组成及种类 |
| 2.2 弧菌外膜蛋白的免疫学特性 |
| 2.3 相关的蛋白、蛋白酶和细菌毒素 |
| 2.4 弧菌的主要外膜蛋白 |
| 2.5 外膜蛋白在诊断学方面的研究应用 |
| 2.6 前景与展望 |
| 第3章 病原性海洋弧菌检测方法的研究进展 |
| 3.1 核酸为基础的检测技术 |
| 3.2 免疫学为基础的检测技术 |
| 3.3 核酸与免疫学相结合的检测技术 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 五种弧菌OMPK基因的克隆及分析 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 溶藻弧菌OMPK蛋白的表达和免疫特性 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 副溶血弧菌鞭毛基因的克隆、串联及表达 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 弧菌鞭毛多联融合蛋白、OMPK的免疫特性 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 弧菌属细菌ELISA快速筛检方法的建立 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 抗溶藻弧菌外膜蛋白K单克隆抗体的制备与鉴定 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文及其它成果 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 导师简介 |
（7）三种弧菌外膜蛋白K基因的克隆、表达及其潜在应用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 海水鱼类弧菌病研究概况 |
| 1.3 防治海洋鱼类弧菌病研究概况 |
| 1.4 海洋鱼类病原菌的主要保护性抗原研究进展 |
| 1.5 弧菌主要外膜蛋白研究进展 |
| 1.6 微生物的表面展示及应用 |
| 1.7 论文研究的目的和意义 |
| 第二章 哈维氏弧菌 OmpK 基因和 OmpK-GAPDH 融合基因的克隆及其在酒精酵母细胞表面展示 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 目的基因扩增结果 |
| 3.2 pMD19-T-OmpK simple 和pMD19-T-OmpK-GAPDH simple 酶切鉴定结果 |
| 3.3 pMD19-T-OmpK 和pMD19-T-OmpK-GAPDH 的测序鉴定 |
| 3.4 重组质粒pYD1-OmpK 和pYD1-OmpK-GAPDH 的构建 |
| 3.5 酵母菌落 PCR 筛选阳性转化子 |
| 3.6 免疫荧光检测 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第三章 哈维氏弧菌外膜蛋白k 基因的克隆及在大肠杆菌中的表达和纯化 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 哈维氏弧菌外膜蛋白k 基因的克隆 |
| 3.2 pMD19-VhOmpK simple 双酶切结果验证 |
| 3.3 pQE-30-VhOmpK 表达载体构建双酶切验证 |
| 3.4 pQE-30-VhOmpK 在大肠杆菌中的诱导表达 |
| 3.5 诱导条件的确定与蛋白的纯化 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第四章 以酒精酵母为载体的哈维氏弧菌外膜蛋白基因工程活疫苗对大菱鲆幼鱼的免疫效果的初步研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3 结果与讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第五章 副溶血弧菌,溶藻胶弧菌外膜蛋白 K 基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达和纯化 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 副溶血弧菌和溶藻胶弧菌外膜蛋白k 基因的克隆 |
| 3.2 pMD19-VpOmpK simple 和pMD19-VaOmpK simple 双酶切结果验证 |
| 3.3 pQE-30-VpOmpK 和pQE-30-VaOmpK 表达载体构建双酶切验证 |
| 3.4 pQE-30-VhOmpK 在大肠杆菌中的诱导表达 |
| 3.5 两种弧菌外膜蛋白 k 的纯化 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 总结与展望 |
| 本研究的创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 |
（8）宁波地区副溶血弧菌血清型和部分毒力基因的分布研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 副溶血弧菌的生物学特性 |
| 1.1.1 菌名与分类地位 |
| 1.1.2 大小形态 |
| 1.1.3 生长与栖息环境 |
| 1.1.4 培养特性 |
| 1.1.5 生化特性 |
| 1.2 副溶血弧菌的致病性与毒力因子 |
| 1.2.1 致病性 |
| 1.2.2 致病因子 |
| 1.3 副溶血弧菌的血清学 |
| 1.4 副溶血弧菌的基因分型 |
| 1.4.1 脉冲场凝胶电泳分析(PFGE) |
| 1.4.2 酶联免疫吸附剂测定(ELISA) |
| 1.4.3 随机扩增多态性DNA分析(RAPD) |
| 1.4.4 实时定量PCR |
| 1.4.5 限制性片断长度多态性分析(RFLP) |
| 1.4.6 肠道菌重复性基因间一致序列扩增(ERIC-PCR) |
| 1.4.7 核糖体分型(Ribotyping) |
| 1.5 研究的目的和意义 |
| 第二章 宁波地区贝类产品中副溶血弧菌的分离、药敏试验和血清型鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要仪器及产地 |
| 2.1.2 试验材料 |
| 2.1.3 抗生素 |
| 2.1.4 细菌分离和培养 |
| 2.1.5 细菌的生化鉴定 |
| 2.1.6 PCR鉴定 |
| 2.1.7 副溶血弧菌血清分型 |
| 2.1.8 药敏试验 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 分离菌株形态和生理、生化特性 |
| 2.2.2 16S rRNA与toxR PCR反应和序列分析结果 |
| 2.2.3 血清群分布 |
| 2.2.4 药敏试验 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 副溶血弧菌的鉴定 |
| 2.3.2 副溶血弧菌的血清学和药敏分析 |
| 第三章 不同血清型副溶血弧菌对异育银鲫的急性毒性试验 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验鱼 |
| 3.1.2 实验菌株 |
| 3.1.3 实验条件 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 宁波地区贝类中副溶血弧菌主要毒力基因的检测 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 toxR,TDH,TRH,TLH引物的设计与合成 |
| 4.1.3 KP溶血试验 |
| 4.1.4 尿素酶试验 |
| 4.1.5 细菌总DNA的提取 |
| 4.1.6 toxR,TDH,TRH,TLH的PCR扩增 |
| 4.1.7 toxR,TDH,TRH,TLH的PCR产物的电泳检测与纯化回收 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 毒力基因的检测结果 |
| 4.2.2 毒力基因的分布 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 副溶血弧菌两种铁调外膜蛋白psuA和pvuA的PCR检测 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验菌株 |
| 5.1.2 引物设计 |
| 5.1.3 细菌总DNA的提取 |
| 5.1.4 psuA和pvuA的PCR扩增 |
| 5.1.5 电泳检测扩增结果和扩增产物的回收纯化 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 铁调外膜蛋白psuA和pvuA基因的PCR扩增 |
| 5.2.2 铁调外膜蛋白psuA和pvuA基因的序列特征 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 副溶血弧菌的血清型与其菌苗抗原性的关系 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 供试菌株及培养 |
| 6.1.2 免疫原的制备 |
| 6.1.3 吞噬原的制备 |
| 6.1.4 溶壁微球菌的制备 |
| 6.1.5 供试鱼及饲养条件 |
| 6.1.6 免疫与采血 |
| 6.1.7 凝集抗体效价的测定 |
| 6.1.8 血液白细胞吞噬活性的测定 |
| 6.1.9 血清溶菌活力的测定 |
| 6.1.10 攻毒感染试验 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 凝集和交叉凝集抗体效价 |
| 6.2.2 攻毒试验结果 |
| 6.2.3 FKC对异育银鲫血液白细胞吞噬活性的影响 |
| 6.2.4 FKC对异育银鲫血清溶菌酶活性的影响 |
| 6.3 讨论 |
| 总结与展望 |
| 一、结论 |
| 二、展望 |
| 硕士期间发表的文章 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）鱼类常用免疫指标及其检测技术（论文提纲范文）
| 1 成活率 |
| 2 免疫器官重量[6, 16] |
| 2.1 头肾体指数 (Head Kidney Body Index, HKBI) |
| 2.2 脾脏体指数 (Spleen Body Index, SBI) |
| 3 免疫细胞活性 |
| 3.1 淋巴细胞转化率 |
| 3.2 红、白细胞数 |
| 3.3 白细胞吞噬指数 (PI) 和吞噬百分比 (PP) |
| 3.4 巨噬细胞活性 |
| 4 血液、体液免疫成分检测 |
| 4.1 体表粘液[17] |
| 4.2 抗体检测 |
| 4.3 溶菌酶 (LSZ) 活力溶菌酶活力计算公式:XLSZ= (A0-A) /A |
| 4.4 碱性磷酸酶 (AKP) 和酸性磷酸酶 (ACP) [17] |
| 4.5 超氧化物歧化酶 (SOD) |
| 4.6 酚氧化酶 |
| 4.7 血清补体活性测定[ 9, 20] |
（10）不同免疫刺激剂对水产动物免疫功能影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 养殖鱼虾类的免疫机制 |
| 2 免疫刺激剂的种类与特性 |
| 2.1 革兰氏阳性菌与菌体肽聚糖 |
| 2.2 革兰氏阴性菌与菌体LPS |
| 2.3 从放线菌中提取的短肽 |
| 2.4 酵母菌与菌体多糖 |
| 3 脂多糖(LIPOPOLYSACCHARIDE,LPS) |
| 3.1 LPS的生物学构造 |
| 3.2 LPS的生物学特性 |
| 3.3 致病菌LPS对鱼类的免疫原性 |
| 3.3.1 LPS的免疫原性研究 |
| 3.3.2 LPS的免疫原性与其化学组成的关系 |
| 3.3.3 LPS的免疫原性和免疫途径的关系 |
| 3.3.4 LPS中的交叉抗原性研究 |
| 3.4 LPS在鱼体内的吸收和分布 |
| 3.4.1 LPS的受体学研究 |
| 3.4.2 LPS在鱼体内的吸收和分布研究 |
| 3.5 LPS的佐剂性研究 |
| 3.6 LPS的丝裂原性研究 |
| 4 外膜蛋白(OUTER-MEMBRANEPROTEIN,OMP) |
| 4.1 外膜蛋白的生物学结构 |
| 4.2 外膜蛋白的生物学生理功能 |
| 4.3 外膜蛋白的致病作用研究 |
| 4.4 外膜蛋白的免疫学特性研究 |
| 5 脂多糖和外膜蛋白的提取工艺 |
| 5.1 LPS的提取方法 |
| 5.1.1 三氯醋酸法(Trichloroacetic Acid TCA) |
| 5.1.2 温酚水法 |
| 5.1.3 PCP法 |
| 5.1.4 高压处理法 |
| 5.1.5 DMSO法 |
| 5.2 OMP的提取方法 |
| 5.2.1 十二烷基肌氨酸法(Sarckosyl) |
| 5.2.2 Triton X-100法 |
| 5.2.3 其它方法 |
| 6 影响脂多糖和外膜蛋白表达的因素 |
| 6.1 环境条件 |
| 6.2 培养方式 |
| 6.3 培养温度 |
| 6.4 提取方法 |
| 6.5 培养时间 |
| 6.6 其它因素 |
| 7 免疫刺激剂在水产养殖中的应用 |
| 7.1 降低饵料系数,促进生长 |
| 7.2 提高水产动物的免疫力 |
| 8 免疫刺激剂的使用时间和添加剂量 |
| 9 免疫刺激剂的正确使用方法 |
| 10 存在的问题和未来展望 |
| 第二章 鱼类3种致病菌粗脂多糖(LPS)对斑点叉尾鮰的免疫原性 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 测定指标及方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 凝集抗体效价 |
| 2.2 血液和头肾中吞噬细胞的吞噬活性 |
| 2.3 血液和头肾中吞噬细胞的杀菌活性 |
| 3 讨论 |
| 第三章 极端嗜冷细菌保护性抗原对鲫鱼免疫功能的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试验鱼及供试菌株 |
| 1.1.2 免疫原的制备 |
| 1.1.3 金黄色葡萄球菌的制备 |
| 1.1.4 溶壁微球菌的制备 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 采血 |
| 1.2.2 抗菌活力及溶菌活力的测定 |
| 1.2.3 白细胞吞噬活性的测定 |
| 1.2.4 血清酚氧化酶活力的测定 |
| 1.2.5 白细胞数量的测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 保护性抗原对鲫鱼血液白细胞吞噬活性的影响 |
| 2.2 保护性抗原对鲫鱼血清溶菌酶活性、抗菌活力的影响 |
| 2.3 保护性抗原对鲫鱼血液中白细胞数量的影响 |
| 2.4 保护性抗原对鲫鱼血清中酚氧化酶活力的影响 |
| 3 讨论 |
| 第四章 虫草菌粉对日本沼虾免疫功能的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验用虾及饲养饲料 |
| 1.2 金黄色葡萄球菌的制备 |
| 1.3 溶壁微球菌的制备 |
| 1.4 攻毒菌液的制备 |
| 1.5 采血 |
| 1.6 抗菌活力及溶菌活力的测定 |
| 1.7 血淋巴白细胞吞噬活性的测定 |
| 1.8 血清酚氧化酶活力的测定 |
| 1.9 攻毒试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 血细胞吞噬活性的影响 |
| 2.2 血清抗菌活力、溶菌活力及酚氧化酶活力 |
| 2.3 攻毒试验 |
| 3 讨论 |
| 第五章 酵母免疫多糖对鲫鱼细胞吞噬和溶菌酶活性的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 酵母免疫多糖的来源 |
| 1.2 试验鱼及饲养饲料 |
| 1.3 金黄色葡萄球菌的制备 |
| 1.4 溶壁微球菌的制备 |
| 1.5 采血 |
| 1.6 溶菌酶活性的测定 |
| 1.7 白细胞吞噬活性的测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 酵母免疫多糖对鲫鱼血液白细胞吞噬活性的影响 |
| 2.2 酵母免疫多糖对鲫鱼血清和体表粘液溶菌酶活性的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ |
| 一、本研究中涉及的缩略语 |
| 二、本研究所用细菌的名称列表 |
| 硕士学习期间发表论文情况 |
| 致谢 |
四、哈维氏弧菌的血清型与菌苗抗原性的关系（论文参考文献）
- [1]花鲈哈维弧菌甲醛灭活疫苗的制备及其保护力研究[D]. 陈皓祥. 上海海洋大学, 2021(01)
- [2]哈维氏弧菌菌株的鉴定、基因分型及其灭活疫苗在大黄鱼中的免疫效果评价[D]. 杨阿敏. 浙江海洋大学, 2021
- [3]大黄鱼三种病原弧菌外膜蛋白交叉保护性抗原筛选[J]. 张崇文,毛芝娟,于涟. 生物工程学报, 2012(12)
- [4]哈维氏弧菌遗传多样性分析及毒力相关基因的检测[D]. 徐芝亮. 广东海洋大学, 2012(03)
- [5]射阳盐场地区鲫源嗜水气单胞菌分子流行病学研究[D]. 肖丹. 上海海洋大学, 2011(04)
- [6]食品中弧菌免疫学筛检方法建立研究[D]. 李研东. 吉林大学, 2009(08)
- [7]三种弧菌外膜蛋白K基因的克隆、表达及其潜在应用的研究[D]. 刘嘉. 中国海洋大学, 2009(11)
- [8]宁波地区副溶血弧菌血清型和部分毒力基因的分布研究[D]. 李香平. 华中农业大学, 2008(02)
- [9]鱼类常用免疫指标及其检测技术[J]. 刘青,赵恒寿. 渔业现代化, 2007(03)
- [10]不同免疫刺激剂对水产动物免疫功能影响的研究[D]. 刘勇. 华中农业大学, 2007(04)