一、髓母细胞瘤Caspase-3表达与细胞凋亡的关系（论文文献综述）
郑旭,王箫寒,关荣科,许玲玲,王茜[1]（2021）在《短链脂肪酸调控人髓母细胞瘤UW228-3细胞增殖、凋亡和侵袭作用的研究》文中指出目的研究菌群代谢产物短链脂肪酸——丙酸、丁酸对人髓母细胞瘤UW228-3细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。方法分别用10μmol/L丙酸和5μmol/L丁酸处理UW228-3细胞,通过HE染色观察细胞形态,MTT法测定细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,细胞划痕检测细胞侵袭,PCR和Western Blot检测凋亡相关基因和蛋白的表达。结果 10μmol/L丙酸和5μmol/L丁酸能够有效抑制UW228-3细胞增殖能力,增加细胞凋亡率,并显着抑制UW228-3细胞侵袭能力,提高Caspase-3基因以及蛋白表达,降低c-Myc、Bcl-2、Survivin基因以及蛋白的表达。结论菌群代谢产物丙酸、丁酸能够抑制人髓母细胞瘤UW228-3细胞增殖和侵袭,并促进细胞凋亡,具有治疗髓母细胞瘤的潜在价值。
魏素芬[2]（2021）在《新型Hedgehog通路抑制剂土荆皮乙酸抑制髓母细胞瘤生长的机制研究》文中进行了进一步梳理目的:Hedgehog（Hh）信号通路的异常活化在多种恶性肿瘤的发生及发展中起关键作用,尤其是髓母细胞瘤（Medulloblastoma,MB）。MB是最常见的儿童恶性脑肿瘤之一,其中,Shh亚型MB占所有病例的约30%。目前,MB的治疗仍以手术、全脑全脊髓放疗以及化疗为主。然而,治疗伴随的认知障碍等长期严重不良反应使得人们将目光转移到分子靶向治疗。Smoothened（SMO）是Hh通路上游的关键调控元件,因此SMO已成为Hh通路驱动的MB的新治疗靶点。目前,已有多种SMO抑制剂进入MB临床试验,并在治疗初期取得了良好疗效。然而,由于SMO或下游元件基因突变导致耐药性的出现及肿瘤复发,极大地限制了 SMO抑制剂的临床应用。因此,研发新型、可有效逆转耐药的Hh通路抑制剂显得尤为迫切。土荆皮乙酸（Pseudolaric acid B,PAB）是一种广谱抗肿瘤天然小分子化合物,然而目前关于PAB作用于Hh信号通路或用于治疗MB的相关研究未见报道。因此,本课题旨在探索PAB在体外及体内通过作用Hh信号通路抑制MB生长的抗肿瘤活性及其潜在分子机制。方法:在体外实验中,首先,我们通过MTT法从26个天然抗肿瘤小分子化合物中筛选出对人髓母细胞瘤细胞（DAOY）活性抑制效果最强的药物——PAB;接着,我们选用DAOY细胞、人肺腺癌细胞系（A549、H1299）、人胃腺癌细胞系（BGC-823、SGC-7901、AGS）、人乳腺癌细胞系（MDA-MB-231）、人宫颈癌细胞系（Hela）以及人肝癌细胞系（SMMC-7721、MHCC-97H）共十个肿瘤细胞系,western blotting 法检测细胞 Glil蛋白表达,给予指定浓度PAB处理后,MTT法检测细胞活力。然后,我们将DAOY细胞、原代颗粒神经元前体细胞（Granule Cell Progenitors,GNPs）、提取自Ptch1--自发MB小鼠的原代MB细胞以及3T3/GLI-luc细胞作为研究对象;给予指定浓度的PAB或SMO激动剂SAG处理,部分实验采用SMO抑制剂cyclopamine或vismodegib作为阳性对照;MTT法检测细胞活力,克隆形成实验或EdU掺入实验检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,western blotting法检测凋亡相关蛋白、Glil、cyclin Dl、N-myc以及SMO蛋白表达,肿瘤球形成实验检测细胞成球能力,荧光素酶报告基因检测试剂盒检测GLI转录活性,qRT-PCR法检测Hh通路靶基因表达,siRNA敲低SMO后采用MTT法检测细胞活力,western blotting法检测细胞Glil、cyclin Dl、N-myc及SMO蛋白表达。此外,我们构建了过表达SMO-GFP的NIH3T3细胞、过表达SMO-WT的293T细胞以及分别过表达SMO-WT、SMO-D477G、SMO-W539L的3T3/GLI-luc细胞,给予指定浓度PAB或SAG处理,部分实验采用vismodegib作阳性对照。此外,我们采用分子对接预测PAB与SMO的结合潜力,BODIPY-cyclopamine竞争结合实验检测PAB竞争结合SMO,CETSA实验检测PAB对SMO稳定性的影响,荧光素酶报告基因检测试剂盒检测Hh通路转录因子GLI转录活性,纤毛发生及SMO纤毛定位实验检测纤毛形成和SMO纤毛定位,western blotting检测Gli1蛋白表达。在体内实验中,我们采用提取自Ptch1+-自发MB小鼠的原代MB细胞,构建MB异位移植瘤BALB/c裸鼠模型;肿瘤体积达100 mm3时随机分为4组:溶剂空白对照组、PAB低剂量组（50 mg/kg）、PAB高剂量组（100 mg/kg）、vismodegib组（20 mg/kg）;隔日测量肿瘤体积及小鼠体重,持续给药18天后,取材留取肿瘤组织样本;称量肿瘤质量,western blotting检测凋亡和增殖相关蛋白以及Gli1蛋白,qRT-PCR检测Hh通路靶基因表达,免疫组化法检测Ki-67表达水平,H&E染色观察组织病理形态。结果:在体外实验中,PAB对DAOY细胞表现出极显着的细胞毒效应,而且与其他肿瘤细胞系相比,PAB以极低的浓度特异性杀伤Hh通路高度活化的DAOY细胞（IC50为0.83μM）,同时抑制其克隆形成,并上调其凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3及PARP cleavage水平,诱导细胞凋亡;与之相一致的是,PAB同样可抑制原代MB细胞的细胞活性,显着减少EdU 阳性细胞比例,并抑制其肿瘤球形成;然而,当我们采用siRNA敲低SMO后,DAOY细胞增殖能力降低,而且PAB无法有效抑制其增殖能力。在通路活性抑制效应方面,PAB可消除由SAG诱导的GLI荧光素酶报告基因以及Hh通路靶基因Gli1、cyclin D1、N-myc的转录活化;与此同时,PAB可下调DAOY细胞在SAG诱导前后的Gli1蛋白水平,并抑制其Gli1、cyclin D1的转录活性;同样地,PAB可抑制原代MB细胞Hh通路靶基因Gli1、cyclin D1、N-myc的转录水平;与之相一致的是,PAB可下调DAOY细胞及原代MB细胞Hh通路效应蛋白cyclin D1及N-myc的表达水平;而采用siRNA敲低原代MB细胞SMO后,PAB对其Gli1、SMO、cyclin D1及N-my蛋白的下调效应几乎消失。在通路靶点验证方面,虽然PAB对DAOY细胞总SMO蛋白水平并无影响,但是分子对接预测出PAB与SMO结合的两个位点,其中一个位点位于SMO跨膜区域（Transmembrane domain,TMD）的细胞外入口处,另一个则位于TMD的细胞内环区（Intracellular loops,ICLs）中;BODIPY-cyclopamine 竞争结合实验结果表明PAB可与BODIPY-cyclopamine竞争结合SMO TMD中的疏水口袋,而CETSA实验亦证实PAB干预可提高SMO蛋白稳定性;PAB还可抑制细胞纤毛形成,但对SMO纤毛定位并无影响。在逆转耐药方面,PAB对过表达SMO-WT、SMO-D477G及SMO-W539L的3T3/GLI-luc细胞GLI转录活性呈现出相似的抑制效应,同时能下调其Glil蛋白水平;此外,PAB对不同浓度梯度SAG处理下3T3/GLI-luc细胞的GLI转录活性的抑制效应几乎一致。在体内实验中,PAB显着抑制MB异位移植瘤的生长,且对小鼠体重无影响,同时上调其PARP cleavage、cleaved-casepase-3蛋白水平,肿瘤组织H&E染色片中亦观察到核凝集现象;此外,PAB还可下调肿瘤组织中PCNA及Ki-67表达水平;与体外实验相一致的是,PAB可下调肿瘤组织中Glil蛋白水平,并下调其Gli1、cyclin D1、N-myc的 mRNA 水平。结论:本课题探讨了天然小分子化合物土荆皮乙酸抑制髓母细胞瘤生长的潜在分子机制。我们发现PAB可通过抑制Hh通路活性,在体外及体内抑制MB的生长。此外,PAB还可克服由SMO突变引起的SMO抑制剂耐药。通过机制研究,我们发现PAB可同时结合SMO上的两个位点,并抑制纤毛形成,提示PAB可通过多个机制抑制Hh通路的活性。因此,PAB是治疗Hh通路驱动的MB的有效药物,尤其是对SMO抑制剂产生耐药的MB,为新型Hh靶向药物的研发提供了新方向。
张京顺[3]（2021）在《Slc7a5在大鼠多囊卵巢综合征模型卵巢上的表达及其功能研究》文中研究说明研究研究背景:多囊卵巢综合征（Polycystic ovary syndrome,PCOS）是一种累及全身多个系统,以影响育龄期女性生殖健康为主的异质性疾病,也是女性排卵性不孕的最主要病因之一。PCOS的病理表现主要为体内激素水平紊乱、卵泡发育受阻及排卵障碍、血清雄激素异常升高、胰岛素抵抗及肥胖等。该病不仅影响女性的生殖功能,而且此类患者发生2型糖尿病,心血管疾病,子宫内膜癌等远期并发症的风险明显增加。尽管近些年来PCOS的病因机制探讨较多,但由于其病因复杂多样,截止目前其发病机制仍不明确。氨基酸转运载体基因Slc7a5[solute carrier family 7,member 5]编码的产物为L-型氨基酸转运体1（L-type amino acid transporter 1,LAT1）,其主要功能是转运特定氨基酸,为细胞的生长提供原料。研究表明Slc7a5在癌变的细胞及组织中表达升高,包括乳腺癌、卵巢癌和子宫内膜癌等,提示其对肿瘤的快速生长和增殖起重要的作用。而且Slc7a5与肥胖,胰岛素抵抗及炎症反应也密切相关。在本课题组的前期研究中,通过转录组测序寻找在来曲唑诱导的大鼠PCOS模型的卵巢上差异表达的基因,首次发现Slc7a5在大鼠PCOS模型的卵巢上高表达,提示Slc7a5可能在PCOS的发生或病情进展中发挥一定的作用,而Slc7a5在卵巢相关功能,如卵泡发育、卵母细胞成熟以及类固醇激素合成中的作用尚无报道。研究目的:探究Slc7a5在大鼠PCOS模型卵巢上的表达特点及其在颗粒细胞中的功能,从而研究Slc7a5在PCOS发生及病情进展中可能发挥的作用,为PCOS的诊断及治疗提供新的实验数据和理论参考。研究方法及结果:1.Slc7a5在大鼠多囊卵巢综合征模型卵巢上的表达通过来曲唑连续灌胃23天构建大鼠PCOS模型。结果表明,造模结束后,PCOS组大鼠体重明显高于对照组（P<0.05）。通过阴道涂片行发情周期鉴定,对照组大鼠发情周期规律;PCOS组大鼠失去正常发情周期,持续处于发情间期。进一步通过ELISA方法测定大鼠血清激素水平。结果显示,与对照组相比,PCOS组大鼠血清中LH、T的浓度升高（P<0.05）,E2浓度降低（P<0.05）,FSH及TG的浓度两组之间没有明显差异。对卵巢组织进行HE染色观察卵巢形态改变,结果显示对照组卵巢可见多个黄体和各个发育阶段的卵泡,多层颗粒细胞排列整齐;PCOS组卵巢则呈典型多囊样的病理性改变,出现大量囊状扩张的卵泡,颗粒细胞层明显减少。通过免疫组化检测Slc7a5在卵巢上的表达情况,结果可见,Slc7a5在颗粒细胞、卵泡膜细胞及卵巢间质均有表达,且PCOS组Slc7a5表达水平高于对照组（P<0.05）。进一步通过荧光定量PCR及Western blot检测Slc7a5的表达水平。结果表明与对照组相比,PCOS组卵巢组织中Slc7a5 mRNA及蛋白表达水平均明显升高（P<0.05）。2.Slc7a5对大鼠卵巢颗粒细胞类固醇激素合成的影响分离培养原代大鼠颗粒细胞并转染Slc7a5的小干扰RNA（si RNA）及过表达质粒,从而探究Slc7a5对颗粒细胞类固醇激素合成的影响。通过荧光定量PCR及Western blot检测类固醇激素合成相关酶Star,Cyp11a1,Hsd3β1基因及蛋白的表达情况。结果表明干扰Slc7a5后,三种酶表达均降低,但只有Cyp11a1表达降低有统计学意义（P<0.05）;而过表达Slc7a5后,三种酶表达均明显升高（P<0.05）。进一步用ELISA方法检测颗粒细胞培养上清液中E2及P的水平。结果表明干扰及过表达Slc7a5后并没有改变颗粒细胞培养上清液中E2及P水平（P>0.05）。为了探究雄激素对颗粒细胞Slc7a5表达的影响,在颗粒细胞的培养基中添加睾酮培养48小时后,通过荧光定量PCR及Western blot检测Slc7a5的表达水平。结果表明,Slc7a5的表达明显升高（P<0.05）。3.Slc7a5对大鼠卵巢颗粒细胞活力及凋亡的影响及机制在显微镜下观察和CCK8试验检测Slc7a5表达改变对颗粒细胞活力的影响。结果表明,干扰Slc7a5后细胞活力没有明显改变（P>0.05）;而过表达Slc7a5后细胞活力明显降低（P<0.05）。通过流式细胞术检测对细胞凋亡及细胞周期的影响。结果表明,干扰Slc7a5后颗粒细胞的凋亡率没有明显改变（P>0.05）;而过表达Slc7a5后颗粒细胞的凋亡率明显增加（P<0.05）,细胞S期明显缩短（P<0.05）。为了探究Slc7a5促进颗粒细胞凋亡的相关机制,在过表达Slc7a5后检测了凋亡相关基因和蛋白的表达。结果表明,在颗粒细胞过表达Slc7a5后,凋亡相关基因Tnf-α,Caspase-3及Caspase-8表达明显增加（P<0.05）;凋亡相关蛋白TNF-α,Caspase-3,Cleaved-Caspase 3,Caspase-8及Cleaved-Caspase 8的表达也明显增加（P<0.05）。进一步检测了颗粒细胞过表达Slc7a5后细胞Caspase-3及Caspase-8的活性。结果表明,细胞内Caspase-3及Caspase-8的活性明显增加（P<0.05）。为了探究Slc7a5是否通过增加颗粒细胞的氧化应激,从而促进细胞凋亡,检测了颗粒细胞过表达Slc7a5后的ROS及超氧化物阴离子水平。结果表明,其ROS及超氧化物阴离子水平明显降低（P<0.05）。为明晰细胞内ROS及超氧化物阴离子水平降低的机制,检测了抗氧化酶相关基因及蛋白（Sod2,Hmox1,xCT）的表达。结果表明,颗粒细胞过表达Slc7a5后Sod2,Hmox1,xCT表达水平明显升高（P<0.05）。4.Slc7a5下游基因的筛选及其在颗粒细胞中的功能研究为了进一步探究Slc7a5在颗粒细胞中的作用机制,本研究在颗粒细胞上过表达SLC7A5后行转录组测序。通过测序发现颗粒细胞过表达Slc7a5后共有1943个差异表达的基因,其中上调998个,下调945个。通过KEGG及GO富集分析发现差异基因主要与癌症相关通路,TNF信号通路,细胞增殖,蛋白质结合及炎症反应等通路相关。通过转录组测序及进一步的验证,选定Mgst3作为Slc7a5的下游靶基因。本试验研究发现颗粒细胞过表达Slc7a5后,Mgst3的表达降低,接下来研究了Mgst3表达降低对颗粒细胞的影响。通过CCK8试验检测颗粒细胞干扰Mgst3后的细胞活力,结果表明,细胞活力明显降低（P<0.05）。通过流式细胞术检测颗粒细胞干扰Mgst3后的细胞凋亡及细胞周期情况。结果表明,颗粒细胞干扰Mgst3后,细胞的凋亡率增加（P<0.05）,细胞S期明显缩短（P<0.05）。为了探究Mgst3促进颗粒细胞凋亡的相关机制,通过荧光定量PCR,Western blot检测了凋亡相关基因及蛋白的表达。颗粒细胞干扰Mgst3后,凋亡相关基因Tnf-α,Caspase-3及Caspase-8表达量均明显增加（P<0.05）;凋亡相关蛋白TNF-α,Caspase-3,Cleaved-Caspase 3,Caspase-8及Cleaved-Caspase 8的表达量也明显增加（P<0.05）。进一步检测了颗粒细胞干扰Mgst3后细胞Caspase-3及Caspase-8的活性,结果表明,细胞内Caspase-3及Caspase-8的活性明显增加（P<0.05）。研究结论:1.在大鼠PCOS模型的卵巢上Slc7a5的表达明显升高。2.在细胞水平,睾酮能够促进颗粒细胞Slc7a5的表达。3.Slc7a5表达升高能够影响颗粒细胞类固醇激素合成相关酶的表达。4.Slc7a5表达升高还能够通过降低Mgst3的表达,降低细胞活力,激活凋亡相关通路,促进颗粒细胞凋亡,从而参与PCOS发生。
衣志爽,王植海,李明,周清安,杨保胜[4]（2021）在《人脐带间充质干细胞来源外泌体抑制髓母细胞瘤Daoy细胞增殖并促其凋亡》文中指出背景:间充质干细胞能够产生大量的与其生物学功能相似的外泌体,但间充质干细胞来源外泌体对髓母细胞瘤Daoy细胞的影响仍不清楚。目的:探讨人脐带间充质干细胞来源外泌体对髓母细胞瘤Daoy细胞增殖、凋亡的影响以及可能机制。方法:分离、培养人脐带间充质干细胞,提取第4代人脐带间充质干细胞来源外泌体,Western blot检测外泌体标志蛋白CD9和CD81的表达。将人脐带间充质干细胞来源外泌体与Daoy细胞共培养96 h,采用流式细胞术、克隆形成实验检测Daoy细胞的增殖情况;流式细胞术检测Daoy细胞的凋亡情况;Western blot检测凋亡相关蛋白的表达水平。结果与结论:Western blot检测人脐带间充质干细胞来源外泌体CD9和CD81呈阳性表达。与对照组比较,人脐带间充质干细胞来源外泌体抑制Daoy细胞增殖和克隆形成（P <0.05,P <0.01）;促进Daoy细胞凋亡（P <0.01）;凋亡相关蛋白Cyclin D1和Bcl-2表达下调（P <0.05）,Caspase-3表达上调（P <0.01）。结果表明,人脐带间充质干细胞来源外泌体可能通过调节细胞周期以及凋亡相关蛋白表达来抑制髓母细胞瘤Daoy细胞的增殖,并促进其凋亡。
魏琼[5]（2021）在《EBF3在儿童髓母细胞瘤中的表达及意义》文中指出目的:早期B细胞因子（EBF）是一组DNA结合转录因子,具有非典型的锌指和螺旋-环-螺旋结构域,在发育过程中具有高度进化保守性,并且对于维持成体神经元中的神经元特性是必需的。在人类基因组中,EBF3基因可以抑制负责细胞增殖和存活的基因的表达。近些年在胃癌、子宫内膜癌和直结肠癌等恶性肿瘤中均有相关研究例证EBF3 DNA启动子区域存在的甲基化,致使主流认为EBF3基因的失活阻断正常的发育途径,导致未分化的祖细胞的积累和扩增,是进而导致肿瘤发生的原因,EBF3因而被认为可能成为肿瘤潜在的抑制基因之一。儿童髓母细胞瘤系胚胎性肿瘤,恶性程度高,以侵袭性及高转移率为特征,EBF3与肝癌、胃癌等肿瘤之间的关系已有大量的研究,但EBF3甲基化和其生物学功能在髓母细胞瘤中尚鲜少调查研究,有进一步研究的价值。为了探究EBF3基因在儿童髓母细胞瘤中的表达情况及意义,我们通过用RT-PCR及Western blot analysis测定比较分析髓母细胞瘤肿瘤组织与相对正常脑组织中EBF3基因的表达差异,并对不同表达状态下的髓母细胞瘤细胞系进行细胞功能实验分析,进一步探究其意义。方法:第一部分:用RT-PCR及Western blot analysis测定髓母细胞瘤肿瘤组织与正常脑组织EBF3基因表达差异;第二部分:构建不同表达状态Daoy细胞模型（Si RNA/pc DNA）,进行功能分析（细胞增殖、凋亡、细胞迁移实验）;第三部分:用Methylation-specific PCR验证检测Daoy细胞与髓母细胞瘤组织中是否存EBF3的启动子甲基化情况。结果:第一部分:髓母细胞瘤肿瘤组织与相对正常脑组织相比,EBF3基因的表达存在明显差异,无论在EBF3转录层面还是EBF3蛋白表达层面均表现为在髓母细胞瘤中呈高表达状态。第二部分:当敲低EBF3基因表达时明显抑制Daoy细胞增殖活动,并且抑制Daoy细胞迁移活动;当EBF3基因过表达时几乎对Daoy细胞增殖活动无影响,而却明显提升Daoy细胞迁移率;在流式凋亡实验中,当敲低EBF3基因表达时明显促进Daoy细胞凋亡,而当EBF3基因过表达时同样明显促进Daoy细胞凋亡,但两者之间尚存明显差异,si RNA组较过表达组表现出更加促进凋亡的趋势;在凋亡蛋白相关实验中,提示我们EBF3低表达存在明显促进细胞凋亡趋势。第三部分:EBF3在髓母细胞瘤中不存在下调,反而呈过表达状态,经过Methylation-specific PCR验证,无论是髓母细胞瘤组织中还是Daoy细胞系中都不支持已有的相关启动子甲基化的研究结果。结论:EBF3基因在髓母细胞瘤中呈高表达状态。当敲低EBF3基因表达时对髓母细胞瘤细胞系存在明显的抑制增殖、迁移和促进凋亡的作用。此外我们通过MSP验证了,无论是髓母细胞瘤组织中还是Daoy细胞系中都不支持已有的相关启动子甲基化的研究结果。
王永利[6]（2021）在《MiR-21通过PI3K/AKT信号通路影响髓母细胞瘤的增殖、凋亡、迁移和侵袭》文中研究说明目的:Micro RNA在肿瘤发生发展的方方面面都起着至关重要的生物学作用。先前大量的研究表明,在众多癌症中其中包括髓母细胞瘤,miR-21的水平都是显着增加的。但是,miR-21在髓母细胞瘤具体的作用机制尚未报道。因此本次研究的目的为了探索miR-21在髓母细胞瘤DAOY细胞的作用及其对相关信号通路的影响。方法:通过脂质体TM2000将miR-21 inhibitor、miR-21 inhibitor NC和miR-21 mimic转染至DAOY细胞。48h后,应用q RT-PCR法评估miR-21的表达效果;联合应用CCK8法和平板细胞克隆形成实验,相互验证并检测不同转染组的细胞增殖情况;应用Annexin V-FITC法检测不同转染组的细胞坏死和凋亡情况;联合应用Transwell实验和细胞划痕实验,相互验证并检测不同转染组的细胞侵袭能力和细胞迁移能力。同时应用Western blot检测不同转染组的PTEN/PI3K/AKT的激活情况,并观察miR-21对PI3K/AKT信号通路的影响。结果:与inhibitor NC组相比,miR-21 mimic转染后的DAOY细胞的增殖、细胞迁移率和侵袭力增加,而凋亡则明显减少。而miR-21 inhibitor转染后的DAOY细胞的增殖、迁移率和侵袭力明显降低,而凋亡则明显增加。在miR-21 mimic转染后的DAOY细胞中,PI3K、AKT表达水平显着增加,而PTEN、Caspase-3和Caspase-9蛋白质的水平显着下降。同时,在miR-21 inhibitor转染后的DAOY细胞中,PI3K、AKT表达水平下降,PTEN、Caspase-3和Caspase-9蛋白质的水平则明显上升。结论:1.在髓母细胞瘤中呈高表达的miR-21,能够促进其增殖、迁移和侵袭,抑制其坏死和凋亡。2.在髓母细胞瘤中miR-21通过调控PI3K/AKT信号通路的表达,促进其增殖、迁移和侵袭,抑制其坏死和凋亡。
李运雷[7]（2021）在《MRT68921 HCl抑制ULK1诱导白血病细胞死亡及发挥抗肿瘤作用》文中指出背景急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）是源于髓系造血干/祖细胞恶性增殖的疾病。AML是一大类造血干细胞恶性克隆性疾病,临床表现为贫血、出血、感染、发热、脏器浸润和代谢异常等等,多数病例病情急重,预后不良,如不及时治疗常可危及生命。多个回顾性研究表明,60岁以下患者的五年生存率约为40%,而60岁以上的患者,其五年生存率约为5%-15%。随着我们社会老龄化程度日益加深,AML已成为严重威胁我国国民生命健康的一种凶险性疾病。目前,除了全反式维甲酸联合砷剂通过诱导分化的方式在治疗急性早幼粒白血病（M3型）中取得了革命性作用之外,对于其它亚型AML的治疗,仍是以阿糖胞苷和柔红霉素的联合化疗为主。然而,由于化疗药物的不良反应限制了标准疗法在老年患者中的使用,因此亟需寻找AML治疗新靶点以及开发新型药物。目的本项目研究ULK1在AML患者中的表达与预后联系,并阐明ULK1在AML细胞中的作用,以此确定ULK1在AML中能否作为新的治疗靶点,为后续将ULK1抑制剂应用于临床治疗奠定理论基础。方法1、通过TCGA数据库分析ULK1在AML患者中的表达水平以及与不良预后的联系;2、Western blot分析ULK1蛋白水平以及q PCR检测m RNA水平AML细胞系和原代AML细胞中的表达情况;3、使用ULK1的三种特异性抑制剂SBI-0206965、MRT68921 HCl和MRT67307 HCl处理AML细胞系,以及使用慢病毒在细胞中敲降ULK1,分析ULK1抑制时的细胞活力变化;4、通过显微镜观察ULK1抑制诱导的细胞死亡形态,western blot检测细胞死亡时的细胞内分子通路,以及分析MRT68921 HCl处理细胞后的自噬流变化,阐明ULK1抑制诱导AML细胞死亡的分子机制;5、构建稳转luciferase的THP-1细胞株,通过尾静脉注射THP-1 luciferase细胞构建AML小鼠模型,使用ULK1抑制剂MRT68921 HCl治疗,分析小鼠的肿瘤负荷、生存率以及肿瘤细胞在脾脏、肝脏和骨髓中的侵袭程度;6、收集AML病人血液样本,分离原代AML细胞,分析MRT68921 HCl处理后的细胞活力变化。结果1、ULK1和ULK2在AML患者中的表达量比正常人高,且与不良预后相关;2、ULK1在多种白血病细胞系和原代AML细胞中高表达,而没有检测到ULK2的明显表达;3、ULK1的三种抑制剂MRT68921 HCl、SBI-0206965和MRT67307 HCl均可以诱导白血病细胞死亡,且MRT68921 HCl的效果最佳;敲降ULK1也会诱导AML细胞死亡;4、MRT68921 HCl诱导THP-1细胞死亡是通过caspase-3-GSDME途径,诱导HL60细胞死亡是通过caspase-3-PARP通路,均与自噬、ROS和NADPH无关;5、MRT68921 HCl治疗AML模型小鼠后,显着减少了小鼠体内肿瘤负荷、延长了小鼠生存期,有效抑制了肿瘤细胞在脾脏、肝脏和骨髓中的侵袭程度;6、MRT68921 HCl对原代AML细胞也具有杀伤作用。结论药理性和遗传性抑制ULK1,均诱导了AML细胞死亡,且与自噬途径无关。ULK1抑制剂MRT68921 HCl在AML模型小鼠中减少肿瘤负荷、延长了生存期以及减缓了肿瘤细胞的侵袭程度,预示着ULK1以及ULK1商品化抑制剂有潜力成为AML治疗的新靶点和新药物。
毕淑宁[8]（2020）在《Wee1抑制剂AZD1775抑制食管鳞癌生长和转移及分子机制研究》文中提出实验背景:食管癌（Esophageal cancer,EC）是指发生在食管上皮的恶性消化道肿瘤,其中最常见的病理类型是食管鳞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）和食管腺癌（Esophageal adenocarcinoma,EAC）。最新的研究数据表明,在全球癌症患者中,EC新发病率和死亡率分别位居第7位和第6位。中国是食管癌高发区之一,发病患者中95%以上被确诊为ESCC。由于ESCC存在着确诊时间较晚、易发生转移和预后易复发,尽管使用手术切除或同步放化疗等多种治疗方法,但ESCC患者的5年总生存率仍低于20%,且患者生存质量未得到明显提高。因此,迫切需要从ESCC发生、发展过程中寻找新的治疗方法来提高ESCC患者的预后生存率。AZD1775是一种已进入临床试验,且可口服的小分子吡唑类化合物,该化合物可以高度特异性地抑制Wee1激酶活性。Wee1是参与细胞周期检查点的重要激酶之一,尤其对G2/M期发挥着重要作用。AZD1775通过抑制Wee1激酶活性而抑制CDK1的酪氨酸15位点磷酸化,进而抑制肿瘤细胞内损伤DNA的修复。研究表明AZD1775对乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、神经胶质瘤、肝癌等癌症中具有较好地抗肿瘤作用。但是,到目前为止,关于AZD1775对ESCC的作用未见报道。实验目的:本课题以ESCC细胞为实验研究对象,探讨Wee1选择性抑制剂AZD1775在体外和体内对ESCC细胞的作用及其分子机制研究。实验方法:采用免疫组化法检测Wee1在ESCC临床肿瘤组织中的表达情况,采用Western blotting和q RT-PCR法检测Wee1在ESCC细胞中的表达。Western blotting和免疫荧光检测AZD1775对ESCC细胞（KYSE150、EC109）中p-CDK1Y15、p-HH3S10、γH2A.X蛋白表达的影响;PI单染检测AZD1775对ESCC细胞周期分布情况的影响;MTT法检测AZD1775对ESCC细胞在体外增殖的影响,以及结合Chou-Talalay联合指数计算法检测AZD1775与5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil,5-FU）或顺铂（Cisplatin,CDDP）联用是否对ESCC细胞生长具有协同作用;平板克隆及软琼脂克隆检测AZD1775对ESCC细胞克隆形成的作用;Annexin V-FITC/PI双染检测AZD1775对ESCC细胞发生凋亡的影响;Western blotting检测AZD1775对ESCC细胞中Bcl-2、Bax、Bcl-XL、XIAP、Survivin、PARP、Caspase-3、Cytochrome c、AIF蛋白表达的影响;Rh123/Hoechst 33342双染检测AZD1775对ESCC细胞内线粒体膜电位变化的影响;Wound healing及Transwell实验检测AZD1775对ESCC细胞迁移和侵袭的作用;Western blotting检测AZD1775对ESCC细胞中蛋白MMP-2和MMP-9表达的影响。使用慢病毒表达sh RNA敲低ESCC细胞中Wee1,并检测对ESCC细胞的增殖、克隆形成、迁移及侵袭的影响;Western blotting检测Wee1 sh RNA对ESCC细胞中p-CDK1Y15、p-HH3S10、γH2A.X、MMP-2和MMP-9蛋白表达的影响。建立KYSE150细胞的裸鼠皮下实体瘤模型,检测AZD1775是否抑制ESCC细胞在裸鼠体内生长;免疫组化检测AZD1775对裸鼠肿瘤组织中增殖相关蛋白Ki67、Wee1相关蛋白p-CDK1Y15、DNA修复相关蛋白p-HH3S10、DNA损伤相关蛋白γH2A.X表达的影响;H&E染色检测裸鼠肿瘤组织中ESCC细胞的形态变化;Western blotting检测AZD1775对裸鼠肿瘤组织中Wee1、p-CDK1Y15、p-HH3S10、γH2A.X蛋白表达的影响。建立KYSE150细胞的裸鼠肺转移模型,检测AZD1775对ESCC细胞在裸鼠体内发生肺转移的影响。实验结果:1.免疫组化检测得出Wee1在ESCC细胞系和临床肿瘤标本中存在高表达。2.使用不同浓度的AZD1775作用ESCC细胞（KYSE150和EC109）72 h,MTT法检测发现,AZD1775对KYSE150和EC109均有显着地抑制作用,IC50分别为0.55μM、0.58μM;此外,平板克隆和软琼脂克隆形成实验结果表明,随着AZD1775药物浓度增大,可明显抑制ESCC细胞形成。3.Annexin V-FITC/PI双染检测结合流式细胞仪检测结果发现,AZD1775呈浓度和时间依赖性诱导ESCC细胞发生凋亡;Western blotting检测显示,AZD1775呈浓度依赖促进Cleaved PARP、Cleaved Caspase-3、及促凋亡蛋白的表达,降低Caspase-3、及抗凋亡蛋白XIAP、Survivin、Bcl-XL、Bcl-2的表达。4.Rh123/Hoechst33342双染结合高内涵检测发现,随着AZD1775浓度逐渐增大,ESCC细胞的线粒体膜电位逐渐降低;此外,Western blotting检测胞浆蛋白提取物发现,AZD1775呈时间依赖性诱导cytochrome c和AIF从线粒体释放到细胞浆中。5.Wound healing和Transwell迁移实验检测发现,250 n M的AZD1775可明显抑制KYSE150和EC109细胞迁移;此外,Transwell迁移实验检测表明,250 n M的AZD1775显着抑制KYSE150和EC109细胞侵袭而且,Western blotting检测显示,AZD1775呈浓度依赖性抑制MMP-2、MMP-9蛋白表达。6.纳摩尔浓度的AZD1775对两种ESCC细胞（KYSE150和EC109）中Wee1激酶均有较强的抑制作用;明显抑制p-CDK1Y15蛋白表达,而促进p-HH3S10、γH2A.X蛋白表达;此外,AZD1775可显着抑制ESCC细胞G2/M期阻滞作用。7.使用慢病毒表达sh RNA敲低Wee1能显着抑制ESCC细胞的增殖、迁移、侵袭,以及MMP-2、MMP-9蛋白表达。8.敲低Wee1明显抑制ESCC细胞中p-CDK1Y15蛋白表达,而促进p-HH3S10、γH2A.X蛋白表达。9.MTT法结合Chou-Talalay联合指数计算法检测发现,AZD1775与5-FU、CDDP联用,具有较好的协同抑制ESCC细胞的增殖作用;此外,台盼蓝染色计数法检测显示,与单药AZD1775、5-FU或CDDP组相比较,AZD1775（0.25μM）与5-FU（250μM）或CDDP（10μM）联用显着地增加了ESCC细胞死亡比例;而且,Western blotting检测结果显示,ZD1775（0.25μM）与5-FU（250μM）或CDDP（10μM）联用明显促进Cleaved PARP、Cleaved Caspase-3蛋白表达。10.KYSE150细胞裸鼠皮下移植瘤模型检测结果发现,60 mg/kg的AZD1775能明显抑制ESCC细胞在裸鼠体内的生长;免疫组化检测结果显示,与对照组相比,AZD1775能显着降低肿瘤组织中p-CDK1Y15、以及细胞增殖相关蛋白Ki67的表达,而促进p-HH3S10、γH2A.X蛋白表达。11.Western blotting检测结果表明,与对照组相比较,AZD1775显着抑制裸鼠肿瘤组织中的p-CDK1Y15蛋白表达,p-HH3S10、γH2A.X蛋白表达显着增加。12.KYSE150细胞裸鼠肺转移模型检测结果发现,与对照组相比较,60 mg/kg的AZD1775能显着抑制ESCC细胞在裸鼠体内发生肺转移。实验结论:综上所述,实验结果表明Wee1在ESCC中高表达。Wee1选择性抑制剂AZD1775可有效地抑制ESCC细胞在体外的增殖、迁移和侵袭,并能有效地抑制在体内的生长及转移。此外,AZD1775可显着地增强ESCC细胞对一线化疗药5-FU及CDDP的敏感性。基于以上研究,AZD1775可能是治疗ESCC的潜在靶点药物,值得进一步临床试验。
闻乃妍[9]（2019）在《溴结构域抑制剂JQ1通过VEGF/PI3K/AKT信号通路促进脑胶质瘤干细胞周期阻滞和凋亡》文中研究指明背景:恶性脑胶质瘤是最常见并且致死率最高的颅内恶性肿瘤,GBM在脑胶质瘤中恶性程度最高。恶性脑胶质瘤的治疗方法包括手术治疗,放疗、化疗等,但是效果并不理想,多数患者的生存期并没有明显的改变,尤其是GBM病人,五年生存率不超过5%,因此亟待找寻更有效地治疗脑胶质瘤的方法。近年来,许多文献报道BRD4蛋白已成为多种癌症的治疗靶点,并且Brd4溴结构域抑制剂JQ1在多种癌症中发挥了良好的抗癌作用。但是针对Brd4和JQ1如何调控恶性脑胶质瘤进程的研究还比较少,作用和分子机制尚不清楚。此外,大部分现有的针对GBM的文献报道主要利用的是脑胶质瘤细胞系如U87、U251等为实验研究对象而不是GSCs。随着对脑胶质瘤的研究不断深入,GSCs越来越被认为是驱动脑胶质瘤发生发展的动力,并且是脑胶质瘤对于治疗药物产生耐药抵抗的元凶。GSCs具有很强的自我更新能力,多向分化潜能和极强的致瘤能力,这使得恶性脑胶质瘤具有高度的异质性。因此,本研究利用GSCs进行实验研究使其结果更具有价值和说服力。目的:选择GSCs作为实验对象,利用JQ1或特异性靶向Brd4的si RNA抑制BRD4蛋白表达及功能发挥,通过体内外实验检测JQ1或si Brd4对GSCs活力、增殖能力、自我更新能力、细胞周期和细胞凋亡的影响,并探讨其发挥作用的机制,初步探讨JQ1与替莫唑胺（Temozolomide,TMZ）联合用药的作用效果。方法:采用JQ1处理的体外实验分为对照组及不同浓度的JQ1组;采用si Brd4处理的体外实验分为对照组、NC组及si Brd4组（si Brd4-475,si Brd4-1648,si Brd4-3820）。（1）证明Brd4是恶性脑胶质瘤潜在的治疗靶点:利用TCGA数据库分析GBM中Brd4拷贝数;免疫组织化学染色检测各级别人脑胶质瘤组织标本中的BRD4蛋白表达。（2）JQ1或si Brd4对于GSCs细胞活力、细胞增殖、干细胞自我更新能力的作用:利用CCK8实验检测JQ1或si Brd4对GSCs细胞活力的影响;利用细胞生长计数实验、软琼脂克隆形成实验检测JQ1或si Brd4对GSCs细胞增殖能力的影响;利用神经球成球能力实验检测JQ1或si Brd4对GSCs自我更新能力的影响。（3）JQ1或si Brd4对于GSCs细胞周期和凋亡的影响:利用PI流式细胞术检测JQ1或si Brd4对GSCs细胞周期的影响;利用Annexin V-PI流式细胞术和Tunel染色检测JQ1或si Brd4对GSCs细胞凋亡的影响。（4）JQ1影响GSCs的作用机制及信号通路:采用GO分析（gene set enrichment analysis）和KEGG（Kyoto encyclopedia of Genes and Genomes）明确差异基因的表达以及JQ1对GSCs富集的信号通路;利用q-PCR实验以及Western blotting实验检测信号通路关键基因的m RNA和蛋白表达水平。（5）JQ1对GSCs移植瘤小鼠的治疗作用:BALB/c裸鼠皮下注射1×107个CSC2078细胞,构建GSCs移植瘤小鼠模型。利用JQ1按照50mg/kg的剂量对小鼠进行腹腔注射,每日一次,一共进行17天;对小鼠肿瘤组织的体积进行统计分析;对小鼠肿瘤组织切片进行Tunel荧光染色检测凋亡;利用HE染色及免疫组织化学染色检测肿瘤组织细胞形态及各种增殖、侵袭、周期、凋亡等标志物表达;利用Western blotting实验检测PI3K/AKT通路中重要蛋白的表达。（6）JQ1与TMZ联合用药作用:利用Western blotting检测转染si Brd4对CSC2078细胞MGMT m RNA及蛋白表达水平的影响;利用CCK8实验分别检测JQ1、TMZ、JQ1与TMZ联合用药对CSC2078细胞活力的影响;利用Compu Syn软件计算JQ1与TMZ联合用药的CI指数;利用PI流式细胞术检测JQ1、TMZ、JQ1与TMZ联合用药对CSC2078细胞周期的影响;利用Annexin V-PI流式细胞术检测JQ1、TMZ、JQ1与TMZ联合用药对CSC2078细胞凋亡的影响。结果:（1）TCGA数据库分析发现,GBM中的Brd4拷贝数明显高于星形细胞瘤;不同病理级别的人脑胶质瘤组织标本免疫组织化学染色结果显示,在III级和IV级人脑胶质瘤组织标本中普遍存在Brd4高表达的现象。（2）JQ1或si Brd4抑制GSCs活力,细胞增殖和自我更新能力,促进GSCs细胞周期阻滞和凋亡。（3）RNA-Seq结果提示JQ1作用GSCs后,显着抑制PI3K/AKT信号通路上游VEGF表达水平;JQ1与VEGFR2的酪氨酸激酶抑制剂Linifanib联合用药进一步证明JQ1通过VEGF/PI3K/AKT信号通路对GSCs发挥抗肿瘤作用;JQ1对该信号通路下游周期相关基因的影响:c-Myc,Cyclin D1,RB和E2F1表达降低,P21和P27表达升高;JQ1对该信号通路下游凋亡相关基因中促凋亡基因表达增多,抑制凋亡基因表达减少,DNA损伤标志物γH2AX表达增多。（4）体内实验结果显示JQ1可有效抑制脑胶质瘤干细胞移植瘤小鼠肿瘤体积的增长;JQ1治疗组肿瘤组织中的c-Myc,PCNA,BCL-2以及MMP蛋白表达减少,BAX蛋白表达增多;PI3K/AKT信号通路关键因子蛋白表达与体外细胞实验结果相一致。（5）沉默Brd4表达抑制了MGMT的m RNA和蛋白表达水平;与TMZ单用药组和JQ1单用药组相比,TMZ和JQ1联合用药组对GSCs活力的抑制作用、促进细胞周期阻滞和凋亡作用更为显着。结论:（1）体内外实验证明,抑制Brd4表达或功能可通过VEGF/PI3K/AKT信号通路促进GSCs周期阻滞和凋亡。（2）JQ1通过影响Brd4功能降低MGMT表达水平,进而增强TMZ抗肿瘤作用。（3）Brd4是恶性脑胶质瘤的有效治疗靶点。
程超[10]（2019）在《DLC2通过调节TAp73α/TAp73β表达比抑制胶质瘤发生的机制研究》文中研究指明目的通过研究TAp73α/TAp73β和DLC2在胶质瘤标本及胶质瘤细胞系中的表达情况、两者相关性以及发挥的作用,探讨胶质瘤中DLC2通过调控TAp73α/TAp73β从而发挥抑癌作用的机制。方法1.WB（Western Blot）检测不同级别胶质瘤样本及胶质瘤细胞系（A172,T98G,U251,Shg44）中TAp73α、TAp73β的表达,验证它们与胶质瘤级别及胶质瘤细胞系克隆形成的相关性;2.在U251和Shg44细胞中过表达TAp73β,流式细胞学技术检测细胞凋亡变化,WB检测凋亡相关蛋白Caspase3、BAX等变化;在A172及T98G细胞中过表达TAp73α、TAp73β,检测对细胞克隆形成的影响;WB检测Caspase3、BAX等蛋白变化;3.WB、RT-q PCR检测不同级别胶质瘤样本与正常脑组织中DLC2蛋白及m RNA的表达,基于REMBRANDT和TCGA数据集分析不同级别胶质瘤中DLC2蛋白及m RNA的表达;同时,分析DLC2与TAp73α、TAp73β表达,以及TAp73α/TAp73β比值的相关性;4.WB检测胶质瘤细胞系（A172,T98G,U251,Shg44）中DLC2的表达;在U251及Shg44中过表达DLC2后,流式细胞学技术检测细胞凋亡的改变;将DLC2过表达的U251及Shg44注射至裸鼠皮下,构建胶质瘤异位肿瘤模型,对比对照组与DLC2过表达组肿瘤的生长情况;将A172及T98G细胞敲减DLC2后,细胞克隆实验检测细胞集落形成情况;5.WB检测U251及Shg44细胞过表达DLC2后TAp73α、TAp73β及TP73下游靶基因Caspase3,BAX的表达;WB检测A172及T98G细胞敲减DLC2后TAp73α、TAp73β蛋白水平改变,RT-q PCR检测TAp73αm RNA变化;将MG132及不同量Myc-DLC2（0,0.5,1.0,1.5μg）处理U251及Shg44细胞,IP检测DLC2对内源性TAp73α的泛素化降解情况;将MG132,His-Ub,Flag-TAp73α及不同量Myc-DLC2（0,0.5,1.0,1.5μg）处理293T细胞,IP检测DLC2对外源性TAp73α的泛素化调控;6.在U251及Shg44中转染Myc-DLC2,IP检测DLC2与内源性TAp73α、TAp73β相互作用情况;在293T细胞中分别或联合转染Myc-DLC2,Flag-TAp73α,His-TAp73β,IP检测DLC2与外源性TAp73α、TAp73β结合情况;将Myc-DLC2,Myc-DLC2-d SAM及TAp73α转染293T细胞后,IP检测DLC2、SAM区域缺失的DLC2突变体与TAp73α相结合情况;用MG132、Myc-DLC2、Myc-DLC2-d SAM处理U251及Shg44细胞,IP检测DLC2及DLC2突变体对内源性TAp73α的泛素化降解情况;用MG132、His-Ub、Flag-TAp73α及Myc-DLC2或Myc-DLC2-d SAM转染293T细胞,IP检测DLC2和DLC2-d SAM对外源性TAp73α的泛素化降解作用;7.将DLC2-d SAM或DLC2过表达的U251及Shg44注射至裸鼠皮下,构建胶质瘤异位肿瘤模型,对比DLC2-SAM过表达组与DLC2过表达组肿瘤的生长情况;同时WB检测异位肿瘤模型来源的肿瘤组织中Caspase3及Bax的蛋白表达水平变化;TUNEL检测肿瘤组织中胶质瘤细胞的凋亡情况。结果1.WB显示胶质瘤组织中TAp73α表达明显高于正常脑组织,而TAp73β蛋白水平无明显变化;胶质瘤细胞系中TAp73α蛋白在U251及Shg44中表达高于A172及T98G细胞,并且细胞克隆实验证实U251、Shg44细胞集落形成多于A172、T98G细胞;2.流式细胞学技术证实TAp73β过表达促进U251及Shg44凋亡,凋亡相关指标如Caspase3、BAX蛋白表达水平升高;而在A172及T98G中过表达TAp73β,可以抑制细胞增殖,促进Caspase3、BAX的蛋白表达;但在A172及T98G中过表达TAp73α可以促进细胞增殖,抑制Caspase3、BAX的蛋白表达;3.与正常脑组织相比,胶质瘤组织中DLC2的蛋白及m RNA表达下降;并且与TAp73α表达负相关（p<0.001）,与TAp73β表达相关性不明显（p=0.442）,但与TAp73α/TAp73β比负相关（p<0.001）;4.WB提示DLC2在A172、T98G中表达高于U251、Shg44;而在U251、Shg44中过表达DLC2抑制细胞凋亡及体外成瘤实验中肿瘤的生长;敲减A172、T98G中DLC2可以促进细胞克隆形成;5.在U251、Shg44中过表达DLC2可以抑制TAp73α的蛋白表达,而m RNA表达无明显变化,同时促进TP73下游相关靶基因,如Caspase3、Bax的蛋白表达,而TAp73β表达不受影响;敲减A172、T98G中DLC2表达后TAp73α表达升高,TAp73β表达不受影响;DLC2可以抑制U251及Shg44细胞中内源性TAp73α以及23T细胞中外源性TAp73α的泛素化降解;6.在U251和Shg44中转染Myc-DLC2后,IP可以检测到DLC2与内源性TAp73α共沉淀,而DLC2与TAp73β未见共沉淀;在293T中共转染Myc-DLC2和Flag-TAp73α、His-TAp73β后,IP检测到DLC2可以与外源性TAp73α而非TAp73β共沉淀;而SAM结构域缺失的DLC2不能与TAp73α共沉淀,并且SAM结构域缺失的DLC2对TAp73α泛素化降解作用减弱;7.将DLC2、SAM区域缺失的DLC2突变体转染U251及Shg44细胞后,构建裸鼠异位胶质瘤模型,对比发现,DLC2过表达组肿瘤重量、体积均大于突变体转染组;WB检测发现突变组肿瘤组织中Caspase3及Bax表达较DLC2过表达组下降;组织TUNEL提示突变组凋亡少于DLC2过表达组。结论在胶质瘤组织中DLC2相对低表达,而TAp73α相对高表达,并且两者表达负性相关。DLC2通过SAM区域与TAp73α相互作用,并调节其泛素化降解,影响TP73下游基因的表达,从而在胶质瘤中发挥抑癌作用。
二、髓母细胞瘤Caspase-3表达与细胞凋亡的关系（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、髓母细胞瘤Caspase-3表达与细胞凋亡的关系（论文提纲范文）
（1）短链脂肪酸调控人髓母细胞瘤UW228-3细胞增殖、凋亡和侵袭作用的研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 MTT法细胞活力测定 |
| 1.2.2 细胞凋亡检测 |
| 1.2.3 细胞划痕检测 |
| 1.2.4 PCR |
| 1.2.5 Western Blot |
| 1.3 统计方法 |
| 2 结 果 |
| 2.1 丙酸、丁酸对UW228-3细胞增殖的影响 |
| 2.2 丙酸、丁酸对UW228-3细胞侵袭的影响 |
| 2.3 丙酸、丁酸对UW228-3细胞凋亡的影响 |
| 2.4 丙酸、丁酸对凋亡相关基因表达的影响 |
| 2.5 丙酸、丁酸对凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 3 讨 论 |
（2）新型Hedgehog通路抑制剂土荆皮乙酸抑制髓母细胞瘤生长的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 Hedgehog信号通路研究综述 |
| 一、Hedgehog信号通路传导途径 |
| 二、初级纤毛与Hedgehog信号传导 |
| 三、Hedgehog信号通路与肿瘤发生 |
| 四、Hedgehog通路抑制剂 |
| 第二节 髓母细胞瘤研究综述 |
| 一、髓母细胞瘤流行病学概况 |
| 二、髓母细胞瘤的分子分型 |
| 三、髓母细胞瘤靶向治疗瓶颈 |
| 第三节 中医药治疗脑肿瘤研究综述 |
| 一、脑肿瘤的病因病机 |
| 二、中医药治疗脑肿瘤研究进展 |
| 三、“辛味通络”法治疗脑肿瘤 |
| 第四节 中医药靶向Hh通路研究综述 |
| 一、中医药抑制Hh通路研究进展 |
| 二、土荆皮乙酸抗肿瘤研究进展 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 实验材料 |
| 一、实验仪器 |
| 二、实验试剂 |
| 三、细胞系 |
| 第二节 实验方法 |
| 一、药物配制 |
| 二、小鼠原代神经元的提取 |
| 三、细胞系培养 |
| 四、原代MB细胞肿瘤球培养 |
| 五、细胞活力检测 |
| 六、克隆形成实验 |
| 七、总蛋白提取 |
| 八、免疫印迹法(Western blotting) |
| 九、流式细胞术 |
| 十、EdU细胞增殖检测 |
| 十一、小分子干扰RNA (siRNA)敲低SMO |
| 十二、GLI-荧光素酶报告基因活性测定 |
| 十三、总RNA提取 |
| 十四、cDNA合成 |
| 十五、荧光定量RT-PCR(qRT-PCR) |
| 十六、分子对接 |
| 十七、质粒载体构建 |
| 十八、慢病毒包装及转染 |
| 十九、细胞热转变分析(Cellular thermal shift assay,CETSA) |
| 二十、BODIPY-cyclopamine竞争结合实验 |
| 二十一、纤毛形成及SMO纤毛定位实验 |
| 二十二、小鼠基因鉴定 |
| 二十三、MB异位移植瘤造模 |
| 二十四、免疫组织化学法 |
| 二十五、免疫荧光 |
| 二十六、H&E染色 |
| 二十七、统计分析 |
| 第三节 实验结果 |
| 一、抗MB细胞生长药物筛选 |
| 二、PAB抑制由Hh信号通路驱动的MB细胞增殖 |
| 三、PAB抑制MB细胞中Hh信号通路活性 |
| 四、PAB直接靶向结合SMO |
| 五、PAB抑制纤毛形成 |
| 六、PAB逆转由SMO突变引起的耐药 |
| 七、PAB在体内抑制Hh信号通路驱动的MB生长 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
（3）Slc7a5在大鼠多囊卵巢综合征模型卵巢上的表达及其功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 文献综述 LAT1及其相关疾病和治疗的研究进展 |
| 1.1.1 引言 |
| 1.1.2 LAT1 在肿瘤中的作用 |
| 1.1.3 LAT1 在神经系统疾病中的作用 |
| 1.1.4 前景 |
| 第2章 Slc7a5 在大鼠多囊卵巢综合征模型卵巢上的表达 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 Slc7a5 对大鼠卵巢颗粒细胞类固醇激素合成的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 Slc7a5 对大鼠卵巢颗粒细胞活力及凋亡的影响及机制 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.4 结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 Slc7a5 下游基因的筛选及在其颗粒细胞中的功能研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）EBF3在儿童髓母细胞瘤中的表达及意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 试剂与器械 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 实验分组 |
| 2.2.3 荧光定量 PCR 实验方法 |
| 2.2.4 WB实验方法 |
| 2.2.5 甲基化实验方法 |
| 2.2.6 CCK增殖实验方法 |
| 2.2.7 流式凋亡实验方法 |
| 2.2.8 划痕实验方法 |
| 2.2.9 统计学方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 组织实验结果 |
| 3.2 细胞实验结果 |
| 3.2.1 EBF3 siRNA 转染的髓母细胞瘤细胞株模型 |
| 3.2.2 pcDNA 转染的髓母细胞瘤细胞株模型 |
| 3.2.3 细胞增殖实验（CCK8） |
| 3.2.4 凋亡实验 |
| 3.2.5 迁移实验（细胞划痕实验） |
| 3.3 甲基化实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 综述 与髓母细胞瘤相关的分子研究浅述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）MiR-21通过PI3K/AKT信号通路影响髓母细胞瘤的增殖、凋亡、迁移和侵袭（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1.前言 |
| 2 材料及方法 |
| 2.1 主要仪器和试剂 |
| 2.1.1 主要仪器及设备 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 细胞转染 |
| 2.2.3 RT-PCR法 |
| 2.2.4 CCK8法 |
| 2.2.5 平板细胞克隆形成实验 |
| 2.2.6 Annexin V-FITC/PI流式双染检测法 |
| 2.2.7 Transwell实验 |
| 2.2.8 细胞划痕实验 |
| 2.2.9 Western blot |
| 2.2.10 统计学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 验证miR-21在DAOY细胞中的表达 |
| 3.2 miR-21 能够促进DAOY细胞增殖 |
| 3.3 miR-21 抑制髓母细胞瘤DAOY细胞凋亡 |
| 3.4 miR-21 促进髓母细胞瘤DAOY细胞的侵袭和迁移 |
| 3.5 miR-21对DAOY细胞中PI3K/ AKT信号通路相关蛋白表达的影响 |
| 4.讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 MicroRNA与PI3K/AKT通路在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）MRT68921 HCl抑制ULK1诱导白血病细胞死亡及发挥抗肿瘤作用（论文提纲范文）
| 缩略词表中英文对照 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1.仪器、材料与试剂 |
| 2.实验方法 |
| 结果 |
| 3.1 ULK1 在白血病细胞和样本中的表达上调 |
| 3.2 抑制ULK1 诱导白血病细胞系死亡 |
| 3.3 抑制ULK1 激活THP-1和HL60 细胞中caspase-8/3 通路 |
| 3.4 MRT68921 HCl诱导白血病细胞死亡是以不依赖自噬和活性氧的方式 |
| 3.5 MRT68921 HCl在 THP-1 模型小鼠体内延缓白血病进展 |
| 3.6 MRT68921 HCl对正常小鼠的作用 |
| 3.7 MRT68921 HCl诱导原代白血病细胞死亡 |
| 3.8 MRT68921 HCl引起Cdc37 ser-13 磷酸化水平的升高 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 综述 天然小分子物质与急性髓系白血病靶向治疗 |
| 参考文献 |
| 在攻读硕士学位期间论文投稿及发表情况 |
| 致谢 |
（8）Wee1抑制剂AZD1775抑制食管鳞癌生长和转移及分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 食管鳞癌的概述 |
| 1.2 ESCC的治疗现状 |
| 1.3 Wee1蛋白激酶 |
| 1.4 AZD1775在癌症中的研究进展 |
| 第二章 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验所用细胞株 |
| 2.1.2 实验所用细菌 |
| 2.1.3 实验所用质粒 |
| 2.1.4 实验所用引物 |
| 2.1.5 食管鳞癌人体肿瘤标本 |
| 2.1.6 实验动物 |
| 2.1.7 实验主要试剂 |
| 2.1.8 实验常用仪器 |
| 2.1.9 实验常用试剂配制 |
| 2.1.10 培养细菌常用试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 培养细胞 |
| 2.2.2 细胞复苏 |
| 2.2.3 细胞冻存 |
| 2.2.4 MTT法检测细胞活力 |
| 2.2.5 克隆形成实验 |
| 2.2.6 软琼脂克隆形成实验 |
| 2.2.7 划痕实验 |
| 2.2.8 Transwell迁移实验 |
| 2.2.9 Transwell侵袭实验 |
| 2.2.10 PI染色检测细胞周期 |
| 2.2.11 Rh123/Hoechst33342 检测线粒体膜电位变化 |
| 2.2.12 Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡 |
| 2.2.13 Western blotting实验 |
| 2.2.14 免疫荧光实验 |
| 2.2.15 免疫组化实验 |
| 2.2.16 H&E染色 |
| 2.2.17 qRT-PCR实验 |
| 2.2.18 提取质粒 |
| 2.2.19 慢病毒包装 |
| 2.2.20 稳定低表达Wee1细胞株的构建 |
| 2.2.21 裸鼠皮下实体瘤实验 |
| 2.2.22 裸鼠肺转移实验 |
| 2.3 统计学分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 Wee1在ESCC中高表达 |
| 3.2 AZD1775 抑制ESCC细胞中Wee1 激酶活性 |
| 3.3 AZD1775 抑制ESCC细胞的体外增殖 |
| 3.4 AZD1775 通过线粒体途径诱导ESCC细胞发生凋亡 |
| 3.5 AZD1775 抑制ESCC细胞的迁移和侵袭 |
| 3.6 稳定低表达Wee1细胞株的成功构建 |
| 3.7 敲低Wee1 抑制ESCC细胞增殖 |
| 3.8 敲低Wee1 抑制ESCC细胞迁移和侵袭 |
| 3.9 AZD1775与5-FU或 CDDP协同抑制ESCC细胞的增殖 |
| 3.10 AZD1775 抑制KYSE150 细胞在裸鼠体内的生长 |
| 3.11 AZD1775 抑制KYSE150 细胞在裸鼠体内发生肺转移 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 总结 |
| 5.1 研究主要发现 |
| 5.2 有待继续探究的问题 |
| 参考文献 |
| 附录 英文缩写词 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（9）溴结构域抑制剂JQ1通过VEGF/PI3K/AKT信号通路促进脑胶质瘤干细胞周期阻滞和凋亡（论文提纲范文）
| 前言 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 脑胶质瘤概述 |
| 1.1.1 脑胶质瘤生物学特性 |
| 1.1.2 GSCs与脑胶质瘤药物抵抗和复发 |
| 1.1.3 脑胶质瘤与信号通路 |
| 1.2 Brd4与肿瘤治疗 |
| 1.2.1 BET蛋白家族结构及功能 |
| 1.2.2 BRD4蛋白的基本功能 |
| 1.3 BET抑制剂 |
| 1.3.1 BET抑制剂概述 |
| 1.3.2 JQ1与疾病 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞 |
| 2.1.2 质粒及慢病毒 |
| 2.1.3 病理切片 |
| 2.1.4 实验动物 |
| 2.1.5 实验试剂 |
| 2.2 实验仪器与设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养和转染 |
| 2.3.2 CCK8实验 |
| 2.3.3 细胞生长计数实验 |
| 2.3.4 软琼脂克隆实验 |
| 2.3.5 神经球成球能力实验 |
| 2.3.6 Annexin V-FITC流式细胞术 |
| 2.3.7 PI流式细胞术 |
| 2.3.8 实时定量PCR实验 |
| 2.3.9 转录组测序 |
| 2.3.10 GO和KEGG分析 |
| 2.3.11 Western blotting实验 |
| 2.3.12 动物实验 |
| 2.3.13 苏木精-伊红染色法 |
| 2.3.14 免疫组织化学染色 |
| 2.3.15 统计分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 Brd4是恶性脑胶质瘤潜在的治疗靶点 |
| 3.1.1 sh RNA表观遗传学文库筛查 |
| 3.1.2 利用TCGA数据库检测GBM中Brd4拷贝数表达情况 |
| 3.1.3 不同病理分级人脑胶质瘤组织切片中BRD4蛋白表达情况 |
| 3.2 抑制Brd4对GSCs增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响 |
| 3.2.1 si Brd4对GSCs中Brd4表达的影响 |
| 3.2.2 si Brd4和JQ1对GSCs活力的影响 |
| 3.2.3 si Brd4和JQ1对GSCs增殖能力的影响 |
| 3.2.4 si Brd4和JQ1对GSCs自我更新能力的影响 |
| 3.2.5 si Brd4和JQ1对GSCs周期的影响 |
| 3.2.6 si Brd4和JQ1对GSCs凋亡的影响 |
| 3.3 JQ1促进GSCs周期阻滞和凋亡的机制 |
| 3.3.1 RNA-seq测序筛查Brd4调控的信号通路 |
| 3.3.2 JQ1对PI3K/AKT信号通路上游VEGF的影响 |
| 3.3.3 JQ1和si Brd4对VEGF/PI3K/AKT信号通路下游周期相关基因表达的影响 |
| 3.3.4 JQ1和si Brd4对VEGF/PI3K/AKT信号通路下游凋亡相关基因表达的影响 |
| 3.4 JQ1对小鼠GSCs移植瘤的影响 |
| 3.4.1 JQ1对小鼠GSCs移植瘤生长的影响 |
| 3.4.2 JQ1对GSCs凋亡和周期的影响 |
| 3.5 JQ1与TMZ联合用药为治疗恶性脑胶质瘤提供新的治疗方法 |
| 3.5.1 Brd4影响GSCs对TMZ的敏感性 |
| 3.5.2 JQ1与TMZ联合用药对GSCs活力的影响 |
| 3.5.3 JQ1与TMZ联合用药对GSCs具有协同作用 |
| 3.5.4 JQ1与TMZ联合用药对GSCs细胞周期和凋亡的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（10）DLC2通过调节TAp73α/TAp73β表达比抑制胶质瘤发生的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 主要试剂和材料 |
| 1.2 主要仪器和设备 |
| 1.3 实验方法与步骤 |
| 2.结果 |
| 2.1 胶质瘤中TAp73α和TAp73β的表达及两者比值 |
| 2.2 TAp73α和TAp73β在胶质瘤中发挥相反作用 |
| 2.3 胶质瘤中DLC2 表达下调并与TAp73α /TAp73β表达比相关 |
| 2.4 DLC2 抑制GBM细胞的克隆形成,增殖和肿瘤发生 |
| 2.5 DLC2通过负调控TAp73α的表达使TAp73α /TAp73β的比下调 |
| 2.6 DLC2 通过SAM结构域与TAp73α相互作用,但不与TAp73β相互作用 |
| 2.7 SAM 结构域是 DLC2 在胶质瘤中发挥抗肿瘤作用所需要的重要结构 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 综述 p73 参与胶质瘤的机制 |
| 综述参考文献 |
| 攻读博士学位期间公开发表的论文与参加的项目 |
| 致谢 |
四、髓母细胞瘤Caspase-3表达与细胞凋亡的关系（论文参考文献）
- [1]短链脂肪酸调控人髓母细胞瘤UW228-3细胞增殖、凋亡和侵袭作用的研究[J]. 郑旭,王箫寒,关荣科,许玲玲,王茜. 中国微生态学杂志, 2021(09)
- [2]新型Hedgehog通路抑制剂土荆皮乙酸抑制髓母细胞瘤生长的机制研究[D]. 魏素芬. 广州中医药大学, 2021(02)
- [3]Slc7a5在大鼠多囊卵巢综合征模型卵巢上的表达及其功能研究[D]. 张京顺. 吉林大学, 2021(01)
- [4]人脐带间充质干细胞来源外泌体抑制髓母细胞瘤Daoy细胞增殖并促其凋亡[J]. 衣志爽,王植海,李明,周清安,杨保胜. 中国组织工程研究, 2021(31)
- [5]EBF3在儿童髓母细胞瘤中的表达及意义[D]. 魏琼. 中国医科大学, 2021(02)
- [6]MiR-21通过PI3K/AKT信号通路影响髓母细胞瘤的增殖、凋亡、迁移和侵袭[D]. 王永利. 中国医科大学, 2021(02)
- [7]MRT68921 HCl抑制ULK1诱导白血病细胞死亡及发挥抗肿瘤作用[D]. 李运雷. 广州医科大学, 2021(02)
- [8]Wee1抑制剂AZD1775抑制食管鳞癌生长和转移及分子机制研究[D]. 毕淑宁. 河南大学, 2020(02)
- [9]溴结构域抑制剂JQ1通过VEGF/PI3K/AKT信号通路促进脑胶质瘤干细胞周期阻滞和凋亡[D]. 闻乃妍. 吉林大学, 2019(02)
- [10]DLC2通过调节TAp73α/TAp73β表达比抑制胶质瘤发生的机制研究[D]. 程超. 南京医科大学, 2019(04)