一、端粒酶及其抑制剂在白血病中的研究进展（论文文献综述）
牟科[1]（2021）在《hnRNP U对慢性髓细胞白血病细胞增殖和凋亡的影响及机制研究》文中研究表明目的BCR-ABL融合基因编码产生BCR-ABL蛋白,其酪氨酸激酶活性持续异常活化下游信号通路,导致CML的发生。尽管酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine kinase inhibitors,TKIs）伊马替尼（Imatinib,IM）等药物的使用延长了患者的生存期,但仍有约25%的病人产生耐药,临床急需新的治疗手段。核不均一核糖核蛋白（Heterogeneous ribonucleoprotein,hnRNP）是一类RNA结合蛋白,参与细胞内mRNA的剪切、成熟、转运、稳定及翻译调控等过程。近年来,hnRNP家族多个成员被证实在慢性髓细胞白血病（Chronic myeloid leukemia,CML）中发挥重要作用。其中hnRNP U自1992年被发现以来,已证实它与多种实体肿瘤发生发展相关,但在CML中的研究尚未见报道。为了使本研究对CML具有普适性,我们考虑了IM敏感和IM耐药两种临床现状。故本课题拟采用IM敏感细胞株K562及IM耐药细胞株K562/G01细胞为模型,探究hnRNP U在CML中的作用及可能的机制,为探寻CML的发病机制和治疗新思路提供实验基础。方法1.采用RT-qPCR和Western blot分别检测正常对照（NC）及CML患者骨髓标本,BCR-ABL阴性细胞株TK6、THP1,BCR-ABL阳性细胞株K562、KCL22、K562/G01中hnRNP U的表达;再用不同浓度伊马替尼处理K562及K562/G01细胞48 h后,Western blot检测BCR-ABL磷酸化水平及hnRNP U蛋白水平的变化。2.采用sh-hnRNP U慢病毒感染K562及K562/G01细胞72-96 h,RT-qPCR检测hnRNP U mRNA敲低效果,经嘌呤霉素筛选4天后Western blot检测hnRNP U蛋白敲低效果。选取敲低效果较好的sh RNA-1、sh RNA-2慢病毒感染K562及K562/G01 96 h,采用CCK8和克隆形成实验检测细胞的增殖能力;sh RNA-1、sh RNA-2慢病毒感染K562及K562/G01细胞96 h经嘌呤霉素筛选并继续培养4-5天后,用流式细胞术检测细胞的凋亡。3.利用生物信息学技术筛选hnRNP U的潜在靶基因;RT-qPCR及Western blot检测hnRNP U敲低后相应靶基因mRNA、蛋白表达水平及mRNA半衰期;RIP实验检测hnRNP U与靶基因mRNA的结合。结果1.与正常人骨髓标本和BCR-ABL阴性细胞株相比,hnRNP U在CML患者骨髓标本（P<0.001）和CML细胞系中高表达（P<0.05）,hnRNP U表达水平不受BCR-ABL磷酸化水平的影响。2.病毒感染细胞72-96 h,hnRNP U mRNA敲低至50%以下,经嘌呤霉素筛选后hnRNP U蛋白显着降低。CCK8结果显示48 h时,sh-hnRNP U组细胞增殖速率明显变缓（P<0.05）;克隆形成实验显示sh-hnRNP U组克隆数量减少约50%且克隆形态明显变小,表明hnRNP U敲低,CML细胞增殖能力明显受抑（P<0.001）。流式结果显示CML细胞发生凋亡。3.利用GEPIA和STARBASE3.0两个数据库,筛选出与hnRNP U正相关、且与hnRNP U有可能结合的mRNA有c-Myc和BCL-2;hnRNP U敲低后c-Myc和BCL-2的mRNA表达水平及mRNA稳定性均降低,c-Myc和BCL-2蛋白表达水平也降低;RIP实验发现hnRNP U可以结合c-Myc和BCL-2的mRNA。结论本研究发现hnRNP U在CML病人骨髓标本和CML细胞系K562、KCL22、K562/G01中表达增高,高表达的hnRNP U可促进CML细胞增殖并抑制其凋亡,其可能的机制是通过hnRNP U与c-Myc和BCL-2的mRNA结合并增强其mRNA稳定性,促进c-Myc及BCL-2蛋白表达来实现的。研究表明hnRNP U对于IM敏感及耐药的CML细胞株的存活同样重要,为深入阐明hnRNP U在CML发病中的作用奠定了实验基础。
杨明月[2]（2021）在《红细胞分布宽度在初诊骨髓增生异常综合征、再生障碍性贫血、急性白血病、慢性粒细胞白血病中的临床分析》文中进行了进一步梳理目的分析红细胞分布宽度（Red blood cell distribution width,RDW）在初诊骨髓增生异常综合征（Myelodysplastic syndromes,MDS）、再生障碍性贫血（Aplastic anemia,AA）、急性白血病（Acute leukemia,AL）、慢性粒细胞白血病（Chronic myeloid leukemia,CML）中的分布特征,进一步探讨RDW在初诊MDS、AA、AL、CML中的诊断及鉴别诊断意义。方法收集2002年至2021年兰州大学第一医院血液科初诊为MDS（90例）、AA（67例）、AL（102例）、CML（111例）的患者以及正常对照组（76例）的临床资料。以本院实验室检测参考值:RDW-CV（10.9～15.4%）及RDW-SD（39～46f L）为标准,分为低RDW组、正常RDW组、高RDW组。回顾性分析了四种疾病的RDW值分布,进一步分层分析了AA中（非重型/重型/极重型）、AL中（ALL/AML）疾病类型与RDW的关系,对四种疾病与对照组的RDW水平进行了比较分析,探索了MDS、AML（非APL）预后危险度分层与RDW的相关性。结果1.一般资料:正常对照组年龄中位数为64岁（17～85岁）,男性28例（36.8%）,女性48例（63.2%）。MDS组年龄中位数为56.5岁（2～84岁）,男性49例（54.4%）,女性41例（45.6%）。AA组年龄中位数为28岁（2～82岁）,男性39例（58.2%）,女性28例（41.8%）。AL组年龄中位数为48岁（2～78岁）,男性61例（59.8%）,女性41例（40.2%）;其中,AML年龄中位数为51岁（3～78岁）,ALL年龄中位数为13岁（2～72岁）。CML组年龄中位数为45岁（2～83岁）,男性63例（56.8%）,女性48例（43.2%）。MDS、AA、AL、CML四种疾病中的男性占比均高于女性。MDS、AA、AL、CML之间的男女分布比较无统计学差异（χ2=0.597,P=0.897）。2.MDS-MLD有53例（58.9%）,MDS-EB-2有14例（15.6%）,MDS-EB-1有13例（14.4%）,MDS-RS-MLD有5例（5.6%）,MDS-SLD有2例（2.2%）,MDS-RS-SLD、MDS-U、MDS伴单纯del（5q）各1例。AA中非重型有27例（40.3%）,重型有31例（46.3%）,极重型有9例（13.4%）。AL中ALL有29例（28.4%）,AML-M4有21例（20.6%）,AML-M2有20例（19.6%）,AML-M5有15例（14.7%）,AML-M3（APL）有14例（13.7%）,AML-M1有3例（2.9%）。111例CML均处于CP期。3.MDS、AA、AL、CML的RDW值分布:（1）MDS、AA、AL、CML患者的高RDW-CV分别有72例（80%）、30例（44.8%）、71例（69.6%）、105例（94.6%）,正常范围RDW-CV分别有18例（20%）、37例（55.2%）、31例（30.4%）、6例（5.4%）,低RDW-CV均为0例。与对照组相比,MDS、AA、AL、CML的RDW-CV均升高（χ2分别为103.546、39.612、84.321、159.865,P值均为0.000）。（2）MDS、AA、AL、CML患者的高RDW-SD分别有88例（97.8%）、45例（67.2%）、94例（92.2%）、111例（100%）,正常范围RDW-SD分别有2例（2.2%）、15例（22.4%）、8例（7.8%）、0例,低RDW-SD分别为0例、7例（10.4%）、0例、0例。与对照组相比,MDS、AA、AL、CML的RDW-SD均升高（χ2分别为100.808、47.196、90.366、125.891,P值均为0.000）。4.AA中（非重型/重型/极重型）、AL中（ALL/AML）疾病类型与RDW的关系:（1）AA中非重型、重型、极重型的RDW-CV水平分别为15.30±2.06%、15.57±2.31%、13.43±1.33%,RDW-SD水平分别为56.54±11.67f L、53.58±11.25f L、42.26±6.34 f L,三组间在RDW-CV和RDW-SD水平上差异均有统计学意义（F分别为3.676、5.779,P值分别为0.031、0.005）。非重型、重型的RDW-CV均高于极重型（P值分别为0.024、0.009）。非重型、重型的RDW-SD均高于极重型（P值分别为0.001、0.008）。（2）AL中ALL、AML患者的RDW-CV水平分别为17.53±2.61%、16.66±2.79%,RDW-SD水平分别为58.28±11.56f L、59.67±10.33f L,两组间在RDW-CV和RDW-SD水平上差异均无统计学意义（P值分别为0.148、0.554）。5.MDS、AA、AL、CML的RDW水平与对照组比较:（1）MDS、AA、AL、CML患者的RDW-CV水平分别为18.19±3.14%、15.18±2.19%、16.90±2.76%、18.32±2.02%,均明显高于正常对照组的13.29±0.85%,差异有统计学意义（P值均为0.000）。（2）MDS、AA、AL、CML患者的RDW-SD水平分别为67.70±11.63f L、53.25±11.71f L、59.27±10.65f L、60.64±6.32f L,均明显高于正常对照组的44.53±3.08f L,差异有统计学意义（P值均为0.000）。6.RDW水平在MDS、AA、AL、CML之间的比较:（1）MDS、AL、CML组的RDW-CV水平分别为18.19±3.14%、16.90±2.76%、18.32±2.02%,均高于AA组的15.18±2.19%,P值均为0.000。MDS、CML组的RDW-CV均高于AL组,P值分别为0.003、0.000。（2）MDS、AL、CML组的RDW-SD水平分别为67.70±11.63f L、59.27±10.65f L、60.64±6.32f L,均高于AA组的53.25±11.71f L,P值分别为0.000、0.001、0.000。MDS组的RDW-SD高于AL、CML组,P值均为0.000。7.MDS、AML（非APL）预后危险度分层与RDW的相关性:（1）MDS中能进行预后危险度分层（IPSS评分）的有82例:低危有6例（7.3%）,中危-1有60例（73.2%）,中危-2有14例（17.1%）,高危2例（2.4%）。预后低危、中危-1、中危-2、高危患者的RDW-CV水平分别为17.55±4.02%、18.27±2.96%、17.24±3.52%、17.35±2.62%,RDW-SD水平分别为64.72±10.14f L、68.56±11.68f L、64.41±12.86f L、68.65±1.34f L,四组危险度分层之间RDW-CV和RDW-SD水平相比差异均无统计学意义（F分别为0.488、0.607,P值分别为0.691、0.612）。MDS预后危险度分层与RDW之间无相关性。（2）AML（非APL）中能进行预后危险度分层的有38例:良好9例（23.6%）,中等8例（21.1%）,不良有21例（55.3%）。预后良好、中等、不良的RDW-CV水平分别为16.77±2.17%、15.40±2.11%、17.37±3.51%,RDW-SD水平分别为59.44±8.36f L、58.01±7.55f L、62.78±9.63f L,三组危险度分层之间RDW-CV和RDW-SD水平相比差异均无统计学意义（F分别为1.247、0.994,P值分别为0.300、0.380）。AML（非APL）预后危险度分层与RDW之间无相关性。结论1.MDS、AA、AL、CML的RDW-CV和RDW-SD水平均升高。2.非重型、重型AA的RDW-CV、RDW-SD水平均高于极重型AA。3.虽然AL（ALL、AML）的RDW-CV、RDW-SD水平均升高,但ALL、AML两者间的RDW-CV、RDW-SD水平无差异。4.MDS、AL、CML的RDW-CV、RDW-SD均高于AA。MDS、CML的RDW-CV高于AL。MDS的RDW-SD高于AL、CML。5.MDS、AML（非APL）的预后危险度分层均与RDW值无关。
王志清[3]（2020）在《芪附扶正合剂联合低剂量传统化疗方案治疗老年急性髓系白血病（非M3）的疗效分析及机制研究》文中研究指明研究目的本研究通过比较传统低剂量化疗方案联合和不联合芪附扶正合剂（Modified Qifu Fuzheng Decoction,QFFZD）治疗老年急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia,AML）（非M3）的相关临床指标,包括缓解率、中医症候积分、复发率、生存率及感染发生率等,客观评价QFFZD在老年AML治疗中的临床疗效和安全性。再通过体外实验探讨QFFZD协同阿糖胞苷（Cytarabine,Ara-C）对人急性髓系白血病HL-60细胞增殖及凋亡的影响,并探寻其分子学作用机制,为临床QFFZD辅助治疗AML提供科学依据。研究方法临床研究方法:根据患者治疗期间是否联合口服芪附扶正合剂中药,将58例老年AML患者分为观察组（30例）和对照组（28例）,观察组予低剂量传统化疗方案联合QFFZD口服,对照组仅予低剂量传统化疗方案治疗。比较两组患者的CR率、诱导治疗后中医症候积分变化情况、复发率、中位生存期、总生存率;同时比较两组患者诱导期感染发生率及远期感染发生率。实验研究方法:（1）采用20只SD雄性大鼠,适应性饲养后随机分为对照组与QFFZD治疗组,分别予2mL生理盐水和2mL生药浓度为1.68 g/mL QFFZD灌胃,连续7天。第8天麻醉后主动脉取血,分离得到上层血清,-80℃保存备用;2.采用MTT比色分析法检测不同浓度QFFZD含药血清、Ara-C单用和联合干预HL-60细胞24h和48h后对其的增殖抑制作用;（3）PI单染流式细胞术（FCM）用于检测QFFZD含药血清、Ara-C单用以及联合使用对HL-60细胞细胞周期的影响;（4）Annexin V/PI双染流式细胞术（Flow Cytometry,FCM）检测QFFZD含药血清、Ara-C单用以及联合使用对HL-60细胞的凋亡诱导作用;（5）免疫印迹实验（Western Blot,WB）检测QFFZD含药血清、Ara-C单用以及联合使用对HL-60细胞凋亡相关蛋白兔Bcl-2相关X蛋白（Bax）、B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP）及其剪切体cleaved caspase-3、cleaved PARP以及Akt/p53信号通路相关蛋白的表达情况;（6）免疫印迹实验被用于检测Akt特异性抑制剂MK-2206 2HCL干预HL-60细胞后凋亡相关蛋白的表达情况。结果临床研究结果:观察组和对照组的CR率分别为66.7%、60.7%,差异无统计学意义（p>0.05）;在诱导化疗结束后改善中医症候积分方面,观察组明显优于对照组（p<0.05）;观察组的复发率略低于对照组,分别为55.0%和58.8%,但差异无统计学意义（p>0.05）;在远期生存方面,观察组和对照组的估计中位生存期分别为21.818.7个月和16.8±5.7个月,1年生存率分别为（60.3±9.4）%和（56.7±9.4）%,3年生存率分别为（39.0±9.8）%和（27.2±9.6）%,5年生存率分别为（27.9±9.7）%和（20.4±9.3）%,均未达到统计学差异（P=0.213）;在不良反应方面,观察组诱导期感染发生率（46.7%）与对照组（46.4%）相差不大;观察组远期的感染发生率（28.0%）低于对照组（34.9%）,差异有统计学意义（p<0.05）。实验研究结果:1.MTT比色分析法结果显示,相同干预时间下,QFFZD含药血清（2%、4%、6%、8%、10%）和 Ara-C（0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L）单用以及联合使用对HL-60细胞的增殖抑制作用均呈浓度依赖性,与对照组相比,差异具有统计学意义（p<0.05）;不同浓度QFFZD含药血清和Ara-C单独和联合干预HL-60细胞24h和48h后,其对细胞的增殖抑制作用随着干预时间的延长而增强,差异具有统计学意义（p<0.05）;此外,相同干预时间下,二者联合使用对HL-60细胞的增殖抑制作用与二者单独使用对细胞的增殖抑制作用相比,差异具有统计学意义（p<0.05）。2.PI单染流式细胞术结果显示,与对照组相比,QFFZD含药血清（10%）和Ara-C（8μmol/L）单独以及联合干预HL-60细胞24h后,均能将HL-60细胞阻滞于G1期,两药联合时对HL-60细胞的周期阻滞作用更加明显（p<0.05）。3.流式细胞术检测QFFZD含药血清（10%）和Ara-C（8μmol/L）单独以及联合干预HL-60细胞24h后细胞的凋亡率。结果显示,单用以及联合使用均能诱导细胞发生凋亡,并且两药合用时凋亡效果更加明显（p<0.05）。4.QFFZD含药血清（10%）和Ara-C（8μmol/L）单独以及联合干预HL-60细胞24h后,采用Western blot法检测凋亡相关蛋白的表达情况,结果显示,促凋亡蛋白Bax以及执行凋亡程序的关键蛋白cleaved caspase-3、cleaved PARP的表达均明显高于空白组（p<0.05）,而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平则低于空白组（p<0.05）。与此同时,Akt/p53信号通路相关蛋白p-Akt的表达水平各给药组明显低于空白组（p<0.05）,而p53的表达水平各给药组则明显高于空白组（p<0.05）。5.在用QFFZD含药血清（10%）和Ara-C（8 μmol/L）共同干预HL-60细胞前,予Akt特异性抑制剂MK-2206 2HCL（5 nmol/L）预处理24h后,以Western Blot检测凋亡相关蛋白的表达情况。结果显示,Akt特异性抑制剂预处理后,凋亡相关蛋白Bax、cleaved caspase-3、cleaved PARP的表达明显降低（p<0.05）,而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达则有所升高（p<0.05）。结论临床研究表明,QFFZD联合低剂量传统化疗方案治疗老年AML较单纯应用化疗有一定优势,尤其体现在可以改善中医症候积分,降低远期感染发生率;随着服药时间的延长,一定程度上可延长中位生存期,提高3年及5年生存率的趋势（虽未达到统计学差别）。实验研究表明,1.芪附扶正合剂含药血清和阿糖胞苷在体外单用和联合使用均能以浓度和时间依赖的方式有效地抑制HL-60细胞的增殖,而且表现出两者之间可能存在协同或叠加效应。2.芪附扶正合剂含药血清和阿糖胞苷在体外单用和联合使用均能明显地提高处于G1期的HL-60细胞比率,同样表现出明显的协同作用。3.芪附扶正合剂含药血清和阿糖胞苷可诱导HL-60细胞发生凋亡,其过程可能是通过调控Akt/p53信号通路从而启动内源性细胞凋亡途径发挥作用。
许霞青[4]（2020）在《PARP1负性调控MT1M在卵巢癌转移中的作用及机制研究》文中研究指明研究背景:卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一,其发病率在我国位居第三位仅次于宫颈癌和宫体癌,严重影响人类健康。近年来,ADP核糖聚合酶（Poly ADP-ribose Polymerase,PARP）抑制剂在卵巢癌的治疗中取得显着成效,开启了小分子抑制剂靶向治疗卵巢癌的大门。目前,PARP抑制剂主要被批准用于BRCA（Breast cancer）突变的卵巢癌患者。然而,随着临床试验数据的累积,研究者发现不论患者是否存在BRCA突变,使用PARP抑制剂Niraparib Rucaparib治疗的卵巢癌患者均能获益,显着改善了患者的无疾病生存期。因此,如何从PARP1（Poly ADP-ribose Polymerase 1）的生物学功能出发理解临床上这一现象成为该领域的研究热点。随着PARP1研究的深入关于它的其他生物学功能也开始受到关注。近年来的研究发现PARP1可以通过激活转录因子、抑制转录因子活性的方式或直接作为转录因子调控基因表达,从而调控肿瘤细胞的多种生物学功能。本研究通过分析TCGA数据库（The cancer genome atlas）发现PARP1 m RNA高度表达与卵巢癌、乳头状肾细胞癌、ER+（Estrogen receptor-positive）乳腺癌以子宫体癌患者的无疾病生存期（Progress free survival,PFS）呈显着负相关,并将这四种肿瘤中与无疾病生存期相关的基因进行重合分析,发现91个基因的表达与PARP1 m RNA的高度表达呈负相关。同时,在卵巢癌细胞上分别敲除PARP1、过表达PARP1和给予PARP抑制剂Olaparib,采用全基因组芯片检测基因变化,发现13个基因与PARP1的高度表达呈显着负相关。进而将从TCGA数据分析获得的91个基因与芯片分析获得的13个基因进行重合对比分析,发现PARP1蛋白表达与金属硫蛋白-1M（Metallothionein 1M,MT1M）基因转录呈显着负相关,这提示MT1M可能是PARP1调控的靶基因。那么,PARP1是否通过负性调控MT1M,从而调控卵巢癌的哪些生物学行为?金属硫蛋白-1M（MT1M）是半胱氨酸富集的小分子蛋白,属于金属硫蛋白（MT-1）家族成员,特异性结合金属离子,在金属解毒氧化应激保护方面发挥重要作用。近年来研究表明MT1M能够显着抑制多种肿瘤的增殖与转移,如肝细胞癌、甲状腺乳头状癌,是潜在的抑癌基因。考虑到MT1M在肿瘤细胞中抑制肿瘤细胞增殖与转移的作用,本研究推断PARP1可能通过负性调控MT1M参与肿瘤细胞的增殖与转移。本研究将围绕PARP1负性调控MT1M表达这一生物学现象,考察PARP1负性调控MT1M在卵巢癌增殖与转移中的作用具体的分子机制:（1）分析TCGA数据库中PARP1 m RNA的高度表达与多种肿瘤无疾病进展期的相关性,结合卵巢癌细胞基因芯片的数据,发现PARP1负性调控卵巢癌细胞中MT1M的表达;（2）明确MT1M的表达对卵巢癌细胞增殖与迁移的影响,并寻找PARP1调控MT1M表达的具体分子机制;（3）MT1M的表达在PARP抑制剂抗卵巢癌转移的作用。本研究发现了PARP1新的靶基因MT1M以调控卵巢癌转移的新机制即PARP1通过抑制MT1M表达促进卵巢癌转移,并为PARP抑制剂在卵巢癌治疗中的应用提供新的理论依据。第一部分PARP1抑制MT1M转录促进卵巢癌转移的作用研究研究方法:（1）采用TCGA数据库分析在PARP1 m RNA表达与与卵巢癌、乳头状肾细胞癌、ER+乳腺癌、子宫体癌、膀胱癌、睾丸生殖细胞肿瘤、头颈鳞状细胞癌、以胰腺导管腺癌患者的无疾病生存期的相关性;（2）进一步采用Kmplot数据库分析,找到与PARP1 m RNA表达呈负相关性的基因;（3）在非BRCA突变的卵巢细胞OVCAR8上分别敲除PARP1、过表达PARP1和给予PARP抑制剂Olaparib,采用全基因芯片检测基因变化,寻找与PARP1表达呈负相关的基因;（4）将TCGA数据库分析出与PARP1表达呈负相关的基因,与卵巢癌细胞OVCAR8中与PARP1表达呈负相关的基因进行重合对比分析,发现了PARP1调控新的靶基因MT1M;（5）在非BRCA突变的卵巢癌SKOV3、Ca OV3和OVCAR8,沉默PARP1,采用Western blotting法、荧光实时定量PCR法以Elisa法验证PARP1对MT1M表达的影响。（6）在卵巢癌细胞SKOV3、Ca OV3中过表达MT1M,采用SRB实验考察过表达MT1M对卵巢癌细胞增殖的影响;（7）在卵巢癌细胞SKOV3、Ca OV3中过表达MT1M或敲除MT1M,采用Transwell实验和划痕愈合实验考察MT1M的表达对卵巢癌细胞迁移的影响;（8）在SKOV3细胞中过表达MT1M,并收集上清作条件培养基,考察MT1M的分泌对卵巢癌细胞迁移的影响;（9）在卵巢癌细胞OVCAR8上过表达PARP1,采用划痕实验考察PARP1的高度表达对卵巢癌细胞迁移的影响;同时在SKOV3和Ca OV3上敲除PARP1,采用Transwell实验考察沉默PARP1对卵巢癌细胞迁移的影响。研究结果:（1）PARP1 m RNA表达与与卵巢癌、乳头状肾细胞癌、ER+乳腺癌、子宫体癌等的无疾病生存期呈负相关。而PARP1 m RNA的表达与膀胱癌、睾丸生殖细胞肿瘤、头颈鳞状细胞癌、以胰腺导管腺癌患者的无疾病生存期没有明显的相关性。（2）采用Kmplot数据库分析卵巢癌、子宫体癌、乳头状肾细胞癌、ER+乳腺癌,这四种肿瘤中与PARP1表达呈负相关的基因,发现91个基因与PARP1的表达呈负相关。（3）在卵巢癌细胞OVCAR8上,分析过表达PARP1转录表达显着降低的基因,沉默PARP1转录表达显着增加的基因以给予Olaparib转录表达显着增加的基因,发现13个基因与PARP1的表达呈负相关。（4）对比重合分析TCGA数据库得到的91个基因与卵巢癌细胞OVCAR8基因芯片得到的13个基因,发现了与PARP1表达呈负相关的靶基因-MT1M。（5）在卵巢癌细胞SKOV3、Ca OV3和OVCAR8,沉默PARP1,MT1M的转录表达显着增加,其蛋白表达也显着增加。同时发现敲除PARP1,能够促进MT1M的分泌。（6）过表达MT1M不影响卵巢癌细胞的增殖。在卵巢癌细胞SKOV3和Ca OV3上,过表达MT1M,通过SRB法检测细胞增殖,结果显示MT1M的高度表达对卵巢肿瘤细胞增殖没有影响。（7）MT1M的表达可影响卵巢癌细胞的迁移。在卵巢癌细胞SKOV3和Ca OV3上,过表达MT1M能够显着抑制卵巢癌细胞的迁移;而敲除MT1M,SKOV3的迁移能力显着增强。（8）MT1M的分泌可影响卵巢细胞的迁移。在SKOV3上,首先过表达MT1M,并收集过表达成功后的细胞上清作为条件培养基,再通过Traswell法发现过表达MT1M的条件培养基可显着抑制SKOV3细胞的迁移。（9）PARP1的表达可影响卵巢癌细胞的迁移。在卵巢癌细胞OVCAR8上,过表达PARP1,通过划痕实验法发现PARP1的高度表达可显着抑制卵巢细胞迁移;而敲除PARP1则明显抑制卵巢癌细胞SKOV3和Ca OV3的迁移能力。第二部分PARP1抑制卵巢癌MT1M转录的分子机制研究研究方法:（1）采用数据库预测分析潜在调控MT1M表达的转录因子,采用q RT-PCR实验考察在卵巢癌细胞SKOV3中,沉默预测的转录因子在Olaparib上调MT1M转录表达中的作用,筛选到转录因子FOXP3（Forkhead box 3）;（2）考察FOXP3的表达对MT1M转录表达蛋白表达的影响;（3）采用免疫共沉淀方法,考察PARP1与FOXP3的结合情况;（4）采用检测PAR修饰的实验方法,考察PARP1对FOXP3核糖基化修饰的情况;（5）采用检测PAR修饰的实验方法,考察给予Olaparib对PARP1核糖基化FOXP3的影响;（6）采用核糖基化位点突变的PARP1（Flag-PARP1-E988K）,考察位点突变Flag-PARP1-E988K对FOXP3核糖基化修饰的影响;（7）采用荧光素酶报告基因法,考察PARP1和Flag-PARP1-E988K对FOXP3介导的MT1M转录表达的影响;（8）采用Western blotting实验方法考察在卵巢癌细胞OVCAR8上,给予Olaparib和敲除PARP1对FOXP3蛋白表达的影响。研究结果:（1）PARP1通过FOXP3调控MT1M的转录首先,采用数据库预测分析MT1M潜在的转录因子,发现STAT1、STAT3、FOXP3和E2F1等转录因子可能是调控MT1M表达的转录因子,进一步采用q RT-PCR实验考察在卵巢癌细胞SKOV3中,沉默这些转录因子考察其在Olaparib上调MT1M转录表达中的作用,筛选到转录因子FOXP3即沉默FOXP3,Olaparib上调MT1M的作用消失。（2）FOXP3调控MT1M的转录表达蛋白表达在SKOV3细胞中过表达FOXP3和敲除FOXP3,采用western blotting和q RT-PCR实验方法考察过表达FOXP3和沉默FOXP3对MT1M转录蛋白表达的影响,发现过表达FOXP3能够显着增加MT1M的转录水平和蛋白水平;而敲除FOXP3则明显下调MT1M的转录蛋白水平。（3）PARP1与FOXP3直接结合。在293T细胞中,过表达Flag-PARP1和HA-FOXP3,采用免疫沉淀的方法,发现PARP1与FOXP3之间存在结合。（4）PARP1促使FOXP3发生核糖基化修饰在293T细胞中,过表达Flag-PARP1和HA-FOXP3,采用检测PAR修饰的方法,发现PARP1促使FOXP3发生核糖基化修饰。（5）Olaprib能够抑制由PARP1介导FOXP3发生核糖基化修饰在293T细胞中,过表达Flag-PARP1和HA-FOXP3,并给予Olaparib作用6h,采用检测PAR修饰的方法,发现给予PARP抑制剂Olaparib后则抑制PARP1促使FOXP3发生核糖基化修饰。（6）核糖基化活性突变的质粒Flag-PARP1-E988K不能使FOXP3发生核糖基化修饰。同时在293T细胞上,过表达Flag-PARP1-E988K和HA-FOXP3,采用检测PAR修饰的方法,发现Flag-PARP1-E988K不能使FOXP3发生核糖基化修饰。（7）PARP1通过调控FOXP3的核糖基化修饰从而调控MT1M的转录表达。在卵巢癌细胞SKOV3上,过表达Vector、HA-FOXP3、Flag-PARP1、Flag-PARP1-E988K、HA-FOXP3+Flag-PARP以HA-FOXP3+Flag-PARP1-E988K,采用荧光素酶报告基因法,发现HA-FOXP3促进MT1M的转录表达,而PARP1则抑制由FOXP3介导的MT1M的转录表达;PARP1-E988K由于其核糖基化功能缺失不影响由FOXP3介导的MT1M的转录表达。（8）在卵巢癌细胞中,给予Olaparib以沉默PARP1对FOXP3表达的影响在卵巢癌细胞OVCAR8上,给予Olaparib,发现FOXP3的蛋白表达随着Olaparib浓度的增加而增加;而在SKOV3和Ca OV3上敲除PARP1,则促进FOXP3的蛋白表达。第三部分PARP抑制剂促进MT1M表达抗卵巢癌转移的作用研究研究方法:（1）在卵巢癌细胞SKOV3和OVCAR8中,给予不同浓度的Olaparib,采用Western blotting法、q RT-PCR法以Elisa法来考察Olaparib对MT1M蛋白表达、转录表达以分泌的影响;（2）在卵巢细胞SKOV3和Ca OV3上,给予不同的PARP抑制剂Olaparib、Veliparib和Niraparib,采用划痕愈合实验和Transwell小室法来考察不同的PARP抑制剂对卵巢细胞迁移的影响;（3）采用慢病毒构建MT1M稳定敲除的卵巢癌细胞SKOV3（sh-MT1M）,再给予PARP抑制剂Olaparib,考察MT1M在PARP抑制剂抑制卵巢癌细胞迁移中的作用;（4）采用尾静脉接种Ca OV3形成转移的裸鼠模型,给予Olaparib,考察PARP抑制剂对卵巢癌细胞转移的影响;（5）采用人源高转移卵巢癌PDX模型,通过腋下接种方式,并给予Olaparib,考察Olaparib对卵巢癌转移的影响,以MT1M在PARP抑制剂抗肿瘤转移中的作用。研究结果:（1）PARP抑制剂可以上调卵巢癌细胞MT1M转录表达以分泌在卵巢癌细胞SKOV3、Ca OV3和OVCAR8上,给予浓度梯度的Olaparib,Western blotting法和q RT-PCR法检测MT1M的表达分泌,发现Olaparib浓度依赖上调MT1M的转录蛋白表达。同时给予不同的PARP抑制剂,采用Elisa法检测对MT1M分泌的影响,发现这些PARP抑制剂均能促进MT1M的分泌。（2）不同的PARP抑制剂均能明显抑制卵巢癌细胞的迁移在卵巢癌细胞SKOV3和Ca OV3,采用划痕愈合实验和Transwell小室法,考察不同抑制剂对卵巢癌细胞迁移的影响。结果显示不同的PARP抑制剂均能显着抑制卵巢癌细胞的迁移。（3）敲除MT1M能够显着抑制PARP抑制剂抑制卵巢癌细胞迁移的能力构建稳定敲除MT1M的卵巢癌细胞株,在此基础上给予Olaparib作用,采用Transwell法检测对卵巢癌细胞迁移的影响。结果显示,敲除MT1M的卵巢癌细胞的迁移能力明显增强,而在敲除MT1M的卵巢癌细胞中给予Olaparib,发现Olaparib抑制卵巢癌细胞迁移的作用消失。（4）体内动物实验显示Olaparib可以显着卵巢癌转移,并促进MT1M的表达在尾静脉接种Ca OV3卵巢癌转移模型中,H&E染色结果显示Olaparib明显抑制肺内肿瘤转移灶点的形成。采用Elisa法检测血清中的MT1M,发现Olaparib促进MT1M的分泌。在人源高转移卵巢癌PDX模型,Olaparib抑制剂不影响肿瘤的生长。采用包氏固定法以H&E染色结果显示,Olaparib可以抑制卵巢细胞的肺转移。采用Western blotting法、q RT-PCR法以Elisa法来考察Olaparib对肿瘤内MT1M蛋白表达、转录表达以分泌的影响,结果显示Olaparib可以上调肿瘤内MT1M的转录表达以蛋白表达,并促进MT1M的分泌。研究结论:本研究发现PARP1新的靶基因MT1M,且在卵巢癌细胞中PARP1负性调控卵巢癌细胞MT1M的表达;而MT1M的高度表达能够抑制卵巢癌细胞迁移但不影响肿瘤细胞增殖;进一步研究发现FOXP3调控MT1M的表达并参与PARP1负性调控MT1M的转录表达,即PARP1与FOXP3结合使FOXP3发生核糖基化修饰,抑制FOXP3的转录活性,进而抑制MT1M的转录表达。体内动物实验验证了PARP抑制剂Olaparib确实能够抑制卵巢癌细胞的转移,促进肿瘤细胞表达MT1M。本研究不仅发现了调控卵巢癌转移的新机制,也为PARP抑制剂在卵巢癌治疗中的应用提供新的理论依据。
王宇[5]（2020）在《BET蛋白抑制剂JQ1增强索拉非尼对肝癌细胞的增殖抑制作用及机制》文中研究说明研究背景肝细胞癌是临床上常见的恶性肿瘤,居恶性肿瘤的第5位,在全世界与肿瘤相关的死亡中排第3位。肝细胞癌（HCC）是肝癌的主要组织学亚型,占原发性肝癌的90%,遗传和表观遗传学改变,慢性乙型病毒感染或丙型肝炎病毒感染,黄曲霉毒素暴露,吸烟,肥胖和糖尿病是肝癌的主要危险因素,肝癌预后不良的原因主要是由于高发生率的肿瘤复发和转移。目前,移植是治疗HCC的最有效方法,但由于肿瘤负担或肝功能不良,超过70%的晚期病例不适合移植。晚期不能耐受uuouuuuu手术的患者主要采取化疗,多靶点激酶抑制剂索拉非尼是FDA批准的一线靶向药物,但是也只能为晚期肝癌患者提供2.8个月的生存获益,此外由于不良反应和耐药性,使得其治疗效果尚不满意,因此努力寻找有效的药物和最优化的治疗方法是当前的研究重点。BRD4全称为bromodomain-containing protein 4,即溴结构域蛋白4,属于BET家族成员。BET溴结构域（bromodomain and extra-terminal domain）包含四种蛋白,即BRD2、BRD3、BRD4和BRDT。BET具有保守的模块化结构:包括两段N-末端串联BRD效应模块（BD1和BD2）,一段额外的末端基团（ET）,几组保守的区域（A,B,SEED区域）和C-末端区域（CTM）。含溴结构域的蛋白质4（BRD4）是BET家族中最重要的成员,并深入参与表观遗传学的调控。BRD4蛋白可以通过其溴结构域结合整个细胞周期中的乙酰化组蛋白,并通过募集不同的转录调节因子,来调节靶基因的表达,另外,BRD4蛋白能够与RNA聚合酶II（Pol II）,正向转录延长因子（Positive transcription elongation factor,P-TEFb）结合来调节癌基因（如MYC基因等）的转录过程,从而调控细胞的增殖与凋亡。有研究显示,BRD4的表达失调与肺癌、血液系统肿瘤、乳腺癌、结肠癌以及肝癌等多种癌症疾病的形成有关。这些发现表明,BRD4在肿瘤发生和发展中起重要作用,靶向BRD4可能是一种有前途的癌症治疗策略。JQ1是BET蛋白的小分子抑制剂,可与BET溴结构域乙酰化赖氨酸残基竞争性结合,从而阻断含溴结构域的蛋白质（BRD）的功能。JQ1已经在多种癌症中（如多发性骨髓瘤、急性髓性白血病、乳腺癌等）均观察到有希望的抗增殖作用和临床意义,本研究通过观察JQ1联合索拉非尼对肝癌细胞株的增殖抑制作用,并探讨其可能的机制,为肝癌的临床治疗提供理论基础。目的通过将JQ1与索拉非尼分别作用以及联合作用于Hep G2和Bel-7402肝癌细胞,在不同的时间段观察JQ1是否增强了索拉非尼对Hep G2和Bel-7402的增殖抑制、细胞周期抑制、凋亡抑制以及对凋亡蛋白Bcl-2、BIM和癌基因c-MYC的蛋白的表达影响,来阐明BRD4抑制剂JQ1是否能增加索拉非尼在肝癌细胞的增殖抑制。方法（1）分别使用5个浓度梯度的（0.25μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM）的JQ1和5个浓度梯度（1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM）的索拉非尼作用于Hep G2和Bel-7402肝癌细胞,MTT法分别检测不同浓度药物对肝癌细胞的增殖抑制率,绘制浓度-抑制率曲线图,计算出JQ1和索拉非尼分别作用于两种肝癌细胞的IC50值,以便选取后续实验所需药物浓度。（2）分别选用合适浓度的JQ1、索拉非尼以及二者联合作用于Hep G2和Bel-7402肝癌细胞,24h及48h后MTT法检测各组药物对肝癌细胞的增殖抑制率,并且计算出两种药物的联合用药指数CI。（3）JQ1和索拉非尼分别作用于以及二者联合作用于Hep G2和Bel-7402肝癌细胞,流式细胞仪检测各组对肝癌细胞细胞周期的影响。（4）JQ1和索拉非尼分别作用于以及二者联合作用于Hep G2和Bel-7402肝癌细胞,流式细胞仪检测各组对肝癌细胞凋亡率的影响。（5）JQ1和索拉非尼分别作用于以及二者联合作用于Hep G2和Bel-7402肝癌细胞,Western-Blot检测凋亡蛋白Bcl-2,BIM,癌基因c-MYC的表达。结果（1）MTT实验结果显示JQ和索拉非尼药物分别呈剂量依赖性抑制Hep G2和Bel-7402肝癌细胞的增殖。在Hep G2中,JQ1的IC50为3.00±0.95（μmol/L）为,索拉非尼的IC50为11.43±2.60（μmol/L）为;在Bel-7402中,JQ1的IC50为2.60±0.65（μmol/L）,索拉非尼的IC50为11.68±2.19（μmol/L）。与JQ1和索拉非尼药物单独作用相比,JQ1与索拉非尼联合作用对细胞增殖抑制率明显增加,JQ1可以增加索拉非尼对肝癌细胞的增殖抑制,联合用药指数CI显示两种药物为协同作用。（2）流式细胞周期实验显示,在Hep G2和Bel-7402中,与JQ1和索拉非尼药物单独作用相比,JQ1和索拉非尼联合作用后肝癌细胞G1期细胞增加,而S期肝癌细胞减少,JQ1可以增加索拉非尼对肝癌细胞的周期抑制。（3）流式细胞凋亡实验结果显示,在Hep G2和Bel-7402中,JQ1和索拉非尼联合作用后,肝癌细胞的凋亡率较JQ1和索拉非尼药物单独作用时明显增加,JQ1可以增加索拉非尼在肝癌细胞中的凋亡作用。（4）Western Blot结果显示在Hep G2和Bel-7402中,JQ1可以增加索拉非尼对凋亡Bcl-2蛋白,癌基因c-MYC蛋白的抑制,以及促进凋亡BIM蛋白的表达。结论本结果表明一定浓度的JQ1能增强索拉非尼对肝癌细胞株的增殖抑制与诱导凋亡作用,其作用机制可能与改变细胞周期分布,下调Bcl-2及c-MYC的表达,上调BIM蛋白的表达有关。
孙伊娜[6]（2019）在《MLL基因重排阳性儿童急性淋巴细胞白血病预后相关因素分析与研究》文中研究指明随着诊断及治疗方法的不断改进,目前国内外儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）治愈率已经比较高,但仍有一些儿童难治或复发,其中混合谱系白血病（MLL）基因重排儿童ALL是公认的预后不良类型之一。不同年龄、伙伴基因、治疗策略和早期治疗反应对MLL基因重排白血病预后有很大差异。随着二代测序技术的日益成熟,RNA-seq技术逐步应用于白血病的基因诊断,对于精准的鉴定不良预后基因,显得极为重要。本研究从临床特征、治疗反应及差异表达基因几个方面分析和研究MLL重排阳性儿童ALL预后不良因素,为进一步分层及个体化治疗奠定基础。第一部分 MLL基因重排儿童急性淋巴细胞白血病接受CCLG-ALL2008方案治疗疗效和预后因素分析目的:探讨MLL基因重排儿童ALL接受CCLG-ALL2008方案治疗疗效和预后相关因素。方法:2008年4月至2015年10月共227例ALL患儿接受CCLG-ALL2008高危组方案治疗,其中MLL阳性30例,BCR/ABL阳性24例,MLL和BCR/ABL双阴性173例,MLL阴性197例。MLL阳性组分别与BCR/ABL 阳性组、MLL及BCR/ABL双阴性组和MLL阴性组比较临床特征和治疗反应,并长期随访,对组间及组内进行生存分析。结果:1、MLL阳性组与其它组比较:年龄<2岁比例较其他组明显增高;第15天骨髓非M1（原始+幼稚细胞<5%）比例明显低于阴性组和双阴性组;第33天完全缓解（CR）患儿较BCR/ABL 阳性组明显增高;第33天骨髓MRD≥1×10-2比例较BCR/ABL 阳性组明显低。10年总生存率（OS）和无复发生存率（RFS）MLL阳性组比BCR/ABL 阳性组高。2、MLL阳性组内比较:年龄<2岁患儿10年OS和RFS显着低于年龄≥2岁患儿。强的松不敏感患儿10年OS和RFS显着低于强的松敏感患儿。第33天未缓解（NR）组10年OS和RFS显着低于CR组。多变量COX回归分析发现:年龄、基因重排形式、强的松反应对患儿生存期有影响。结论:CCLG-ALL2008高危组方案对于年龄<2岁、MLL/AF4重排、强的松反应不敏感和第33天未缓解患儿治疗效果不佳;年龄<2岁、MLL/AF4重排、强的松不敏感以及第33天未缓解与MLL重排儿童ALL预后不良相关。第二部分 应用RNA-seq初步研究MLL重排儿童急性淋巴细胞白血病差异表达基因与预后的相关性目的:应用RNA-seq技术鉴定MLL基因及伙伴基因,通过分析差异表达基因,推测预后不良基因。方法:1、2014年4月至2018年4月在苏州大学附属儿童医院接受正规治疗的15例MLL重排阳性及5例阴性儿童ALL病例,用RNA-seq测定基因表达及鉴定伙伴基因。2、差异表达基因（DEGs）通过Cuffdiff算法来分析,并对DEGs进行GO功能和KEGG信号通路富集分析,通过分析前20个差异最显着DEGs富集到有意义的GO功能和KEGG信号通路,筛选出预后相关基因。结果:1、通过RNA-seq 15例ALL病例全部鉴定出MLL基因及伙伴基因。2、差异表达基因分析发现,MLL重排阳性组对阴性组,复发组对未复发组,泼尼松耐药组对敏感组,存在明显的差异表达基因;前20上调DEGs富集到有意义的GO功能和 KEGG 信号通路,MLL 阳性组有:CCNA1、LAMP5、CXCL8、MAP7、IL1RL1、NTRK1、PROM1;复发组中有:IL1RL1、GATA2、IL5RA、CXCL8、CXCR2、CXCR1。结论:1、RNA-seq鉴定融合基因非常精准,有望成为白血病分子生物学诊断新方法。2、CXCL8、IL1RL1、CCNA1、LAMP5、PROM1、GATA2、CXCR2 以及 CXCR1高表达可能与MLL重排阳性儿童ALL预后不良相关。
吴芳[7]（2019）在《BRD4抑制剂抗小细胞肺癌作用的研究》文中指出目的:本研究拟通过检测小细胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）患者组织标本中布罗莫结构域4（bromodomain 4,BRD4）、c-Myc的表达,评估SCLC患者BRD4、c-Myc表达与预后的关系;并通过裸鼠成瘤及PDX-SCLC实验验证靶向BRD4双功能结构域的新型卡啉类化合物体内抗SCLC活性及安全性。内容与方法:通过免疫组化检测本院2012年4月至2017年12月共137例SCLC患者标本中BRD4、c-Myc的表达情况,并分析其表达水平与患者临床病理特征和生存预后的关系。最后通过裸鼠成瘤及PDX肺癌模型进一步验证NHWD-870体内抗肿瘤活性及安全性。结果:（1）在137例SCLC患者肺癌标本中,BRD4免疫组化阳性率为25.5%,c-Myc的阳性率为21.8%,c-Myc与BRD4表达的一致性为54.3%。（2）局限期SCLC患者,BRD4、c-Myc的表达强度与患者的OS成负相关,且有统计学意义（p=0.02和p=0.03）;BRD4高表达与低表达患者的中位OS分别为27.3个月和33.9个月;c-Myc高表达与低表达患者的中位OS分别为28.8个月和33.9个月。但对于广泛期SCLC患者,BRD4、c-Myc的表达水平跟OS没有密切关系（p=0.42和p=0.39）。（3）在裸鼠体内实验中,NHWD-870与NHWD-870HCL都能显着抑制SCLC裸鼠肿瘤的生长（p=0.000和p=0.019）,且没有不耐受的不良反应。（4）NHWD-870HCL联合EP具有协同抗SCLC的作用（p=0.001）。（5）NHWD-870HCL能显着抑制PDX-SCLC的生长（p=0.013）,且没有不耐受的不良反应。结论:局限期SCLC患者BRD4、c-Myc高表达且与预后差相关。NHWD-870与NHWD-870HCL能明显抑制SCLC裸鼠肿瘤（CDX和PDX）的增殖,且NHWD-870HCL联合EP具有协同抗SCLC肿瘤的作用。
蒋敏[8]（2019）在《NF-κB信号通路在慢性淋巴细胞白血病中的作用和机制探讨》文中研究说明慢性淋巴细胞白血病是一种单克隆B淋巴细胞在外周血、骨髓和外周淋巴组织或器官中聚集的疾病。NF-κB是一种具有多向性转录调节作用的蛋白质因子家族。研究发现,CLL细胞中NF-κB活性可呈一定程度的增强,NF-κB表达和活性的变化与CLL细胞的生存率之间存在密切的联系,但CLL中NF-κB活化的具体机制至今尚不清楚。本研究选择由苏州大学附属第一医院血液科明确诊断的CLL患者的骨髓标本作为研究对象,对NF-κB家族成员mRNA表达水平进行分析,发现骨髓来源CLL细胞中NF-κB家族各成员在CLL细胞中存在不同程度的表达。NF-κB的DNA结合活性分析发现,CLL患者骨髓细胞中NF-κB活性具有异质性。定量分析显示,CLL患者骨髓B细胞的平均RelA活性明显高于正常人B细胞。CLL患者骨髓B细胞与正常人B细胞的RelB活性无显着性差异。RelB活性在不同CLL患者中差异显着。RelB在CLL-B细胞中确实存在,但只在部分CLL-B细胞中升高。对不同NF-κB活性的CLL患者进行临床特征性分析,发现RelA高表达、RelB低表达的患者,常处于疾病早期,且IgHV为突变状态,提示预后较好。将CLL-B细胞在有骨髓基质细胞和无基质细胞两种条件下进行培养,通过流式细胞术对不同NF-κB活性的CLL-B细胞死亡率进行分析,结果发现,无论有无骨髓基质细胞存在,RelA+/RelB+组生存率均高于RelA+/RelB-组。RelB活性增强,同时有RelA活性,标志着骨髓中CLL-B细胞的生存优势。CLL-骨髓基质细胞共培养诱导CLL-B细胞RelA和RelB的表达。通过探讨RelB活性与CLL患者对氟达拉滨和蛋白酶体抑制剂（PS-341,MG-132）的敏感性的关系,发现CLL-B细胞对氟达拉滨的敏感性与RelB活性无关。RelB的活化使CLL-B细胞对蛋白酶体抑制剂的反应性增强。与MG-132相比,PS-341诱导CLL-B细胞的死亡率更高。NOTCH1和MYD88基因突变介导NF-κB活化,与CLL化疗耐药和不良预后相关。在本研究中,我们建立了一个准确而灵敏的HRM法,检测出6.02%（8/133）的CLL患者存在NOTCH1的PEST区域的基因突变,而8例突变患者中有7例的熔解曲线完全相同,经直接测序法证实为c.75417542delCT（p.P2514fs*4）突变,1名患者的熔解曲线与前7例也存在不同,经直接测序法被确认为c.75357536 insC（p.2513fs*3）突变。4.65%（6/129）的CLL患者具有与野生型完全不同的熔解曲线,经直接测序法证实存在MYD88 p.L265P突变。所有CLL标本均经过直接测序法进一步验证,结果发现,HRM结果与直接测序法完全一致,准确性达到100%。通过分析HRM法和直接测序法的敏感性进行比较,发现直接测序法和HRM法的敏感性分别为10%和1%,HRM法的敏感性优于直接测序法。我们建立的NF-κB通路相关分子NOTCH1和MYD88基因的HRM突变检测方法有效、快速、敏感,与直接测序法相比,它具有更高的敏感度、更短的检测时间,非常适用于常规进行CLL患者基因突变的高通量筛查,有助于患者个体化临床治疗策略的制定和确认。第一部分经典性和非经典性NF-κB活性在慢性淋巴细胞白血病中的作用目的:分析CLL中经典和非经典性NF-κB信号通路的活性和表达。方法:1,采用qRT-PCR法检测CLL患者骨髓中B细胞的NF-κB家族成员的mRNA表达水平,并与正常人骨髓来源的B细胞进行比较。2,通过凝胶迁移实验和NF-κB DNA结合实验对CLL细胞中NF-κB的DNA结合活性分别进行定性和定量分析。3,对不同NF-κB活性的CLL患者进行临床特征性分析。结果:1,NF-κB家族各成员在CLL细胞中存在不同程度的表达。所有CLL患者的B细胞中均存在RelA mRNA的表达。p50、RelB和p52的mRNA表达在CLL患者中存在差异,部分患者未测出。2,凝胶迁移实验发现部分CLL患者骨髓细胞中CD19+CD5+细胞核蛋白检测到很强的κB-DNA结合活性;部分患者κB-DNA结合活性弱,还有一些几乎检测不到κB-DNA结合活性。NF-κB DNA结合实验定量结果显示,CLL患者骨髓细胞平均RelA活性明显高于正常人的B细胞。CLL患者骨髓B细胞与正常人B细胞RelB活性无显着性差异。RelB活性在不同CLL患者中差异显着。RelB在CLL-B细胞中确实存在,但只在部分CLL-B细胞中升高。3,不同NF-κB活性的CLL患者临床特征分析发现,RelA高表达、RelB低表达的患者,常处于病程早期并伴有IgHV突变状态,提示预后较好。RelB活性与细胞的遗传学改变、ZAP-70和CD38的表达,NOTCH1基因突变与否无相关性。结论:CLL患者骨髓B细胞中均有RelA mRNA的表达,部分的CLL-B细胞中有RelB mRNA的表达。不同CLL-B细胞中RelA mRNA和RelB mRNA表达水平不同;CLL患者骨髓细胞平均RelA活性明显高于正常人的B细胞,CLL患者骨髓B细胞与正常人B细胞RelB活性无显着性差异,RelB活性在不同CLL患者中差异显着;RelA高表达,RelB低表达的患者与IgHV突变呈正相关,预后较好。第二部分非经典途径NF-κB分子活性影响CLL细胞对蛋白酶体抑制剂的敏感性目的:研究不同NF-κB信号通路活性对CLL细胞体外存活的影响以及对蛋白酶体抑制剂的敏感性。方法:1,将CLL-B细胞在有骨髓基质细胞和无基质细胞两种条件下进行培养,采用流式细胞术在0、24、48和72 h分别检测CLL细胞死亡率。2,采用Western blot法检测共培养后CLL-B细胞中RelA和RelB的表达。3,CLL-B细胞分别与氟达拉滨以及蛋白酶体抑制剂MG-132和PS-341共同孵育,共培养0、24、48和72 h,采用流式细胞术检测CLL细胞的死亡率。结果:1,无骨髓基质细胞参与情况下:RelA+/RelB-组骨髓中的CLL-B细胞比RelA+/RelB+组中的细胞早24 h开始死亡。存在骨髓基质细胞进行培养情况下,RelA+/RelB-组死亡率均高于RelA+/RelB+组,差异有显着性。无论有无骨髓基质细胞存在,RelA+/RelB+组生存率高于RelA+/RelB-组。2,骨髓基质细胞与CLL-B细胞相互作用,诱导RelA+/RelB-组骨髓CLL-B细胞中RelA和RelB的表达,并呈时间依赖性。在RelA+/RelB+组,骨髓基质细胞与CLL-B细胞相互作用,RelB在细胞浆中的表达降低,但RelB在细胞核中的表达显着增强。3,在RelA+/RelB+和RelA+/RelB-组间,不管是否存在骨髓基质细胞,使用氟达拉滨治疗下,两者细胞的死亡率差异无统计学差异（P>0.05）。4,加入1μM MG-132后,与骨髓基质细胞共培养24h和48 h时,RelA+/RelB+组的细胞死亡率高于氟达拉滨,差异有显着性（P<0.05）;而RelA+/RelB-组无此情况（P>0.05）;骨髓基质细胞对 RelA+/RelB+和 RelA+/RelB-组 B细胞在MG-132治疗中起到保护作用。无论骨髓细胞存在与否的条件下,RelA+/RelB-组的CLL-B细胞对MG-132的敏感度均偏低。5,在有骨髓基质细胞或无骨髓基质细胞共培养情况下,PS-341处理后,各时间点CLL-B细胞的死亡率明显高于氟达拉滨和 MG-132（P<0.05）。培养 24 h 和 48 h 后,在 RelA+/RelB+组,PS-341 诱导细胞死亡率高于RelA+/RelB-组（P<0.05）,且与骨髓基质细胞存在与否无关,骨髓基质细胞对PS-341治疗下细胞的保护仅发生在24 h。结论:1,RelB活性增强,同时有RelA活性,标志着骨髓中CLL-B细胞的生存优势。2,CLL-骨髓基质细胞共培养,诱导CLL-B细胞的RelA和RelB表达,这是骨髓基质细胞发挥保护作用的原因。3,骨髓中CLL-B细胞对氟达拉滨的敏感性与RelB无关。RelB的活化使CLL-B细胞对蛋白酶体抑制剂的反应性增强。与MG-132相比,PS-341诱导CLL-B细胞的死亡率更高。第三部分与NF-κB活性相关分子NOTCH1基因突变的HRM检测方法的建立及其意义目的:建立筛查NOTCH1突变的HRM方法并探讨NOTCH1突变在CLL中突变的意义。方法:采集133例CLL患者骨髓,提取CLL-B细胞gDNA。同时培养急性淋巴细胞白血病细胞Molt 4细胞和急性T细胞白血病细胞系Jurkat细胞,作为NOCH1突变的阳性和阴性对照,建立HRM法筛查CLL患者中NOTCH1的突变情况,并与直接测序法进行比较,并对HRM法进行敏感性和准确性的评估。结果:在133例初诊为CLL的患者中,6.02%（8/133）的患者与其余125例其他患者的熔解曲线有明显差异。其中7位患者的熔解曲线一致,经直接测序法确认为c.75417542delCT（p.P2514fs*4）突变。1名患者的突变完全不同,经直接测序法被确认为c.75357536 insC（p.2513fs*3）突变。HRM分析检测到的突变的结果与直接测序的结果是完全一致的,准确性达到100%,直接测序法和HRM法的敏感性分别为10和1%,HRM法的敏感性优于直接测序法。结论:HRM法通过产生的不同熔解曲线来分辨CLL患者NOTCH1野生型和突变型的标本,结果经直接测序法证实为可靠,且灵敏度较高,可以作为临床筛查慢性淋巴细胞白血病NOTCH1基因突变的常规检查方法。第四部分与NF-κB活性相关分子MYD88基因突变的HRM检测方法的建立及其意义目的:建立筛查MYD88突变的HRM方法并探讨MYD88突变在CLL中突变的意义。方法:采集129例CLL患者骨髓,提取CLL-B细胞gDNA,采用TA克隆法制备MYD88野生型质粒,采用定点突变法制备MYD88突变型质粒,分别作为阴性和阳性对照,建立HRM法筛查CLL患者中最常见的MYD88 p.L265P的突变,并与直接测序法进行比较,并对HRM法进行敏感性和准确性的评估。结果:通过HRM法,发现129例标本中有6例出现MYD88 p.L265P突变,突变率4.65%。结果与直接测序法完全一致,准确性达到100%。直接测序和HRM的敏感性分别为10和1%,HRM法的敏感性优于直接测序法。结论:HRM与直接测序法比较,有较高的敏感度,操作简便,耗时少。HRM法可以作为临床筛查CLL中MYD88 p.L265P突变的常规检查方法。
黄理杰[9]（2019）在《琼玉膏通过Klotho/FGF-23信号通路延缓斑马鱼衰老的研究》文中进行了进一步梳理目的:探讨琼玉膏（由生地黄、蜂蜜、茯苓、人参4种成分组成）对H202诱导氧化损伤的斑马鱼血清超氧化物岐化酶（Superoxide Dismutase,SOD）、肾组织丙二醛（Malondialdehyde,MDA）水平,肾组织Klotho基因和蛋白表达水平,肾组织Klotho基因甲基化水平的影响情况,探究Klotho/FGF-23信号通路在琼玉膏延缓斑马鱼衰老中发挥作用的分子机制,开拓琼玉膏抗衰老分子机制研究的新领域。方法:模型:选取3月龄成年斑马鱼H202刺激,检测4周存活率和氧化应激水平。同时观察7个不同浓度琼玉膏对斑马鱼存活率的影响。确定最佳H202浓度,设立琼玉膏高、中、低浓度用于后续研究,并确定正式实验高、中、低浓度具体琼玉膏浓度值。分组:共5组,A:正常对照组,B:模型组（200 μ M H202）,C:低浓度琼玉膏组（100 μ g/ml琼玉膏+200 u M H202）,D:中浓度琼玉膏组（200 μ g/ml琼玉膏+200 μ M H202）,E:高浓度琼玉膏组（400 μ g/ml琼玉膏+200μM H202）,每组斑马鱼20尾（雌雄各半）。饲养与给药方法:成鱼于28℃恒温系统集中养殖与繁育,PH=7.2～7.6,水电导率550～650 μ s/cm,流动水,明暗交替变化比例为14H:10H。饲料喂养:每日两次,孵化脱壳丰年虾。给药方法:模型组斑马鱼每天8:00am～16:00pm用纯净养殖水孵育8h,16:00pm～次日8:00am用200 μ M过氧化氢养殖水孵育16h,持续6周;低、中、高浓度琼玉膏组斑马鱼每天8:00am～16:00pm分别用100 μ g/ml、2 00 μ g/ml、4 00 μ g/ml琼玉膏养殖水孵育8h,16:00pm～次日8:00am用200 μM过氧化氢养殖水孵育16h,持续6周。检测指标及对应方法:（1）生化试剂盒检测超氧化物歧化酶（SOD）,丙二醛（MDA）水平;（2）实时定量PCR（Real time PCR）检测Klotho基因表达水平;（3）免疫印迹法（Western blotting）检测Klotho蛋白表达水平;（4）甲基特异性PCR（Methylmion specific PCR,MSP）检测Klotho基因甲基化水平。结果:1.琼玉膏浓度梯度预实验结果:0 μ g/ml、100 μ g/ml、200 μ g/ml、400 μ g/ml组,3月龄斑马鱼4周存活率均为100%;琼玉膏浓度为800 μ g/ml、1600 μ g/ml、3200μ g/ml时,3月龄斑马鱼4周存活率低于100%,从数据结果分析,琼玉膏浓度达到800 μ g/ml时可能药物浓度过高,我们确定琼玉膏浓度梯度为:100 μ g/ml为低浓度琼玉膏组,200 μ g/ml为中浓度琼玉膏组,400 μ g/ml为高浓度琼玉膏组。H2O2浓度梯度预实验表明,H2O2浓度在200 μM以下时,斑马鱼4周存活率均为100%,随着H2O2浓度在400 μM或以上时,斑马鱼出现死亡,从结果分析,我们确定选用浓度为200μM H202作为建模衰老斑马鱼的氧化剂。2.斑马鱼血清SOD结果:多组间差异具有显着统计学意义（P=0.000,P<0.01）。对照组与实验组间Dunett（邓尼特）检验显示:模型组vS正常对照组,P=0.000;低浓度琼玉膏组vs正常对照组,P=0.000;中浓度琼玉膏组vs正常对照组,P=0.000;Evs正常对照组,P=0.090;以上数据表明低浓度琼玉膏组及中浓度琼玉膏组SOD值明显低于正常对照组SOD值,且差异有显着统计学意义,P<0.01;而高浓度琼玉膏组SOD值几乎接近正常对照组SOD值,差异无统计学意义,P>0.05,反映高浓度琼玉膏干预下,衰老斑马鱼中的抗氧化酶SOD几乎接近正常值,抗氧化效果较确切。模型组与实验组间Bonferroni（邦弗伦尼）检验显示:模型组vs低浓度琼玉膏组,P=1.000;模型组vs中浓度琼玉膏组,P=0.000;模型组vs高浓度琼玉膏组,P=0.000;低浓度琼玉膏组vs中浓度琼玉膏组,P=0.001;低浓度琼玉膏组vs高浓度琼玉膏组,P=0.000;中浓度琼玉膏组vs高浓度琼玉膏组,P=0.000;以上数据表明低浓度琼玉膏对提高已造成氧化衰老斑马鱼SOD值无明显效果,差异无统计学意义,P>0.05;但中浓度琼玉膏组及高浓度琼玉膏组对提高衰老斑马鱼SOD值有明显效果,且高浓度琼玉膏效果优于中浓度琼玉膏,差异有显着统计学意义,P<0.01。3.斑马鱼肾组织MDA结果:多组间差异具有显着统计学意义（P=0.000,P<0.01）,对照组与实验组间Dunett（邓尼特）检验显示:模型组vs正常对照组,P=0.000;低浓度琼玉膏组vs正常对照组,P=0.000;中浓度琼玉膏组vs正常对照组,P=0.000;高浓度琼玉膏组vs正常对照组,P=0.018;以上数据表明低、中、高三个浓度琼玉膏组MDA值与正常对照组MDA值间差异有统计学意义,P<0.05,反映低、中、高三个浓度琼玉膏组干预下均未能使衰老斑马鱼中的自由基MDA值下降到接近正常水平。模型组与实验组间Bonferroni（邦弗伦尼）检验显示:模型组vs低浓度琼玉膏组,P=1.000;模型组vs中浓度琼玉膏组,P=0.001;模型组vs高浓度琼玉膏组,P=0.000;低浓度琼玉膏组vs中浓度琼玉膏组,P=0.002;低浓度琼玉膏组vs高浓度琼玉膏组,P=0.000;中浓度琼玉膏组vs高浓度琼玉膏组,P=0.056;以上数据表明低浓度琼玉膏组MDA值与模型组MDA值间差异无统计学意义,P>0.05,反映低浓度琼玉膏对降低已衰老斑马鱼MDA值效果不明显;中浓度琼玉膏组及高浓度琼玉膏组对降低已衰老斑马鱼MDA值效果较为确切,差异有显着统计学意义,P<0.01,但中浓度琼玉膏组效果与高浓度琼玉膏组间差异无统计学意义,P>0.05,这反映可能琼玉膏浓度达到200 μ g/ml以后,增加琼玉膏浓度并不能增加其降低衰老斑马鱼MDA值的效果。4.Real time PCR反应体系检测肾组织Klotho基因表达结果:多组间差异具有显着统计学意义（P=0.000,P<0.01）,对照组与实验组间Dunett（邓尼特）检验显示:模型组vs正常对照组,P=0.000,低浓度琼玉膏组vs正常对照组,P=0.000,中浓度琼玉膏组vs正常对照组,P=0.000,高浓度琼玉膏组vs正常对照组,P=0.209,以上数据表明,低浓度琼玉膏组及中浓度琼玉膏组肾Klotho基因表达水平与正常对照组间差异有显着统计学意义,P<0.01,而高浓度琼玉膏组肾Klotho基因表达水平与正常对照组间差异无统计学意义,P>0.05,反映低浓度琼玉膏及中浓度琼玉膏对增加肾组织Klotho基因表达效果不确切,但高浓度琼玉膏增加肾组织Klotho基因表达效果较为明显。模型组与实验组间Bonferroni（邦弗伦尼）检验显示:模型组vs低浓度琼玉膏组,P=1.000;模型组vs中浓度琼玉膏组,P=0.000;模型组vs高浓度琼玉膏组,P=0.000;低浓度琼玉膏组vs中浓度琼玉膏组,P=0.000;低浓度琼玉膏组vs高浓度琼玉膏组,P=0.000;中浓度琼玉膏组vs高浓度琼玉膏组,P=0.000;以上数据表明低浓度琼玉膏对促进衰老斑马鱼的肾Klotho基因表达无明显效果,差异无统计学意义,P>0.05,但中浓度琼玉膏及高浓度琼玉膏对促进衰老斑马鱼的肾Klotho基因表达有明显效果,且高浓度琼玉膏组优于中浓度琼玉膏组,差异有显着统计学意义,P<0.01。5.Westen blotting检测肾组织Klotho蛋白表达结果:多组间差异具有显着统计学意义（P=0.000,P<0.01）,对照组与实验组间Dunett（邓尼特）检验显示:模型组vs正常对照组,P=0.000,低浓度琼玉膏组vs正常对照组,P=0.000,中浓度琼玉膏组vs正常对照组,P=0.002,高浓度琼玉膏组vs正常对照组,P=0.095;以上数据表明,低、中浓度琼玉膏组肾Klotho蛋白表达水平与正常对照组肾Klotho蛋白表达水平差异有显着统计学意义,P<0.01,但高浓度琼玉膏组肾Klotho蛋白表达水平与正常对照组肾Klotho蛋白表达水平差异无统计学意义,P>0.05,反映只有高浓度琼玉膏能使衰老斑马鱼肾Klotho蛋白表达水平接近正常水平。模型组与实验组间Bonferroni（邦弗伦尼）检验显示:模型组vs低浓度琼玉膏组,P=1.000;模型组vs中浓度琼玉膏组,P=0.006;模型组vs高浓度琼玉膏组,P=0.000;低浓度琼玉膏组vs中浓度琼玉膏组,P=0.038;低浓度琼玉膏组vs高浓度琼玉膏组,P=0.001;中浓度琼玉膏组vs高浓度琼玉膏组,P=0.382;以上数据表明,低浓度琼玉膏组肾Klotho蛋白表达水平与模型组肾Klotho蛋白表达差异无统计学意义,P>0.05,而中、高浓度琼玉膏组与模型组间肾Klotho蛋白表达水平差异有统计学意义,P<0.05,反映低浓度琼玉膏对增加易造成衰老的斑马鱼肾Klotho蛋白表达水平无明显效果,而中浓度琼玉膏及高浓度琼玉膏对增加易造成衰老的斑马鱼肾Klotho蛋白表达水平有较明显效果,且高浓度琼玉膏优于中浓度琼玉膏,差异有统计学意义,P<0.05。6.甲基特异性 PCR（Methylmion specific PCR,MSP）检测肾组织 Klotho 基因甲基化结果:在正常:对照组中,表现为部分甲基化,在模型组和低中剂量组表现为全甲基化,在高剂量琼玉膏组表现为部分甲基化。结论:在过去琼玉膏抗衰老机制研究的基础上,对新的动物模型斑马鱼完善了的琼玉膏浓度梯度预实验,通过观察比较成年斑马鱼的成活率,最终选取100 μ g/ml为低浓度琼玉膏组,200 μg/ml为中浓度琼玉膏组,400 μ g/ml为高浓度琼玉膏组,探索确定了诱导斑马鱼衰老的适当H202浓度为200 μ M。在抗氧化相关指标衰老斑马鱼血清SOD以及肾MDA自由基生产量研究中,可发现中浓度琼玉膏及高浓度琼玉膏对提高氧化衰老斑马鱼SOD值有明显效果,且高浓度琼玉膏效果优于中浓度琼玉膏,高浓度琼玉膏可将衰老斑马鱼血清SOD提高至与正常对照组水平,抗氧化效果较明显。中浓度琼玉膏组及高浓度琼玉膏组对降低氧化衰老斑马鱼MDA值效果较为明显,但琼玉膏浓度达到中浓度200 μ g/ml以后,增加琼玉膏浓度并不能增加其降低衰老斑马鱼MDA值的效果,且低、中、高三个浓度琼玉膏组对降低衰老斑马鱼MDA值均未能达到正常对照组水平。综上所述,琼玉膏对提高衰老斑马鱼抗氧化酶并使其自由基得到一定量清除,证明了琼玉膏可能通过抗氧化应激损伤从而延缓衰老的机制。在过去sirtl/p53信号通路研究琼玉膏延缓斑马鱼衰老的研究基础上,本实验创新研究衰老斑马鱼Klotho/FGF-23信号通路,并发现琼玉膏可提高衰老斑马鱼Klotho基因及蛋白的表达水平,还可一定程度上逆转衰老斑马鱼肾组织Klotho基因甲基化水平,为琼玉膏抗衰老分子机制研究开拓了新的领域。关于琼玉膏抗衰老的机制研究,笔者的导师及其团队在过去10年做了很多工作,对琼玉膏抗衰老蛋基因组学、蛋白组学及代谢组学等方面有丰富的研究基础,过去实验发现琼玉膏的组方虽然简约,却具有很好抗氧化、抗衰老、美容等功效,从中医机制而言,琼玉膏通过健脾补肾,起到充养先天补后天,调补后天以滋养先天的作用;从现代医学机理而言,琼玉膏可能通过逆转抗衰老基因的甲基化、抗氧化、促进抗衰老基因及蛋白的表达,从而促进相关信号通路的表达,起到延缓衰老的作用。本课题是建立在过去研究的基础上不断创新,在导师“全养生”理念指导下,不断更全面、更深入研究,预期通过科研实验,将琼玉膏这一经典养生古方转化为人们可方便使用的养生保健产品、用品。抗衰老工程是一个系统工程,应当涵盖我们的日常生活、衣食住行等方方面面,琼玉膏是我们研究食疗养生、美容养生等具体养生方式的一个有巨大潜力的切入点,为更全面满足日益增长的人们对健康和美丽的需求,作为古方研究者,应该不断革新、创新研究方法和实践方法,古为今用,为当下我国人口老龄化问题以及粤港澳大湾区经济和社会的健康可持续发展作更大贡献。
吕文琼[10]（2019）在《抑制S1PR3促进儿童急性T淋巴细胞白血病细胞凋亡研究》文中认为第一部分儿童急性T淋巴细胞白血病中GPCRs表达紊乱目的:通过高通量RNA转录组测序（High through-put RNA sequencing,RNA-seq）检测儿童急性T淋巴细胞白血病（T cell acute lymphoblastic leukemia,T-ALL）肿瘤细胞中差异表达的G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors,GPCRs）基因。方法:收集13例初发儿童T-ALL骨髓样本,通过Ficoll淋巴细胞分离液分离T-ALL肿瘤细胞;收集4例健康儿童外周血样本,通过人T细胞提取试剂盒分离正常T细胞;提取T-ALL肿瘤细胞及正常T细胞RNA,进行RNA-seq,检测基因mRNA表达水平;通过R语言分析TALL肿瘤细胞及正常T细胞差异表达基因并绘制差异表达基因热图及火山图;通过Gene Ontology对差异表达基因进行GO分析。结果:RNA-seq分析结果显示,相对于健康儿童外周血正常T细胞,13例T-ALL患儿骨髓肿瘤细胞中存在大量肿瘤相关通路基因表达异常;大量GPCRs表达异常;差异表达GPCRs进行GO分析,存在其中鞘氨醇-1-磷酸盐（Sphingosine-1-Phosphate,S1P）信号通路相关基因富集。结论:儿童急性T淋巴细胞白血病骨髓细胞中存在大量异常表达的GPCRs基因,其中S1P信号通路相关基因异常富集。第二部分S1PR3在儿童急性T淋巴细胞白血病中表达增加目的:分析RNA-seq数据S1P信号通路相关基因表达情况;通过查询GEO数据库分析多组T-ALL研究数据S1P信号通路相关基因的表达;在T-ALL细胞系及病人样本中对S1P信号通路相关基因进行验证。方法:分析RNA-seq数据中S1P信号通路相关基因的表达情况。检索GEO数据库,分析多个研究组数据T-ALL中S1P信号通路相关基因表达情况。收集初发儿童T-ALL骨髓上清及非肿瘤患者骨髓,通过ELISA检测骨髓上清S1P及其运载体载脂蛋白M（Apolipoprotein M,Apo M）表达。通过GEO数据库,分析T-ALL细胞中S1P信号通路相关基因的表达情况。收集健康儿童外周血,人T细胞提取试剂盒提取正常T细胞;收集健康儿童胸腺组织,研磨、过滤后获得胸腺细胞;收集非肿瘤患者骨髓,Ficoll淋巴细胞分离液单个核细胞,进一步磁珠分选得CD34+骨髓细胞;收集初诊儿童T-ALL骨髓样本,Ficoll淋巴细胞分离液分离T-ALL肿瘤细胞;培养T-ALL各细胞系细胞;提取细胞RNA,通过Q-PCR检测正常T细胞、CD34+骨髓细胞及T-ALL细胞系中SPHK1、SPHK2及SGPL1的表达水平。通过Q-PCR检测正常T细胞、正常胸腺细胞、CD34+骨髓细胞及T-ALL细胞系中S1PR3的表达水平。通过流式细胞仪检测T-ALL细胞系细胞膜S1PR3的表达水平。通过Q-PCR检测外周血T细胞、临床T-ALL肿瘤细胞S1PR3表达情况。结果:RNA-seq发现与正常T细胞相比,S1P合成酶SPHK2在TALL肿瘤细胞中表达增加,S1P降解酶SGPL1表达下降,S1PR3在TALL肿瘤细胞中表达显着增加,S1PR1、S1PR2、S1PR4及S1PR5表达相对减少。GEO数据库多个T-ALL研究组数据显示,T-ALL肿瘤细胞S1PR3表达显着增加,SPHK1、SPHK2表达相对增加,S1PR1、S1PR2、S1PR4及S1PR5表达相对减少,SGPL1表达相对减少。ELISA检测结果显示T-ALL骨髓上清中S1P及Apo M表达无明显差异。GEO数据库分析及Q-PCR验证结果显示,与外周血T细胞、胸腺细胞、CD34+骨髓细胞相比,T-ALL细胞系S1PR3表达显着增加,SPHK2表达增加,SGPL1表达下降。流式细胞仪结果显示T-ALL细胞系中,JK细胞表面S1PR3表达最高,其次为CEM、MOLT4、CUTLL1。临床患者肿瘤细胞Q-PCR结果显示,T-ALL中S1PR3的表达水平显着增加。结论:分析GEO数据库T-ALL相关研究、同时在T-ALL细胞系及病人样本中进行验证,发现S1P信号通路相关基因在T-ALL差异表达,其中S1PR3表达显着增加。第三部分抑制S1PR3促进儿童急性T淋巴细胞白血病细胞凋亡目的:检测S1PR3分子在体外对T-ALL细胞凋亡的作用方法:通过S1PR3特异性小分子抑制剂TY52156（0、1、3、7、10、15u M）、CAY10444（0、3、5、10、20、30u M）分别作用于T-ALL细胞系,通过Annexin V-APC/7-AAD染色,流式细胞仪检测细胞凋亡。收集并培养原代T-ALL病人肿瘤细胞,CAY10444（0、3、5、10、20、30u M）作用后Annexin V-APC/7-AAD染色,流式细胞仪检测抑制细胞凋亡,激光共聚焦观察Cleaved-caspase3+细胞比例。通过TY52156（0、7、15u M）、CAY10444（0、10、30u M）分别作用于CD34+骨髓细胞,通过Annexin V-APC/7-AAD染色,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:流式细胞仪检测结果显示,S1PR3特异性小分子抑制剂可显着促进T-ALL细胞凋亡,凋亡比例呈药物浓度依赖性;TY52156作用于CEM、MOLT4、JK、CUTLL1的IC50分别为5.23u M、5.78 u M、5.93u M、6 u M。CAY10444作用于CEM、MOLT4、JK、CUTLL1的IC50分别为10.12 u M、13.17 u M、21.59 u M、27.22 u M。S1PR3特异性小分子抑制剂CAY10444作用于1例原代T-ALL病人肿瘤细胞,在30u M时引起88%白血病细胞凋亡。S1PR3特异性小分子抑制剂CAY10444作用于1例原代T-ALL病人肿瘤细胞,激光共聚焦观察Cleaved-caspase3+细胞比例随药物浓度逐渐增加。流式细胞仪检测结果显示,S1PR3特异性小分子抑制剂TY52156、CAY10444分别对CD34+骨髓细胞凋亡无明显影响。结论:特异性抑制S1PR3促进T-ALL细胞凋亡。
二、端粒酶及其抑制剂在白血病中的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、端粒酶及其抑制剂在白血病中的研究进展（论文提纲范文）
（1）hnRNP U对慢性髓细胞白血病细胞增殖和凋亡的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 hnRNP U在慢性髓细胞白血病病人骨髓标本和细胞株中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 hnRNP U对慢性髓细胞白血病细胞增殖和凋亡的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 hnRNP U对慢性髓细胞白血病细胞细胞增殖和凋亡影响的机制 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 hnRNP家族的功能及在白血病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 |
（2）红细胞分布宽度在初诊骨髓增生异常综合征、再生障碍性贫血、急性白血病、慢性粒细胞白血病中的临床分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 RDW概述 |
| 1.2 RDW与血液系统良性疾病研究进展 |
| 1.3 RDW与血液系统恶性疾病研究进展 |
| 1.3.1 RDW与 MDS |
| 1.3.2 RDW与白血病 |
| 1.3.3 RDW与淋巴瘤 |
| 1.3.4 RDW与多发性骨髓瘤 |
| 第二章 资料与研究方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 纳入标准 |
| 2.3 排除标准 |
| 2.4 研究内容及方法 |
| 2.5 AML(非APL)、MDS预后危险度分层标准 |
| 2.6 统计学方法 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 一般资料 |
| 3.2 MDS、AA、AL、CML的 RDW值分布 |
| 3.3 AA中(非重型/重型/极重型)、AL中(ALL/AML)疾病类型与RDW的关系 |
| 3.3.1 AA中非重型、重型、极重型之间的RDW水平比较 |
| 3.3.2 AL中 ALL、AML之间的RDW水平比较 |
| 3.4 MDS、AA、AL、CML的 RDW水平与对照组比较 |
| 3.5 RDW水平在MDS、AA、AL、CML之间的比较 |
| 3.5.1 MDS和AA对比 |
| 3.5.2 MDS和AL对比 |
| 3.5.3 MDS和 CML对比 |
| 3.5.4 AA和AL对比 |
| 3.5.5 AA和CML对比 |
| 3.5.6 AL和CML对比 |
| 3.6 MDS、AML(非APL)预后危险度分层与RDW的相关性 |
| 3.6.1 MDS预后危险度分层与RDW的相关性 |
| 3.6.2 AML(非APL)预后危险度分层与RDW的相关性 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 MDS、AA、AL、CML的年龄及与RDW的关系 |
| 4.2 MDS、AA、AL、CML的 RDW水平 |
| 4.3 RDW水平在MDS、AA、AL、CML之间的比较 |
| 4.4 MDS、AML(非APL)预后危险度分层与RDW的相关性 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 焦亡及NLRP3炎症小体在血液系统肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间研究成果 |
| 致谢 |
（3）芪附扶正合剂联合低剂量传统化疗方案治疗老年急性髓系白血病（非M3）的疗效分析及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1.老年急性髓系白血病西医治疗现状与进展 |
| 1.标准化疗(强化化疗) |
| 2.异基因造血干细胞移植 |
| 3.低强度化疗 |
| 4.靶向治疗 |
| 5.免疫治疗 |
| 参考文献 |
| 2.当代中医治疗急性白血病概况 |
| 2.1 关于急性白血病的中医病名 |
| 2.2 急性白血病的病因病机 |
| 2.3 “伏邪(毒)”概念的提出 |
| 2.4 治疗概况 |
| 2.5.讨论 |
| 参考文献 |
| 3.扶正中药在急性白血病临床与基础研究中的现状 |
| 3.1 扶正中药的临床研究 |
| 3.2 扶正中药的基础研究 |
| 3.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 临床研究 |
| 1.研究目的 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 病例纳入标准 |
| 2.2 病例排除标准 |
| 2.3 一般资料 |
| 2.4 治疗方案 |
| 2.5 支持治疗 |
| 2.6 观察指标 |
| 2.7 疗效评价 |
| 2.8 统计学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 近期效果比较 |
| 3.2 远期效果比较 |
| 3.3 感染并发症比较 |
| 4.讨论 |
| 4.1 芪附扶正合剂组方合理性探讨 |
| 4.2 芪附扶正合剂取得临床疗效的原因分析 |
| 参考文献 |
| 第三部分 实验研究 |
| 1.研究目的 |
| 2.QFFZD含药血清的制备(实验一) |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3.QFFZD含药血清和Ara-C对HL-60细胞增殖和细胞周期的影响(实验二) |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 4.芪附扶正合剂含药血清和阿糖胞苷对HL-60细胞凋亡的影响(实验三) |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 5.芪附扶正合剂含药血清协同阿糖胞苷诱导HL-60细胞凋亡的作用机制(实验四) |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 6.讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 附录 |
| 缩略词表 |
| 急性白血病症状分级量化表 |
| 攻读博士学位期间取得的研究结果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（4）PARP1负性调控MT1M在卵巢癌转移中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 绪论 |
| 1 第一部分PARP1 抑制MT1M转录促进卵巢癌转移的作用研究 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 实验材料与仪器 |
| 1.2.1 细胞株 |
| 1.2.2 感受态细菌 |
| 1.2.3 质粒 |
| 1.2.4 药物与主要试剂 |
| 1.2.5 实验仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 细胞培养 |
| 1.3.2 siRNA转染 |
| 1.3.3 质粒扩增 |
| 1.3.4 质粒转染 |
| 1.3.5 Western blotting法检测蛋白含量 |
| 1.3.6 蛋白质免疫印迹实验(Western blotting) |
| 1.3.7 q RT-PCR检测目的基因m RNA水平 |
| 1.3.8 Elisa检测 |
| 1.3.9 SRB实验检测细胞增殖 |
| 1.3.10 划痕愈合实验 |
| 1.3.11 Transwell小室迁移实验 |
| 1.3.12 条件培养基制备 |
| 1.3.13 数据分析 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 PARP1 调控的潜在靶基因MT1M |
| 1.4.2 卵巢癌基因芯片数据 |
| 1.4.3 PARP1 负性调控MT1M的表达 |
| 1.4.3.1 敲除PARP1对MT1M转录表达与蛋白表达的影响 |
| 1.4.3.2 过表达PARP1对MT1M转录表达与蛋白表达的影响 |
| 1.4.4 敲除PARP1对MT1M分泌的影响 |
| 1.4.5 PARP2和PARP3对MT1M表达的影响 |
| 1.4.6 MT1M表达对卵巢细胞增殖的影响 |
| 1.4.7 MT1M的表达对卵巢细胞迁移影响 |
| 1.4.7.1 MT1M高度表达抑制卵巢细胞迁移 |
| 1.4.7.2 MT1M的低表达促进卵巢细胞迁移 |
| 1.4.8 分泌的MT1M抑制卵巢细胞迁移 |
| 1.4.9 PARP1的表达对卵巢细胞迁移的影响 |
| 1.4.9.1 高度表达PARP1促进卵巢细胞迁移 |
| 1.4.9.2 敲除PARP1抑制卵巢细胞迁移 |
| 1.5 讨论 |
| 2 第二部分PARP1 抑制卵巢癌MT1M转录的分子机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 细胞株 |
| 2.2.2 药物与主要试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 siRNA转染 |
| 2.3.3 质粒扩增 |
| 2.3.4 质粒转染 |
| 2.3.5 Western blotting法检测蛋白含量以Western blotting方法 |
| 2.3.6 q RT-PCR检测目的基因m RNA水平 |
| 2.3.7 免疫共沉淀实验 |
| 2.3.8 PAR修饰实验 |
| 2.3.9 荧光素酶报告基因法(Dual-Luciferase reporter assay) |
| 2.3.10 荧光素酶报告基因信号测定 |
| 2.3.11 数据分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 PARP1 通过FOXP3 调控MT1M的转录表达 |
| 2.4.2 FOXP3 调控MT1M的转录表达 |
| 2.4.3 PARP1与FOXP3 相互结合 |
| 2.4.4 FOXP3发生核糖基化修饰 |
| 2.4.5 PARP1 抑制由FOXP3 介导的MT1M的转录表达 |
| 2.4.6 敲除PARP1 增强卵巢癌细胞FOXP3 的表达 |
| 2.4.7 PARP抑制剂增强卵巢癌细胞FOXP3 的表达 |
| 2.5 讨论 |
| 3 第三部分PARP抑制剂促进MT1M表达抗卵巢癌转移的作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 细胞株 |
| 3.2.2 实验动物 |
| 3.2.3 药物与主要试剂 |
| 3.2.4 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 Western blotting法检测蛋白含量以Western blotting方法 |
| 3.3.3 q RT-PCR检测目的基因m RNA水平 |
| 3.3.4 SRB实验检测细胞增殖 |
| 3.3.5 Elisa实验法 |
| 3.3.6 划痕愈合实验 |
| 3.3.7 Transwell小室实验 |
| 3.3.8 苏木素(Hematoxylin)和伊红(Eosin)染色:H&E染色 |
| 3.3.9 免疫组化染色: |
| 3.3.10 包装慢病毒与感染慢病毒 |
| 3.3.11 动物实验 |
| 3.3.12 数据分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 PARP抑制剂促进MT1M的转录表达与分泌 |
| 3.4.2 PARP抑制剂抑制卵巢癌细胞的迁移 |
| 3.4.3 MT1M在 PARP抑制剂抑制卵巢癌细胞的迁移中的作用 |
| 3.4.4 Olaparib抑制尾静脉接种卵巢癌细胞CaOV3 的肺转移 |
| 3.4.5 Olaparib抑制原代卵巢癌HO-8910PM PDX的动物模型的肺转移 |
| 3.5 讨论 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 综述 PARP1的其他生物学功能:DNA修复之外 |
| 参考文献 |
| 作者简历在学期间所取得的科研成果 |
（5）BET蛋白抑制剂JQ1增强索拉非尼对肝癌细胞的增殖抑制作用及机制（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 2.1 细胞株 |
| 2.2 药物及试剂 |
| 2.3 仪器与设备 |
| 2.4 常用液的配制 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.1.1 细胞传代与培养 |
| 3.1.2 细胞计数 |
| 3.1.3 细胞冻存 |
| 3.1.4 细胞复苏 |
| 3.2 MTT 法测定细胞增殖抑制率 |
| 3.2.1 JQ1和索拉非尼对肝癌细胞增殖抑制率和IC50测定 |
| 3.2.2 JQ1和索拉非尼联用对肝癌细胞增殖抑制率测定 |
| 3.2.3 JQ1和索拉非尼联合用药评价方式 |
| 3.3 流式细胞仪测取细胞周期抑制率 |
| 3.4 流式细胞仪测取细胞凋亡率 |
| 3.5 Western-Blot检测 |
| 3.5.1 蛋白质的样品制备 |
| 3.5.2 蛋白定量 |
| 3.5.3 蛋白电泳 |
| 3.5.4 转膜 |
| 3.5.5 封闭 |
| 3.5.6 一抗孵育 |
| 3.5.7 二抗孵育 |
| 3.5.8 显影 |
| 3.6 统计学方法 |
| 4 结果 |
| 4.1 JQ1对肝癌细胞的增殖抑制作用 |
| 4.2 索拉非尼对肝癌细胞的增殖抑制作用 |
| 4.3 JQ1与索拉非尼联合对人肝癌细胞株增殖抑制作用 |
| 4.4 JQ1 与索拉非尼联合对人肝癌细胞株细胞周期的影响 |
| 4.5 JQ1 和索拉非尼联合对人肝癌细胞株的凋亡影响 |
| 4.6 JQ1 与索拉非尼联合作用对肝癌细胞的凋亡蛋白Bcl-2、BIM、癌基因c-MYC的表达影响 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 个人简历 |
| 致谢 |
| 综述 靶向 BET 溴结构域在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
（6）MLL基因重排阳性儿童急性淋巴细胞白血病预后相关因素分析与研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 MLL基因重排儿童急性淋巴细胞白血病接受CCLG-ALL2008方案治疗疗效和预后因素分析 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 应用RNA-seq初步研究MLL重排儿童急性淋巴细胞白血病差异表达基因与预后的相关性 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 MLL基因重排儿童急性白血病研究进展 |
| 参考文献 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 攻读博士学位期间科研成果 |
| 致谢 |
（7）BRD4抑制剂抗小细胞肺癌作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略词中英文对照索引 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 国内外研究现状 |
| 1.2 目的 |
| 1.3 实用价值与理论意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 患者临床基本特征 |
| 2.2 患者随访 |
| 2.3 组织学检查 |
| 2.4 实验试剂、仪器 |
| 2.5 细胞的培养及NHWD-870溶液配制 |
| 2.6 裸鼠成瘤 |
| 2.7 移植瘤模型的建立 |
| 2.8 SCLC-PDX模型的建立 |
| 2.9 裸鼠用药及肿瘤测量 |
| 2.10 统计学分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 患者临床病理特征 |
| 3.2 SCLC患者BRD4、c-Myc表达与预后的关系 |
| 3.3 NHWD-870抗SCLC的作用 |
| 3.4 NHWD-870HCL抗SCLC的作用 |
| 3.5 NHWD-870对比EP化疗抗SCLC的作用 |
| 3.6 NHWD-870HCL抗SCLC-PDX的作用 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 BRD4抑制剂抗肿瘤机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者攻读学位期间的科研成果 |
| 致谢 |
（8）NF-κB信号通路在慢性淋巴细胞白血病中的作用和机制探讨（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 经典性和非经典性NF-κB活性在慢性淋巴细胞白血病中的作用 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 实验结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第二部分 非经典途径NF-κB分子活性影响CLL细胞对蛋白酶体抑制剂的敏感性 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 实验结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第三部分 与NF-κB活性相关分子NOTCH1基因突变的HRM检测方法的建立及其意义 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 实验结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第四部分 与NF-κB活性相关的MYD88基因突变的HRM检测方法的建立及其意义 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 实验结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 攻读博士期间发表的文章、获得的基金及奖励 |
| 致谢 |
（9）琼玉膏通过Klotho/FGF-23信号通路延缓斑马鱼衰老的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 衰老机制与抗衰老研究基础 |
| 一、衰老的中医学机制研究 |
| 二、中医抗衰老的基础 |
| 三、衰老与抗衰老现代医学机制研究进展 |
| 第二节 琼玉膏抗衰老相关研究概述 |
| 一、琼玉膏之古文献研究 |
| 二、琼玉膏在抗衰老领域的最新研究 |
| 第三节 斑马鱼实验模型的研究进展 |
| 一、斑马鱼实验模型的起源 |
| 二、斑马鱼实验模型的优势 |
| 三、斑马鱼实验模型在人类疾病与衰老相关领域的应用研究 |
| 第四节 Klotho、FGF-23与衰老 |
| 一、Klotho基因基本生物学特征 |
| 二、Klotho蛋白的生物学功能 |
| 三、Klotho与衰老相关疾病的研究 |
| 四、FGF-23的生物学特征 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 实验准备 |
| 一、实验动物 |
| 二、实验药物与试剂 |
| 三、主要仪器设备 |
| 第二节 实验研究方案 |
| 一、预实验分组 |
| 二、正式实验分组、给药方法及指标检测 |
| 三、统计学方法 |
| 四、技术路线 |
| 五、可行性分析 |
| 第三节 实验方法 |
| 一、不同浓度琼玉膏对斑马鱼存活率影响的预实验 |
| 二、不同浓度过氧化氢对斑马鱼存活率影响的预实验 |
| 三、斑马鱼血清SOD活性检测 |
| 四、斑马鱼肾组织MDA活性检测 |
| 五、斑马鱼Klotho基因表达水平检测 |
| 六、斑马鱼Kloho蛋白表达水平检测 |
| 七、斑马鱼肾脏Klotho启动子甲基化水平检测 |
| 第四节 实验结果 |
| 一、不同浓度琼玉膏对斑马鱼存活率的影响 |
| 二、不同浓度H_2O_2对斑马鱼存活率的影响 |
| 三、斑马鱼血清SOD含量变化 |
| 四、斑马鱼肾组织MDA含量变化 |
| 五、斑马鱼肾组织Klotho基因表达水平变化 |
| 六、斑马鱼肾组织Klotho蛋白表达变化 |
| 七、斑马鱼肾组织Klotho基因甲基化程度变化 |
| 第三章 讨论 |
| 一、不同浓度琼玉膏、H_2O_2对斑马鱼存活率的影响 |
| 二、琼玉膏对提高衰老斑马鱼抗氧化指标的影响 |
| 三、琼玉膏对衰老斑马鱼肾组织Klotho基因及蛋白表达的影响 |
| 四、琼玉膏对斑马鱼肾脏Klotho启动子甲基化影响 |
| 第四章 展望 |
| 一、“全养生”理论中延缓衰老的思想纲领 |
| 二、琼玉膏抗衰老研究在我国养老产业及粤港澳大湾区经济增长发展的重要作用 |
| 结语 |
| 一、结论 |
| 二、创新性 |
| 三、不足之处 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 详细摘要 |
（10）抑制S1PR3促进儿童急性T淋巴细胞白血病细胞凋亡研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 儿童急性T淋巴细胞白血病中GPCRs表达紊乱 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 S1PR3在儿童急性T淋巴细胞白血病中表达增加 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 抑制S1PR3促进儿童急性T淋巴细胞白血病细胞凋亡 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 S1P信号在肿瘤发展及治疗中的作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文及参加的重要学术会议 |
四、端粒酶及其抑制剂在白血病中的研究进展（论文参考文献）
- [1]hnRNP U对慢性髓细胞白血病细胞增殖和凋亡的影响及机制研究[D]. 牟科. 重庆医科大学, 2021(01)
- [2]红细胞分布宽度在初诊骨髓增生异常综合征、再生障碍性贫血、急性白血病、慢性粒细胞白血病中的临床分析[D]. 杨明月. 兰州大学, 2021(12)
- [3]芪附扶正合剂联合低剂量传统化疗方案治疗老年急性髓系白血病（非M3）的疗效分析及机制研究[D]. 王志清. 南京中医药大学, 2020(02)
- [4]PARP1负性调控MT1M在卵巢癌转移中的作用及机制研究[D]. 许霞青. 浙江大学, 2020(02)
- [5]BET蛋白抑制剂JQ1增强索拉非尼对肝癌细胞的增殖抑制作用及机制[D]. 王宇. 安徽医科大学, 2020(02)
- [6]MLL基因重排阳性儿童急性淋巴细胞白血病预后相关因素分析与研究[D]. 孙伊娜. 苏州大学, 2019(06)
- [7]BRD4抑制剂抗小细胞肺癌作用的研究[D]. 吴芳. 南华大学, 2019(01)
- [8]NF-κB信号通路在慢性淋巴细胞白血病中的作用和机制探讨[D]. 蒋敏. 苏州大学, 2019(04)
- [9]琼玉膏通过Klotho/FGF-23信号通路延缓斑马鱼衰老的研究[D]. 黄理杰. 广州中医药大学, 2019
- [10]抑制S1PR3促进儿童急性T淋巴细胞白血病细胞凋亡研究[D]. 吕文琼. 重庆医科大学, 2019(01)
标签：斑马鱼论文; 对照组论文; 急性淋巴细胞性白血病论文; 骨髓细胞论文; 端粒酶论文;