一、异体LAK细胞对白血病患者MDR细胞的体外净化作用（论文文献综述）
刘敏红[1]（2020）在《遗传指导下异基因NK细胞输注治疗老年急性髓系白血病的临床研究》文中认为背景:急性髓系白血病（AML）是老年人中常见的血液系统恶性肿瘤之一。目前老年患者的治疗方式包括化疗、非清髓造血干细胞移植、去甲基化药物、小低剂量阿糖胞苷或支持治疗等。与年轻人相比,由于年龄大、合并症多、器官损害、具有不良预后细胞遗传学以及表达多药耐药基因等,老年AML患者对治疗的反应性及耐受性通常治疗效果差,中位生存期约5-16个月,3年生存率<10%。虽然化疗、造血干细胞移植（HSCT）方案不断优化以及高效低毒的靶向药物治疗的出现,老年患者完全缓解（CR）率可达40%-70%,但许多患者经治疗达到CR后仍残留有微小残留病灶（MRD）。微小残留病灶通常不能被进一步的化学疗法、HSCT所清除,最终导致疾病复发、进展,预后差。因此亟需化疗、HSCT以外的新方法进一步消除残留的白血病细胞以减少疾病复发,从而延长老年AML患者的生存期。鉴于老年患者器官功能差、合并症多等特殊性,选择有效治疗方案的同时最大层度降低治疗的毒副作用成为老年AML患者选择方案的重点。近年来,自然杀伤（NK）细胞过继细胞疗法（ACT）越来越受到的关注。NK细胞是机体天然免疫系统的细胞毒性淋巴细胞,NK细胞识别和杀伤靶细胞无需预先致敏、不依赖抗体、不受MHC限制,而是通过细胞表面固有表达的多种抑制性及激活性受体与靶细胞表面的配体之间相互作用平衡调节。随着NK细胞抗肿瘤作用机制研究的不断深入,NK细胞免疫疗法也逐渐应用于急性髓系白血病的治疗,研究表明异基因NK细胞输注可以发挥移植物抗白血病（GVL）作用,且不会引起移植物抗宿主病（GVHD）,在临床上患者对其耐受性好、不良反应小。为提高老年AML患者的生存,本研究拟用遗传指导下,选择理论上对AML具有杀伤作用的异基因NK细胞在AML缓解后进行输注,以减少AML的复发和延长总生存时间（OS）。目的:评估异基因NK细胞输注治疗老年中、高危急性髓系白血病（AML）的安全性与疗效。方法:回顾性分析2017年10月至2019年3月诊治的经地西他滨联合CAG化疗达完全缓解后接受异基因NK细胞输注治疗的AML老年患者的临床资料以及供受者KIR基因分型结果,评估NK细胞输注治疗的安全性与疗效;探讨供、受者KIR基因型相合/错配、KIR基因型、以及KIR2DS1对急性髓系白血病的无疾病生存时间（DFS）的影响,为临床上选择合适NK细胞供者提供依据。结果:7例中高危老年AML患者经小剂量地西他滨联合CAG化疗后输注经体外扩增的NK细胞,输注的中位CD56+CD3-NK细胞输注数量1.45（1.12-1.76）×108/Kg,中位 NK 细胞存活率 90%（88%～92%）,中位 NK 细胞纯度 87%（85%～89%）,中位NK细胞杀伤活性87%（85%～88%）。异基因NK细胞输注患者耐受性良好,7例患者均未观察到不良反应以及未出现移植物抗宿主病（GVHD）表现。截止末次随访,中位随访时间596（356～901）天。输注NK细胞后7例中有5例（71.4%）无复发生存,1例MRD阳性患者输注NK细胞后MRD转阴,其余4位输注后MRD检测持续阴性。2例（28.5%）输注NK细胞后复发,复发时间分别为输注后319天和341天（1例患者形态学复发,1例患者分子学复发）。进一步分析7例患者中,当供、受者KIR基因不相合、供者为单体型为B/X、供者激活型KIR2DS1阳性时对DFS的影响差异无统计学意义。结论:对于老年AML患者来说化疗后完全缓解状态下输注异基因NK细胞是安全可行的,可能有助于中高危AML患者达到更深次的缓解,减少疾病复发率,延长总生存时间,值得进一步研究。本研究已获得南方医科大学顺德医院伦理委员会审核批准,并在中国临床研究注册中心注册（注册号:ChiCTR1 900022598）
李增政[2]（2020）在《补肾回阳方对肾阳虚小鼠免疫系统的调控及活性单体解析和天然化合物抗白血病模型筛选》文中研究表明背景:免疫力低下在祖国医学看来多属于肾阳虚的范畴,以温阳补肾固卫气的根本出发对治疗临床上免疫力低下的患者有较好的疗效,尤其是对白血病患者,可以减轻白血病患者因药物产生的副作用和免疫抑制。细胞免疫治疗是新兴的肿瘤治疗手段之一,其通过各种生物技术手段在体外对免疫活性细胞进行改造,扩增后再回输到患者体内,进而达到提高患者免疫力,同时抑制或杀死肿瘤细胞的目的。此外在现代医学治疗白血病中小分子抑制剂占了重要一席,尤其是酪氨酸酶抑制剂,自伊马替尼诞生以来大大改变了慢性粒细胞白血病的治疗方式。许多中药或有药用作用的植物药对白血病细胞具有一定的杀伤作用,尽管已经报道了很多有治疗效果的小分子,但诸多药物中存在的小分子对白血病细胞的作用我们仍然不清楚。前期的临床实践证明补阳中药方剂有助于提升肾阳虚患者免疫力和白血病预后的线索,但方剂中的主要活性成分和起重要作用的中药我们对此知之甚少。同时诸多药用植物在民间被用来抗肿瘤,但其中起抗肿瘤作用的活性分子我们也仍然不清楚。因此本课题围绕补肾回阳方对肾阳虚小鼠免疫细胞的调节及活性成分分析和新型小分子抗白血病细胞的筛选来开展。目的:（1）探索中药补肾回阳方对肾阳虚型小鼠免疫系统的调节作用为临床用药提供基础研究数据。（2）通过对补肾回阳方中的主要活性成分单体解析使得对该方剂的认识更加深入。（3）筛选出药用植物中具有抗白血病细胞的新型天然小分子为后续工作打下基础。方法:（1）补肾回阳方对肾阳虚型小鼠免疫细胞的调节作用:通过腹腔注射25mg/kg氢化可的松,建立肾阳虚小鼠模型,对照组每日腹腔注射等量生理盐水,各组连续给药10天后,检测肾阳虚模型组和对照组小鼠的一般体征、外周血象、以及T淋巴细胞亚群等指标。随后给予肾阳虚模型小鼠补肾回阳方0.25ml/天灌胃治疗,模型对照组和空白对照组用生理盐水灌胃,一天一次,连续给药15天。治疗结束后检测小鼠的一般体征、外周血的相关免疫细胞,和通过流式细胞术测定各组小鼠的外周血、骨髓和脾脏的CD3+、CD3-NK1.1+、CD3+NK1.1+的占比水平;以及分离小鼠外周血单核细胞进行后期细胞因子诱导培养DC细胞,检测其体外扩增情况,最后进行数据统计分析。（2）补肾回阳方的活性成分法分析:将补肾回阳方的浓缩液和标准品进行高效液相色谱分析和液质色谱串联分析,通过对比标准品和数据库来探索补肾回阳方中的活性成分。（3）新型小分子抗白血病细胞作用的:将分离得到的新型小分子化合物进行CCK-8药敏实验,筛选对白血病细胞有抑制作用的小分子。结果:（1）补肾回阳方对肾阳虚型小鼠免疫细胞的调节作用:中药灌胃治疗后,与模型对照组相比补肾回阳组小鼠的体重增长明显;外周血中白细胞和淋巴细胞水平明显上升;外周血、骨髓和脾脏中的CD3+、CD3-NK1.1+、CD3+NK1.1+的占比水平明显提高;经过补肾回阳方灌胃治疗的肾阳虚模型小鼠,由外周血分离单核细胞经体外细胞因子诱导培养的DC细胞,细胞数量也明显高于模型对照组。（2）补肾回阳方的活性成分分析:结合标准品和数据库分析得到补肾回阳方中含有甘草苷、淫羊藿苷、次乌头碱三种物质,此外还得到与淫羊藿成分:异槲皮素、淫羊藿次苷II、淫羊藿苷A、淫羊藿次苷D2;炙甘草成分:甘草素、芹糖甘草苷、甘草黄酮C、甘草次酸;干姜成分:6-姜烯酚、6-姜辣素;肉桂成分:桂皮醛分子式和分子量一致的11种物质。（3）YWF-10、YHL-14、YWF-08、XY-24、XY-1、DS-7、DX-15小分子对THP-1、Jurkat、KG-1三种细胞均有抑制作用,其中YHL-14、YWF-08两种小分子对32D细胞的抑制作用没有统计学差异（P>0.05）,但对KG-1、THP-1的抑制作用有统计学差异（P<0.01）,并且YWF-08对Jurkat细胞也有较强的抑制作用（P<0.001）。YWF-10、YWF-08、XY-24、XY-1、DS-7五种小分子对Jurkat细胞的抑制率远高于对其他细胞的抑制率;相比于对32D细胞的抑制率Jurkat细胞的抑制率也远大于对32D细胞的抑制率。结论:（1）补肾回阳方可以提升肾阳虚小鼠外周血中的白细胞和淋巴细胞数量,可以提高外周血、骨髓和脾脏中的CD3+、CD3-NK1.1+、CD3+NK1.1+的占比水平,以及可以提高DC细胞的体外诱导培养数量,证明补肾回阳方对肾阳虚小鼠具有增强和恢复免疫的功效。（2）补肾回阳方中含有甘草苷、淫羊藿苷、次乌头碱三种物质,此外含有与异槲皮素、淫羊藿次苷II、淫羊藿苷A、淫羊藿次苷D2、甘草素、芹糖甘草苷、甘草黄酮C、甘草次酸、6-姜烯酚、6-姜辣素、桂皮醛分子式和分子量一致的物质11种,其中淫羊藿和炙甘草的活性成分最多,鉴于前人的研究和本研究结果在补肾回阳方对免疫的正向调节作用中淫羊藿和炙甘草发挥了要作用。（3）YWF-08、XY-24、XY-1、DS-7五种小分子对Jurkat细胞的抑制率远高于对其他细胞的抑制率;其中YHL-14、YWF-08两种小分子对32D细胞没有抑制作用,但对KG-1细胞和THP-1细胞有较强的抑制作用。
张振华[3]（2020）在《肺瘤平膏通过AMPK/mTOR信号通路调控自噬影响肺癌顺铂耐药的机制研究》文中指出研究背景肺癌是全球癌症死亡的主要原因,非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）约占肺癌病例的75%-80%,所有分期的5年生存率约为10%-15%。化疗是治疗肿瘤和防止肿瘤术后复发转移不可替代的常用的治疗手段之一,但是在治疗过程中出现肿瘤细胞的耐药常常导致化疗的失败,最终导致患者的死亡。近年来研究发现,自噬可以用来帮助肿瘤细胞逃避放化疗或者其他治疗介导的细胞死亡,最终导致耐药的产生。肿瘤形成后,在营养和能量不足时,肿瘤细胞可以利用自噬清除受损的细胞器和循环利用正常细胞中的降解产物为自己供能,使肿瘤细胞在肿瘤微环境的压力下生存,同时自噬可以作为一种适应性反应使肿瘤细胞耐受放疗化疗等治疗手段产生耐药。肺瘤平膏（FLP）是具有益气养阴、清热解毒、化痰止咳功效的中药复方,前期研究表明肺瘤平膏能够通过调控自噬抑制肺腺癌小鼠的生长和增殖,临床上我们发现肺瘤平膏与化疗药联用能够增加患者对化疗药物的敏感性,但是其作用机制尚无研究。研究目的通过观察FLP对肺癌化疗耐药荷瘤动物模型中肿瘤组织及A549/cis肺腺癌耐药细胞株中耐药蛋白表达的影响,从自噬的角度揭示FLP逆转化疗耐药的分子机制,旨在阐释FLP逆转耐药的科学内涵,同时为进一步应用中医药治疗NSCLC提供科学依据。研究方法（1）采用A549/cis肺腺癌耐药细胞株,接种到BALB/c裸鼠的右侧腋下,建立A549/cis肺癌化疗耐药荷瘤动物模型,用生理盐水、FLP、DDP、FLP联合DDP、自噬抑制剂氯喹（chloroquine,CQ）、DDP联合CQ及FLP联合DDP和CQ干预21天后,取材,测量瘤重,计算抑瘤率。用免疫组织化学法（Immunohistochemistry,IHC）检测肿瘤组织中Ki-67的表达水平;（2）建立A549/cis肺癌化疗耐药荷瘤动物模型,用生理盐水、FLP、DDP、FLP联合DDP、CQ、DDP联合CQ及FLP联合DDP和CQ干预21天后,用Western Blotting（WB）和IHC检测肿瘤组织中耐药相关蛋白MDR1和MRP1的表达水平;（3）建立A549/cis肺癌化疗耐药荷瘤动物模型,用生理盐水、FLP、DDP、FLP联合DDP、CQ、DDP联合CQ及FLP联合DDP和CQ干预21天后,用WB和IHC检测肿瘤组织中自噬相关蛋白LC3、p62、Beclin1、Atg3、Atg5和Atg7的表达水平,用免疫荧光检测LC3的表达水平;（4）建立A549/cis肺癌化疗耐药荷瘤动物模型,用生理盐水、FLP、DDP、FLP联合DDP、CQ、DDP联合CQ及FLP联合DDP和CQ干预21天后,用WB法检测肿瘤组织中信号通路相关蛋白AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR的表达水平;（5）体外采用A549/cis肺腺癌耐药细胞株,CCK-8法检测肺瘤平膏对A549/cis肺腺癌耐药细胞株增殖的影响,Annexin V/PI法检测肺瘤平膏对A549/cis肺腺癌耐药细胞株凋亡的影响:（6）体外采用A549/cis肺腺癌耐药细胞株,用生理盐水、FLP、DDP、FLP联合DDP、CQ、DDP联合CQ及FLP联合DDP和CQ干预48h后,WB法检测肺瘤平膏对A549/cis肺腺癌耐药细胞株耐药蛋白MDR1和MRP1表达的影响;（7）构建双荧光mRFP-GFP-LC3体系A549/cis肺腺癌耐药细胞株,用生理盐水、FLP、DDP、FLP 联合 DDP、CQ、DDP 联合 CQ 及 FLP 联合 DDP 和 CQ 干预 48h 后,高内涵检测A549/cis细胞株自噬蛋白LC3的表达,WB法检测肺瘤平膏对A549/cis肺腺癌耐药细胞株自噬蛋白LC3、p62、Beclin1、Atg3和Atg7的表达水平;（8）体外采用A549/cis肺腺癌耐药细胞株,用生理盐水、FLP、DDP、FLP联合DDP、CQ、DDP联合CQ及FLP联合DDP和CQ干预48h后,WB法检测肺瘤平膏对A549/cis肺腺癌耐药细胞株信号通路相关蛋白AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR的表达水平。研究结果（1）F+D组、D+C组和F+D+C组均能有效地抑制肿瘤,其抑瘤率分别为49.33%、47.43%和53.78%,其中F+D+C组的抑瘤效果最好。IHC检测不同药物干预21天后肿瘤组织中Ki-67的表达发现:FLP组、F+D组、D+C组和F+D+C组均能有效抑制Ki-67的表达,其中D+C组与F+D+C组抑制Ki-67的表达最明显。（2）DDP可以一定程度增加耐药相关蛋白MDR1和MRP1的表达;而FLP与DDP联用、DDP与CQ联用及FLP与DDP与CQ联用均能明显降低MDR1的表达,差异具有统计学意义,IHC也表明这3组能明显降低MRP1的表达,差异具有统计学意义,综上所述,FLP与DDP联用能增加DDP的敏感性,其作用与DDP联合CQ相当。（3）间接免疫荧光法检测LC3的表达发现:经DDP干预后特异性点状分布增加,且结合WB和IHC的结果DDP能一定程度增加Atg3、Atg5和Atg7的表达,同时能降低p62的表达,表明DDP能一定程度诱导自噬。结合WB、IHC和免疫荧光检测自噬相关蛋白的表达发现:FLP联合DDP能够抑制自噬的标志物LC3的表达,增强P62的表达,同时不同程度地抑制自噬相关蛋白Atg3、Atg7及Beclin1的表达,DDP联合CQ组亦能够有效抑制自噬的标志物LC3的表达,增强P62的表达,同时不同程度地抑制自噬相关蛋白Atg3、Atg5、Atg7及Beclin1的表达,可见DDP能一定程度诱导自噬相关蛋白的表达;FLP与DDP联用能够抑制自噬相关蛋白的表达,其效果接近于DDP联用自噬抑制剂。（4）用WB检测AMPK及mTOR相关蛋白的表达发现:AMPK及mTOR总蛋白表达量未见明显异常,FLP联合DDP可以降低p-AMPK的表达,增加p-mTOR的表达。（5）FLP联合化疗药DDP在体外能够有效地抑制A549/cis耐药株地增长,作用效果呈现时间依赖性,且与化疗药DDP联合自噬抑制剂CQ作用相当,其中就某一时间点而言,FLP联合化疗药联合CQ对细胞株地抑制效果最佳;用流式细胞术检测细胞凋亡实验发现:FLP联合化疗药DDP在体外能够有效地促进A549/cis耐药株的凋亡。（6）FLP联合化疗药DDP、DDP联合CQ及三药联合在体外均能够有效抑制MDR1的表达,但对MRP1表达的影响不明显。（7）双荧光mRFP-GFP-LC3体系检测FLP、DDP及CQ单独或者联合应用干预A549/cis人肺腺癌耐药细胞株48h后发现:FLP与DDP联用及与CQ三药联用能够明显地阻断自噬流,抑制自噬,同时WB显示:FLP联合DDP和DDP联合CQ均能够抑制自噬的标志物LC3 Ⅱ/LC3Ⅰ的表达,增强P62的表达,同时不同程度地抑制自噬相关蛋白Atg3和Atg7的表达,三药联合除了能降低LC3、Atg3和Atg7的表达,增强P62的表达,还能降低Beclin1的表达。（8）FLP含药血清与DDP联用、DDP与自噬抑制剂CQ及三药联用能够明显抑制信号通路相关蛋白p-AMPK/AMPK的相对光密度值,同时提高p-mTOR/mTOR的相对光密度值。研究结论1、FLP与DDP联用能够有效地抑制A549/cis耐药荷瘤小鼠肿瘤的生长和增殖,能有效地抑制A549/cis耐药细胞株的增长,并促进其凋亡。2、FLP与DDP联用可以通过抑制自噬降低耐药相关蛋白的表达,增加DDP的敏感性,逆转耐药。3、FLP与DDP联用抑制自噬逆转耐药可能跟AMPK/mTOR信号通路有关。
孙静[4]（2018）在《间充质干细胞逆转白血病K562细胞伊马替尼耐药性的研究》文中提出研究背景和意义慢性粒细胞性白血病（chronic myeloid leukemia,CML）是以多能造血干细胞不受控制的增殖为特点的严重的血液系统恶性肿瘤。约有95%的CML患者表达具有酪氨酸激酶活性的BCR-ABL融合蛋白,异常的BCR-ABL酪氨酸激酶信号激活下游靶点,对细胞进行重新编程,使其异常增殖,导致髓样增生。因此,酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors,TKIs）成为慢性粒细胞性白血病分子靶向治疗的最有效药物。但是,随着TKIs药物的临床广泛使用,患者对TKIs出现耐受现象。叉头框蛋白O（forkhead box class O,FOXO）转录因子亚家族（FOXO1,FOXO3,FOXO4,FOXO6）作为PI3K-AKT信号级联通路的下游靶点。有研究结果显示FOXO3a可通过PI3K/AKT、ERK、JNK和P38信号通路介导抗肿瘤化学药物的作用效应,并能调控增强耐药基因mdr-1/P-gp的表达,在抗肿瘤药物的敏感性及耐受性中发挥着重要调控作用。脐带间充质干细胞（Human umbilical cord devrived mesenchymal stem cells,UC-MSCs）来源于曾被作为医疗废弃物处理的脐带,无需侵入性手术获得,不存在伦理学问题,具有低免疫原性和良好的扩增能力,近几年来被广泛研究和使用。虽然UC-MSCs在肿瘤及其它疾病治疗领域的应用得到广泛研究,但有关UC-MSCs影响肿瘤细胞对化疗药物及分子靶向药物耐受的研究少见。综上所述,本课题拟建立人白血病K562伊马替尼耐药细胞株,研究其耐药性及可能的分子机制。从新鲜脐带组织分离、制备MSCs,通过表面分子标记和多向分化能力进行鉴定。通过UC-MSCs与伊马替尼耐药的K562细胞及亲本K562细胞共培养,研究UC-MSCs与白血病细胞的相互作用和对其药物敏感性的影响,探讨应用UC-MSCs逆转白血病耐药性的可能性及机制,为临床干预白血病靶向药物耐受性提供新的思路。研究内容及方法1.人白血病K562伊马替尼耐药细胞株的建立采用低浓度起始,长时间阶段性提高伊马替尼诱导浓度的方法诱导人白血病K562细胞获得耐药性（命名为K562/R细胞）,MTS法检测K562亲本细胞及K562/R细胞对伊马替尼的敏感性及细胞形态学的变化,以及对其他抗肿瘤药物的交叉耐药性。Western-blot法检测P-gp和BCR-ABL等的表达。流式细胞术检测伊马替尼作用下K562细胞和K562/R细胞的凋亡水平。2.UC-MSCs的原代分离、培养和鉴定取无菌新鲜人脐带组织,通过组织块贴壁法分离UC-MSCs。倒置显微镜下观察分离所获得细胞的形态是否符合MSCs的细胞形态,流式细胞术检测分离所获得细胞的表面分子标志。通过成脂、成骨和成神经元样细胞定向分化评价所制备的MSCs。3.UC-MSCs与白血病细胞共培养后耐药性改变及凋亡、耐药相关基因和蛋白变化将分离并鉴定的UC-MSCs与建立的K562/R细胞和K562亲本细胞分别共培养,以单独培养的K562/R细胞和K562细胞作为各自对照组细胞。MTS法检测与UC-MSCs共培养48 h、72 h、96 h后,K562/R细胞和K562细胞对伊马替尼的敏感性变化。RT-PCR法检测共培养前后K562/R细胞和K562细胞耐药及凋亡相关基因mdr-1、CD44、FOXO3a、Bax、Caspase-3表达。Western-blot法检测共培养前后P-gp、CD44、FOXO3a、Bax、Caspase-3等蛋白表达。流式细胞术检测共培养细胞的凋亡率。4.UC-MSCs与白血病细胞共培养后细胞群中肿瘤干细胞含量变化将UC-MSCs与K562/R细胞和K562亲本细胞分别共培养,以单独培养的K562/R.细胞和K562细胞作为各自对照组细胞。流式细胞术检测共培养前后K562/R细胞和K562细胞群体中肿瘤干细胞含量变化。5.短发夹RNA干扰沉默K562/R细胞FOXO3a基因表达构建针对FOXO3基因的短发夹RNA干扰质粒,HEK293T细胞中进行慢病毒包装,FOXO3慢病毒（sh-FOXO3）细胞感染K562/R细胞,筛选培养获得稳定沉默细胞（K562/R-shFOXO3）。MTS法检测细胞增殖活性及药物敏感性,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western-blot技术检测FOXO3a、P-gp和CD44的表达。6.与UC-MSCs共培养前后K562/R细胞内PI3K/AKT和MAPKs通路的变化将UC-MSCs与K562/R细胞和K562亲本细胞分别共培养后,以单独培养的K562/R细胞和K562细胞作为各自对照组细胞。Western-blot法检测共培养前后细胞内AKT、PI3K、p38、磷酸化p38、磷酸化ERK、磷酸化c-Jun、c-Abl和磷酸化c-Abl的蛋白表达变化。结果1.伊马替尼耐药性K562细胞株的建立及特性采用低浓度起始,长时间阶段性提高伊马替尼诱导浓度的方法诱导人白血病K562/R细胞,通过MTS法检测对伊马替尼的半数抑制浓度（IC50）,结果显示:伊马替尼作用24 h、48 h、72 h后,K562/R细胞的耐药倍数是K562细胞的64.22、40.52、31.58倍,且与ADM、PXL、MMC、THP、CHOEP、HHT、AMN107化疗药物均产生交叉耐受。伊马替尼作用K562和K562/R细胞24 h后,AnnexinⅤ-FITC和PI双染法示K562/R的凋亡率低于K562细胞,表明K562/R细胞对伊马替尼具有较强的抗凋亡能力。显微镜下观察细胞形态,伊马替尼作用48 h,K562细胞出现细胞皱缩、染色质边集现象,而相同浓度下K562/R细胞未发生明显的形态学变化。Western-blot结果显示,随着伊马替尼诱导浓度与时间增加,BCR-ABL及P-gp蛋白表达水平也随之增加,上述研究结果证实,通过伊马替尼长时间间歇性诱导,成功建立了稳定的具有伊马替尼耐药性且具备多药耐药特点的K562/R耐药细胞株。2.UC-MSCs的分离、培养及鉴定从志愿者足月剖腹产后获取的无菌脐带中制备UC-MSCs。采用组织块法贴壁2-3周,成功分离并获得UC-MSCs,分离的UC-MSCs增殖稳定,外形符合UC-MSCs的形态特征。流式细胞术检测细胞表面表达CD44和CD90,不表达造血干细胞标记CD34和人类共同白细胞抗原CD45,符合UC-MSCs表面免疫分子表型标准。具有成脂、成骨和成神经元样细胞定向分化能力。通过形态学、细胞表面免疫分子表型及体外定向诱导多向分化能力的鉴定,证实本课题从脐带组织中成功分离制备出了UC-MSCs细胞。3.UC-MSCs逆转K562/R白血病细胞对伊马替尼和阿霉素的耐受性UC-MSCs与K562/R及K562亲本株分别进行直接共培养,并以单独培养的K562/R细胞和K562细胞作为对照组细胞。倒置显微镜下观察,无论是K562细胞还是K562/R细胞,共培养48 h后,细胞都出现向UC-MSCs黏附、梭状变形、融合入UC-MSCs现象。MTS法检测K562/R共培养后对伊马替尼及阿霉素的敏感性增加。共培养48 h、72 h、96 h后凋亡相关基因Bax和Caspase-3表达增加;耐药相关基因mdr-1、CD44、FOXO3a表达水平较共培养前下降。流式细胞仪检测共培养的K562/R细胞经伊马替尼诱导的凋亡率水平较单独培养的K562/R细胞为高。Western-blot结果显示K562/R细胞与UC-MSCs共培养后Caspase-3及Bax凋亡相关蛋白表达增高,耐药相关蛋白P-gp、CD44、FOXO3a水平降低。上述研究结果充分证实UC-MSCs可逆转K562/R细胞对伊马替尼和阿霉素的耐药性。4.UC-MSCs与白血病细胞共培养后减少K562/R及K562细胞群中肿瘤干细胞含量K562与K562/R细胞与UC-MSCs共培养48 h、72 h、96 h后,以K562细胞和K562/R细胞作为各自的阴性对照,流式细胞仪检测以CD34+CD38-为特异性标志的肿瘤干细胞在共培养之后在K562及K562/R群体中的含量变化,结果显示:与对照组相比,共培养之后K562/R细胞群体中肿瘤干细胞的含量减少,同样的趋势也见于共培养前后的K562细胞中。5.UC-MSCs通过调控PI3K/AKT和MAPK/JNK信号通路下调FOXO3a/P-gp逆转K562/R细胞耐药性采用shRNA干扰技术沉默K562/R细胞的FOXO3基因建立的sh-FOXO3沉默细胞株,伊马替尼作用48 h的IC50水平较K562/R细胞降低,细胞凋亡率增高。Western-blot检测显示FOXO3被有效沉默后,K562/R细胞的耐药相关蛋白P-gp和CD44的表达水平也显着降低。上述结果提示UC-MSCs通过降低K562/R细胞FOXO3a表达,进而抑制P-gp和CD44的表达而逆转K562/R细胞对伊马替尼及阿霉素的耐药性。将K562细胞和K562/R细胞分别和UC-MSCs共培养48 h、72 h及96 h后,采用Western-blot技术检测AKT、PI3K及MAPKs三条并行通路p38和磷酸化p38、磷酸化c-Jun、磷酸化ERK蛋白变化。结果显示K562/R伊马替尼耐药株和UC-MSCs共培养后,AKT及PI3K相对表达量均降低,相同的趋势也见于与UC-MSCs共培养后的K562细胞。K562/R细胞及K562的p38水平在共培养前后没有明显改变,但磷酸化p38水平在共培养的K562细胞中是增加的。磷酸化c-Jun蛋白表达量在共培养后的K562/R细胞中下降,而western-blot技术检测共培养前后K562/R和K562细胞中c-Abl及磷酸化c-Abl蛋白表达水平的变化量没有明显改变。结论1.通过低浓度起始、渐进提高浓度和长时间诱导的方法成功建立了具有伊马替尼稳定耐药性且具备多药耐药特点的K562/R耐药细胞株。2.采用脐带组织块贴壁法从新鲜人脐带组织中成功分离制备出了具有MSC形态特点和表面标志以及定向多向分化能力、且能体外稳定扩增培养的UC-MSCs细胞。3.UC-MSCs通过与K562/R细胞的直接接触作用,有效增强K562/R细胞对伊马替尼和阿霉素的敏感性、逆转其耐药性,减少白血病细胞群体中肿瘤干细胞含量。机制可能与UC-MSCs调控PI3K/AKT和MAPK/JNK通路从而降低K562/R细胞FOXO3a表达,进而抑制耐药相关蛋白P-gp及CD44的表达有关。
徐梅[5]（2014）在《化疗联合CIK细胞治疗恶性肿瘤的相关研究及在卵巢癌临床治疗中的观察》文中研究表明卵巢癌发病隐匿，大部分患者就诊时已经是晚期，位居妇科肿瘤患者致死首位。结肠癌的发病率和死亡率也位居消化系统肿瘤首位。因此，它们都迫切需要寻找更有效的治疗手段。随着肿瘤免疫学和分子生物学的不断发展，肿瘤免疫治疗已成为肿瘤的第四大治疗模式。细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer cells，CIK）兼具有强大的抗瘤活性和增殖活性，又具有非MHC限制性杀瘤的优点，近些年已经得到广泛关注并应用于多种实体瘤的临床治疗，但对卵巢癌治疗报道少见。本文首先通过体外实验研究顺铂（cis-Dichloro diamine in platinum，CDDP或DDP）、CIK细胞及其联合对卵巢癌细胞株SKOV-3的杀伤效应，接着通过体内实验研究氟尿嘧啶（5-FU）、CIK细胞及其联合对小鼠结肠癌移植瘤生长的作用，初步探讨其作用机制。最后，回顾分析本中心6例CIK细胞治疗的卵巢癌患者临床资料，初步探讨CIK细胞治疗卵巢癌的安全性及有效性，为卵巢癌探寻生物治疗策略。第一部分DDP联合CIK细胞对卵巢癌细胞株SKOV-3的杀伤效应目的：探讨DDP、CIK细胞及其联合对卵巢癌细胞株SKOV-3的杀伤效应并初步探讨其机制。方法：利用人外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC）在体外用多种细胞因子诱导生成CIK细胞，于培养第0、7、14、21、28及35天进行细胞计数及流式细胞术分析CD3+CD56+双阳性细胞百分比；于培养14天收获CIK细胞作为效应细胞，用含有CIK细胞培养液上清的培养液培养对数生长期的SKOV-3细胞，于培养24及48小时用流式细胞仪检测SKOV-3细胞的凋亡情况，同时设正常培养的SKOV-3细胞作对照组；杀伤实验分为Ａ14CIK细胞作用组（效靶比分别为5:1、10:1、20:1、40:1）、B17DDP作用组（DDP浓度分别为0.625、1.25、2.5、5、10、20、40μg/ml）及C12CIK联合DDP作用组（DDP浓度均为2.5μg/ml，效靶比分别为5:1和10:1）。同时设效应细胞和靶细胞作对照孔。于24h和48h采用MTT法检测各组对SKOV-3的生长抑制效应。结果：CIK细胞体外培养第0、7、14、21、28及35天细胞计数依次为（1.8±0.2）×107、（14.67±1.53）×107、（230.0±20.0）×107、（225.0±22.91）×107及（220.0±17.32）×107，细胞数于培养第2l天时约增加127.78倍，达到增殖高峰；CD3+CD56+双阳性细胞的百分含量依次为（0.47±0.17）%、（11.30±1.96）%、（35.50±2.30）%、（38.23±1.92）%、（31.40±3.91）%和（28.61±3.45）%，到21天也达到增殖高峰；SKOV-3与CIK细胞培养液上清共培养24h及48h后凋亡率分别为（12.30±1.47）%和（27.13±2.03）%，差异有统计学意义（P <0.05）。对照组24h及48h凋亡率分别为（0.62±0.35）%和（0.65±0.38）%，差异无统计学意义（P>0.05）；Ａ14CIK作用组24h抑制率分别为（16.52±2.52）%、（24.18±4.05）%、（35.98±5.19）%及（53.98±5.02）%，48h抑制率分别为（24.20±5.59）%、（41.23±3.64）%、（57.27±6.68）%及（74.74±6.87）%。在相同时间各组间细胞抑制率差异有统计学意义（P <0.05），相同效靶比24h和48h抑制率差异有统计学意义（P <0.05）；CIK细胞对SKOV-3细胞的抑制率随着效靶比的提高及作用时间的延长而提高；B17DDP作用组24h抑制率分别为（15.09±4.03）%、（25.95±3.36）%、（37.11±3.05）%、（50.07±5.21）%、（62.93±5.85）%、（77.93±3.28）%及（92.55±1.39）%，48h抑制率分别增为（23.42±5.63）%、（32.39±1.47）%、（46.04±2.76）%、（60.46±3.26）%、（72.77±2.38）%、（86.42±1.46）%及（96.24±0.59）%。除外DDP0.625μg/ml组24h和48h抑制率差异无统计学意义（P=0.102），其余各组差异均有统计学意义。DDP对SKOV-3细胞的抑制率也随着药物浓度的提高及作用时间的延长而提高；C12CIK联合DDP作用组24h抑制率分别为（50.50±3.69）%和（68.19±2.07）%，48h抑制率分别为（69.87±2.67）%和（80.11±6.87）%。CIK细胞联合DDP与单一处理因素相比，对SKOV-3的生长抑制率差异有统计学意义。但析因分析结果显示，低剂量组（效靶比为5:1）24h和48h抑制率未见到协同效应（P值分别为0.171和0.895），而高剂量组（效靶比为10:1）24h和48h抑制率见到协同效应（P <0.05）。结论：PBMC在体外经多种细胞因子刺激诱导下可大量扩增获得CIK细胞，其主要效应细胞（CD3+CD56+CIK）在第1421天为高表达平台期，在此期间可获得较为理想的效应细胞；CIK细胞可通过分泌细胞因子并诱导卵巢癌SKOV-3细胞凋亡发挥较强的杀伤作用；联合CIK细胞治疗可明显增强DDP对卵巢癌SKOV-3细胞的杀伤作用。第二部分氟尿嘧啶联合CIK细胞在小鼠结肠癌模型体内抗肿瘤效应的实验研究目的：探讨氟尿嘧啶（fluorouracil，5-FU）、CIK细胞以及5-FU联合CIK细胞对小鼠结肠癌移植瘤生长的作用。方法：建立BALB/C小鼠结肠癌模型，在体外诱导培养小鼠CIK细胞，于第0和7天进行流式细胞术CIK主要效应细胞表型分析。10只荷瘤鼠随机分两组，一组给5-FU（12.5mg/kg）当天腹腔注射，另一组给予NS（0.2ml/只）腹腔注射作对照，第十天采用流式细胞仪分析荷瘤鼠肿瘤组织中淋巴细胞细胞毒性T细胞活化抗原-4（cytotoxic T lymphocyte-activation antigen4，CTLA-4）和非淋巴细胞CD80、CD86表达。另取40只荷瘤鼠随机分成四组，A组（正常对照组）：NS（0.2ml腹腔灌注，d0）+NS（0.2ml尾静脉注射，d3）；B组（5-FU组）：5-FU（12.5mg/kg腹腔灌注，d0）+NS（0.2ml尾静脉注射，d3）；C组（CIK组）：NS（0.2ml腹腔灌注，d0）+CIK（1×107尾静脉注射，d3）；D组（5-FU+CIK组）：5-FU（12.5mg/kg腹腔灌注，d0）+CIK（1×107尾静脉注射，d3）。观察肿瘤生长并绘制肿瘤生长曲线，生存分析采用Kaplan-Meier法及log-rank检验。用药第10天各组处死5只小鼠，采用RT-PCR法检测四组肿瘤组织中IFN-γ和TNF-表达量。结果：小鼠CIK主要效应细胞在体外扩增第7天达到（18.4±6.8）%。与对照组相比，5-FU处理后小鼠移植瘤组织中CD45+细胞表面CTLA-4表达量提高，且CD45-细胞CD80和CD86表达量增加；5-FU联合CIK细胞治疗组小鼠肿瘤生长速度明显慢于单因素治疗组，差异有统计学意义（P <0.05）；5-FU联合CIK细胞治疗可提高肿瘤组织IFN-γ与TNF-表达量，且联合治疗组与单治疗组中IFN-γ的表达量之间的差异有统计学意义（P <0.05）。结论：5-FU联合CIK细胞治疗对结肠癌移植瘤生长的抑制作用大于单独应用，且可提高BALB/C小鼠结肠癌模型的免疫功能。第三部分化疗联合CIK细胞治疗卵巢癌的临床观察目的：初步探讨CIK细胞治疗卵巢癌的安全性和有效性，为卵巢癌探寻生物治疗策略。方法：利用接受常规手术和化疗结束后卵巢癌患者外周血分离出单个核细胞，在体外经多种细胞因子诱导培养出CIK细胞，流式细胞术分析其表型特征。将体外培养第1421天的CIK细胞通过静脉回输给患者，流式细胞仪检测患者外周血淋巴细胞表型变化，回顾性观察6例接受CIK细胞治疗的卵巢癌患者资料，观察患者治疗前后卡式评分（Karnofsky performance score，KPS）差异、肿瘤指标差异、外周血T细胞亚群分布及治疗后相关毒副反应。结果：有5例治疗后KPS较治疗前明显提升，另外1例治疗后KPS保持不变。所有接受CIK细胞治疗的患者均未出现明显毒副作用。1例III期EOC患者手术联合化疗治疗后CA199升高，在接受CIK细胞治疗3个疗程后，CA199逐渐下降至正常。目前状况良好，肿瘤标记物和影像学随访没有肿瘤复发迹象，无瘤生存期（progression free survival，PFS）已达到3年。1例II期透明细胞癌合并浆液性癌患者，接受CIK细胞治疗2个疗程，PFS已接近4年，随访瘤标和影像学检查无肿瘤复发迹象。另外1例II期EOC患者接受8个疗程CIK细胞治疗后，PFS已达5年，目前状况良好，也没有肿瘤复发迹象。结论：CIK细胞治疗卵巢癌可改善患者的生存质量，是一种有希望的治疗方法。综上所述，本文通过对化疗联合CIK细胞治疗肿瘤的基础研究和治疗卵巢癌病例的回顾分析，我们认为，CIK细胞可在体外经多种细胞因子刺激下诱导扩增，第1421天可获得较为理想的效应细胞；CIK细胞可通过分泌细胞因子并诱导卵巢癌SKOV-3细胞凋亡发挥较强的杀伤作用；联合CIK细胞治疗可增强DDP对卵巢癌SKOV-3细胞的杀伤作用；5-FU联合CIK细胞治疗对BALB/C小鼠结肠癌移植瘤生长的抑制作用大于单独应用5-FU或CIK细胞，且可提高小鼠结肠癌模型的细胞免疫功能。CIK细胞治疗卵巢癌可改善患者的生活质量，是一种有希望的治疗方法。
张香梅,张文清,高春晖,刘杰,贾岩峰,于洋,谷晓伟[6]（2008）在《CIK细胞与乳腺癌的免疫治疗》文中提出乳腺癌是女性常见恶性肿瘤.在我国其发病率逐年升高。寻找有效的治疗方法,意义重大。对于肿瘤的治疗,传统方法中,放、化疗除杀灭肿瘤细胞外,对正常细胞也有损伤。免疫治疗能够靶向肿瘤细胞而不伤及正常组织。并可
刘岩青[7]（2008）在《源于健康人与肝癌患者CIK细胞的生物学特性及抗癌活性的对比研究》文中指出免疫细胞生物学和免疫分子生物学的进展,推进了免疫学在肿瘤治疗中的应用。现今,肿瘤免疫治疗已成为肿瘤治疗的基本手段之一。其中细胞介导的过继免疫治疗（Adoptive cellular immunotherapy,ACI）为当前研究的热点之一。过继性细胞免疫治疗是指通过给肿瘤患者输入特异性的或非特异性的具有抑制肿瘤细胞生长的免疫效应细胞,直接杀伤肿瘤细胞或在患者体内诱发机体免疫反应达到抑制和治疗肿瘤的目的。细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine-induced killer,CIK）是一种新型的免疫杀伤细胞,是ACI研究的热点之一。目前有关肿瘤免疫效应细胞的研究和临床的初步资料提示细胞因子诱导的杀伤细胞是一种新型高效的具有广谱杀瘤活力的MHC非限制性的免疫效应细胞,具有增殖速度快、杀伤活性高、临床应用副作用小等优点,是目前发现的杀瘤活性最强的免疫效应细胞之一,成为肿瘤免疫治疗的热点。本实验收集6名健康献血者和6名肝癌患者鲜血者的新鲜外周血,分别通过常规分离外周血单个核细胞,应用相应细胞因子体外诱导分化出CIK细胞,并动态观察CIK细胞的生物学特性、体外增殖活性、细胞表型和细胞毒活性变化。然后将两种来源的CIK细胞的生物学特性及体内外杀瘤活性进行对比研究。对CIK细胞抗瘤机制做进一步研究,对过继免疫疗法治疗肝癌进行新的探索,为CIK细胞进一步应用于临床提供理论依据。第一部分CIK细胞体外增殖和杀瘤活性研究目的观察源于健康人与肝癌患者CIK细胞细胞形态学、细胞表型、增殖活性及细胞毒活性的变化及对比研究。方法提取6健康供血者和6名肝癌患者的PBMC,通过序列添加IFN-γ、CD3McAb、IL-2、IL-1,进行CIK培养,动态观察两种来源CIK细胞的增殖活性;在流式细胞仪上做动态培养物的表型分析;并用MTT法检测两种来源CIK细胞杀伤SMMC-7721肝癌细胞的活性。结果1.两种来源CIK细胞的增殖性能无明显区别,p＜0.05。CIK细胞具有培养方法简易、扩增迅速,两种来源CIK细胞前后扩增分别达到152.667×107、143.500×107。2.以SMMC-7721肝癌为靶细胞,在1.25:1-10:1的效靶比范围内,两种来源的CIK细胞的杀伤活性均无明显差异。但对SMMC-7721肝癌细胞杀伤明显。两种来源CIK细胞在效靶比为10:1时对肝癌细胞的杀伤率最高,分别为0.262、0.260。3.两种来源CIK细胞表面分子CD3+CD56+、CD45RA+的变化无明显差异,源于肝癌患者CIK细胞的CD8+的阳性率与源于健康人CIK细胞的CD8+的阳性率有明显差异,前者高于后者;但随着培养时间的延长,两种来源CIK细胞中CD3+CD56+双阳性细胞和CD8+细胞的百分含量逐渐升高,而CD45RA+细胞的百分含量逐渐减少。结论源于健康人CIK细胞与源于肝癌患者CIK细胞的生物学特性、增值活性及细胞毒活性均无明显差异;源于肝癌患者CIK细胞的CD8+阳性率高于健康人来源的CIK细胞CD8+阳性率,CD3+CD56+、CD45RA+的阳性率无明显差异。CIK细胞培养简易、扩增迅速。对肝癌细胞SMMC-7721杀伤率高。具有良好的临床应用前景。第二部分CIK细胞联合化疗的抗肿瘤研究目的观察CIK细胞表型、体外增殖活性和细胞毒活性变化,并探讨CIK细胞对化疗的辅助治疗作用。方法提取健康供血者的PBMC,常规诱导出CIK细胞,动态观察培养物增殖活性和表型变化;并用MTT法测定其体外细胞毒活性;在Balb/c裸鼠皮下接SMMC-7721肝癌细胞,化疗后应CIK细胞进行免疫治疗,分成对照组、单独化疗组和CIK+化疗治疗组,观察CIK细胞对荷瘤鼠的抑瘤作用结果CIK细胞对化疗具有辅助治疗作用,治疗25天后CIK细胞+化疗对肿瘤的抑制作用明显强于单独化疗组。结论CIK细胞是一种强大的免疫活性细胞,对化疗具有辅助治疗作用,具有广阔的应用前景。
郑海平[8]（2006）在《不同激活方式对CIK细胞增殖及细胞毒作用的影响》文中认为目的:研究不同激活方式对CIK细胞增殖及细胞毒活性的影响,为CIK细胞在白血病的过继免疫治疗提供进一步的实验依据。材料与方法:从15例ALL患者、8例AML患者及8例CML患者经化疗达CR后的骨髓或外周血中分离MNC,分三组（以传统培养方式组、PHA培养组及PHA联合Ag培养组）分别以不同方式培养。每3天补充新的细胞因子,第14天收获细胞。培养前后分别用光镜、倒置显微镜观察细胞形态,流式细胞仪测定CIK细胞的主要效应细胞CD3+CD56+双阳性细胞培养前后的含量变化,亦作为CIK细胞诱导培养成功的标志。MTT法检测收获细胞对相应白血病细胞的细胞毒作用,ELISA试剂盒检测各收获细胞培养上清液中IL-2、IFN-γ的分泌水平。结果:三组均能成功诱导出CIK细胞,其中PHA培养组及PHA联合Ag培养组体外增殖能力、细胞毒作用均优于传统培养方式组。结论:PHA可增加CIK细胞的增殖能力及抗白血病细胞毒作用,PHA-CIK细胞可作为过继免疫治疗应用于临床。
黄晖蓉[9]（2006）在《乳腺癌多药耐药细胞株及敏感株抗原致敏树突状细胞介导的特异性抗肿瘤免疫研究》文中研究指明目的 树突状细胞（Dendritic cell,DC）是目前发现的功能最强的专职性抗原呈递细胞（Antigen-presenting Cells,APC）,是激发特异性免疫应答的中心环节和抗肿瘤免疫的重要载体。以DC为基础的肿瘤疫苗在部分恶性肿瘤的治疗中已显示出良好的效果。肿瘤多药耐药（multidrug resistance,MDR）是临床肿瘤化疗失败的主要原因之一,大量研究证实肿瘤的生物治疗对机体而言更为安全,不像化疗、手术、放射等方法杀伤肿瘤的同时也大量杀伤了正常细胞。因此我们设想是否能将P-gp作为肿瘤免疫治疗的靶点,将其高表达的MDR肿瘤细胞冻融抗原冲击致敏DC,诱导产生P-gp特异性细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocyte,CTL）反应?以及产生的特异性CTL反应与药物敏感肿瘤细胞抗原致敏的DC所诱导的CTL反应有何不同?故此,本实验拟用人乳腺癌P-gp高表达耐药细胞株MCF-7/ADR及其敏感株MCF-7肿瘤冻融抗原冲击致敏DC,探讨其对杀瘤活性的影响。 方法 采集健康供者骨髓血,用淋巴细胞分离液分离单个核细胞,应用重组人粒/单细胞集落刺激因（rhGM-CSF,1000U/ml）、重组人白介素-4（rhIL-4,500U/ml）和重组人肿瘤坏死因子-a（rhTNF-a,100ng/ml）联合培养体系诱导骨髓单个核细胞产生DC,再以人乳腺癌P-gp高表达耐药细胞株MCF-7/ADR及其敏感株MCF-7肿瘤冻融抗原冲击致敏DC,以光学显微镜观察细胞形态,流式细胞仪（FACS）检测细胞免疫表型,MTT法检测DC诱导CTL增殖及体外效应细胞杀伤活性。 结果 骨髓单个核细胞（BMMNC）经体外扩增培养后,具有典型的树突状形态特征,流式细胞仪检测细胞表面CD1a、CD83、CD80、CD86、HLA-DR表达率均较培养前明显增高（P<0.01）,经抗原负载的DC能有效地激发外周血单个核细胞（PBMNC）中CD8+T细胞增殖（P<0.01）。MCF-7/ADR-DC及
李忠明[10]（2005）在《白血病细胞的体外净化原理与方法》文中认为介绍白血病治疗的主要方法和基本原理,并对其进行比较,重点介绍光动力作用体外净化白血病细胞的原理和影响净化效果的基本因素及其研究发展趋势.
二、异体LAK细胞对白血病患者MDR细胞的体外净化作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、异体LAK细胞对白血病患者MDR细胞的体外净化作用（论文提纲范文）
（1）遗传指导下异基因NK细胞输注治疗老年急性髓系白血病的临床研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 资料与方法 |
| 第二部分 结果 |
| 第三部分 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附录1: 综述 |
| 参考文献 |
| 附录2: 中英文缩略词表 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（2）补肾回阳方对肾阳虚小鼠免疫系统的调控及活性单体解析和天然化合物抗白血病模型筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 白血病概述 |
| 1.1.1 急性淋巴细胞白血病 |
| 1.1.2 慢性淋巴细胞白血病 |
| 1.1.3 急性髓细胞性白血病 |
| 1.1.4 慢性粒细胞白血病 |
| 1.1.5 AML和 CML中的白血病干细胞 |
| 1.2 免疫细胞概述 |
| 1.2.1 T淋巴细胞概述 |
| 1.2.2 B淋巴细胞概述 |
| 1.2.3 自然杀伤细胞概述 |
| 1.2.4 NKT细胞概述 |
| 1.2.5 树突状细胞概述 |
| 1.3 中药与免疫概述 |
| 1.4 补肾回阳方的介绍 |
| 1.5 肾虚型小鼠模型概述 |
| 1.6 新型小分子介绍 |
| 1.7 本课题的研究目的和意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验细胞 |
| 2.1.3 试剂和化学药品 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.1.5 相关实验试剂的配制 |
| 2.1.5.1 磷酸盐缓冲液(PBS)的配制 |
| 2.1.5.2 ACK裂红液的配制 |
| 2.1.5.3 补肾回阳方的熬制与药液浓缩 |
| 2.1.5.4 细胞因子的配制与储存 |
| 2.1.5.5 其他化学试剂的配制 |
| 2.1.6 中药标准品配制 |
| 2.1.7 细胞完全培养基的配制 |
| 2.2 实验技术路线 |
| 2.3 动物实验 |
| 2.3.1 小鼠肾阳虚模型的建立 |
| 2.3.2 小鼠体征变化的记录 |
| 2.3.3 小鼠外周血的采集 |
| 2.3.4 小鼠外周血血常规的测定 |
| 2.3.5 外周血T淋巴细胞亚群的流式检测 |
| 2.3.6 补肾回阳方给药 |
| 2.3.7 补肾回阳方治疗后样本的采集与检测 |
| 2.3.7.1 摘眼球采血 |
| 2.3.7.2 血细胞分析 |
| 2.3.7.3 外周血T淋巴细胞亚群的检测 |
| 2.3.7.4 心脏采血 |
| 2.3.7.5 脾细胞和骨髓细胞的制备 |
| 2.3.7.6 脾细胞和骨髓细胞的T淋巴细胞亚群检测 |
| 2.3.8 DC细胞的体外诱导培养 |
| 2.3.8.1 分离外周血单核细胞 |
| 2.3.8.2 体外细胞因子诱导培养DC |
| 2.3.8.3 DC细胞的流式鉴定 |
| 2.4 补肾回阳方物质分析 |
| 2.4.1 高效液相色谱条件 |
| 2.4.2 质谱条件 |
| 2.5 新型小分子抗白细胞细胞的筛选 |
| 2.5.1 白血病细胞细胞系复苏 |
| 2.5.2 小分子的作用浓度 |
| 2.6 数据统计方法 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 肾阳虚模型小鼠的鉴定 |
| 3.1.1 造模后小鼠形态的变化 |
| 3.1.2 外周血血常规的变化 |
| 3.1.3 外周血T淋巴细胞亚群的检测 |
| 3.1.4 结论 |
| 3.2 补肾回阳方对肾阳虚小鼠模型的影响 |
| 3.2.1 补肾回阳方灌胃后小鼠体重的变化 |
| 3.2.2 补肾回阳方对小鼠外周血血象的影响 |
| 3.2.3 补肾回阳方对小鼠CD3~+细胞占比的影响 |
| 3.2.4 补肾回阳方对肾阳虚小鼠CD3-NK1.1~+细胞占比的影响 |
| 3.2.5 补肾回阳方对小鼠CD3+NK1.1+细胞占比的影响 |
| 3.2.6 补肾回阳方治疗后DC细胞的数量变化 |
| 3.2.7 结论 |
| 3.3 补肾回阳方的高效液相色谱实验结果 |
| 3.3.1 补肾回阳方高效液相色谱分析 |
| 3.3.2 补肾回阳方与标准品的高效液相色谱图对比。 |
| 3.4 补肾回阳方液质色谱联用仪分析 |
| 3.4.1 淫羊藿成分分析 |
| 3.4.2 炙甘草成分分析 |
| 3.4.3 干姜成分分析 |
| 3.4.4 肉桂成分分析 |
| 3.4.5 结论 |
| 3.5 抗白血病细胞小分子的筛选 |
| 3.5.1 小分子对32D细胞48小时抑制率检测 |
| 3.5.2 小分子对KG-1细胞48小时抑制率检测 |
| 3.5.3 小分子对THP-1细胞48小时抑制率检测 |
| 3.5.4 小分子对Jurkat细胞48 小时抑制率检测。 |
| 3.5.5 结论 |
| 第四章 讨论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 硕士研究生期间发表的论文 |
（3）肺瘤平膏通过AMPK/mTOR信号通路调控自噬影响肺癌顺铂耐药的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 自噬对肿瘤耐药的调控作用 |
| 1. 自噬 |
| 2. 自噬与肿瘤耐药 |
| 参考文献 |
| 综述二 中医药治疗肿瘤耐药的概述 |
| 1. 耐药的分类 |
| 2. 肿瘤耐药性产生的分子机制 |
| 3. 中药逆转肿瘤耐药的研究 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 实验研究 |
| 第一部分 体内实验 |
| 实验一: 肺瘤平膏对A549/cis肺腺癌耐药荷瘤小鼠肿瘤生长和增殖的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 小结 |
| 5. 讨论 |
| 实验二: 肺瘤平膏对A549/cis肺腺癌耐药荷瘤小鼠耐药蛋白的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 小结 |
| 5. 讨论 |
| 实验三: 肺瘤平膏对A549/cis肺腺癌耐药荷瘤小鼠自噬蛋白的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4 小结 |
| 5. 讨论 |
| 实验四: 肺瘤平膏对A549/cis肺腺癌耐药荷瘤小鼠AMPK信号通路的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 小结 |
| 5. 讨论 |
| 第二部分 体外实验 |
| 实验五: 肺瘤平膏对A549/cis肺腺癌耐药细胞株增殖和凋亡的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 小结 |
| 5. 讨论 |
| 实验六: 肺瘤平膏对A549/cis肺腺癌耐药细胞株耐药蛋白表达的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 小结 |
| 5. 讨论 |
| 实验七: 肺瘤平膏对A549/cis肺腺癌耐药细胞株自噬蛋白表达的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 小结 |
| 5. 讨论 |
| 实验八: 肺瘤平膏对A549/cis肺腺癌耐药细胞株AMPK信号通路的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 小结 |
| 5. 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（4）间充质干细胞逆转白血病K562细胞伊马替尼耐药性的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表（Abbreviations） |
| 第一章 研究背景 |
| 第一节 伊马替尼治疗慢性粒细胞性白血病的治疗现状及耐药机制 |
| 概述 |
| 1.1 慢性粒细胞性白血病的发病机制及治疗现状 |
| 1.2 伊马替尼治疗慢性粒细胞白血病产生耐药的机制及研究进展 |
| 第二节 间充质干细胞应用及与肿瘤相关性概述 |
| 概述 |
| 1.3 间充质干细胞来源及应用 |
| 1.4 间充质干细胞对肿瘤细胞的双重作用 |
| 1.5 脐带间充质干细胞的生物学特征及应用研究 |
| 第二章 伊马替尼耐药性K562细胞株的建立及特性 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 脐带间充质干细胞的分离、培养及鉴定 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 人脐带间充质干细胞逆转白血病细胞对伊马替尼和阿霉素的耐受性 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 结论 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间完成的科研成果 |
| 致谢 |
（5）化疗联合CIK细胞治疗恶性肿瘤的相关研究及在卵巢癌临床治疗中的观察（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 研究背景 |
| 一、EOC 的生物标志物 |
| 二、筛查策略 |
| 三、治疗 |
| 四、小结与展望 |
| 参考文献 |
| 第一部分 DDP 联合 CIK 细胞对卵巢癌细胞株 SKOV-3 的杀伤效应 |
| 第一章 材料与方法 |
| 第二章 结果 |
| 第三章 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 氟尿嘧啶联合 CIK 细胞在小鼠结肠癌模型体内抗肿瘤效应的实验研究 |
| 第一章 材料和方法 |
| 第二章 结果 |
| 第三章 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 化疗联合 CIK 细胞治疗卵巢癌的临床观察 |
| 第一章 资料与方法 |
| 第二章 临床病例资料结果 |
| 第三章 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一：CIK 细胞过继免疫治疗研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二：协同刺激分子 B7-H4 在卵巢癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述三：miRNA 与卵巢癌 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 本研究所获的基金资助 |
| 中英文缩略词表 |
| 致谢 |
（7）源于健康人与肝癌患者CIK细胞的生物学特性及抗癌活性的对比研究（论文提纲范文）
| 英文缩写词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一部分 CIK细胞体外增值和杀瘤活性的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 CIK细胞联合化疗的抗肿瘤的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 硕士期间发表论文 |
| 致谢 |
（8）不同激活方式对CIK细胞增殖及细胞毒作用的影响（论文提纲范文）
| 一、英文缩写 |
| 二、论文不同激活方式对CIK 细胞增殖及细胞毒作用的影响 |
| 1、中文摘要 |
| 2、英文摘要 |
| 3、前言 |
| 4、材料与方法 |
| 5、结果 |
| 7、讨论 |
| 8、小结 |
| 9、参考文献 |
| 三、文献综述 |
| 四、致谢 |
（9）乳腺癌多药耐药细胞株及敏感株抗原致敏树突状细胞介导的特异性抗肿瘤免疫研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 论文正文 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 英文正文 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
| 缩略词表 |
| 文献综述 |
| 附图 |
（10）白血病细胞的体外净化原理与方法（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 白血病的基本治疗方法 |
| 1.1 化疗[1, 2] |
| 1.2 中西医结合治疗[3] |
| 1.3 生物调节剂与基因治疗[4, 5] |
| 1.4 骨髓移植 (BMT) [6～8] |
| 2 白血病细胞的体外净化方法和基本原理 |
| 2.1 物理学净化法 |
| 2.2 化学药物学净化法 |
| 2.3 分子生物学净化法 |
| 2.4 免疫学净化法 |
| 2.5 光动力学净化法 |
| 2.6 联合净化法[29, 30]. |
| 3 结束语 |
四、异体LAK细胞对白血病患者MDR细胞的体外净化作用（论文参考文献）
- [1]遗传指导下异基因NK细胞输注治疗老年急性髓系白血病的临床研究[D]. 刘敏红. 南方医科大学, 2020(01)
- [2]补肾回阳方对肾阳虚小鼠免疫系统的调控及活性单体解析和天然化合物抗白血病模型筛选[D]. 李增政. 昆明理工大学, 2020(05)
- [3]肺瘤平膏通过AMPK/mTOR信号通路调控自噬影响肺癌顺铂耐药的机制研究[D]. 张振华. 北京中医药大学, 2020(04)
- [4]间充质干细胞逆转白血病K562细胞伊马替尼耐药性的研究[D]. 孙静. 兰州大学, 2018(02)
- [5]化疗联合CIK细胞治疗恶性肿瘤的相关研究及在卵巢癌临床治疗中的观察[D]. 徐梅. 苏州大学, 2014(04)
- [6]CIK细胞与乳腺癌的免疫治疗[A]. 张香梅,张文清,高春晖,刘杰,贾岩峰,于洋,谷晓伟. 第五届中国肿瘤学术大会暨第七届海峡两岸肿瘤学术会议、国际肿瘤细胞与基因治疗学会会议、第二届中日肿瘤介入治疗学术会议论文集, 2008
- [7]源于健康人与肝癌患者CIK细胞的生物学特性及抗癌活性的对比研究[D]. 刘岩青. 中国人民解放军军医进修学院, 2008(08)
- [8]不同激活方式对CIK细胞增殖及细胞毒作用的影响[D]. 郑海平. 广西医科大学, 2006(01)
- [9]乳腺癌多药耐药细胞株及敏感株抗原致敏树突状细胞介导的特异性抗肿瘤免疫研究[D]. 黄晖蓉. 兰州大学, 2006(09)
- [10]白血病细胞的体外净化原理与方法[J]. 李忠明. 咸宁学院学报, 2005(03)
标签：伊马替尼论文; 化疗药物论文; 急性淋巴细胞白血病论文; 细胞自噬论文; 白血病论文;