一、应用寡核苷酸芯片检测白血病患者P53和K-ras基因点突变（论文文献综述）
王叙[1]（2021）在《肿瘤细胞内阿霉素代谢与作用靶点研究》文中提出药理学研究是药品注册的主要内容之一。随着分子药理学的发展,药物机制的解释已从认识普识性的药物基本作用、药代动力学和毒理学,向药物作用靶点的功能解析转变。本研究聚焦于药物作用靶细胞/靶器官,以临床使用数十年的抗肿瘤蒽环类药物阿霉素（ADM）为实施例,采用药物作用靶细胞为研究材料,构建分析药物作用靶蛋白和靶细胞处置药物的方法,以补充现有的药理学研究方法,快速和相对全面的认识药物的作用机制。主要研究结果如下:1.以ADM为例建立细胞内药物代谢物研究方法。经典的药代动力学可以获得机体对干预药物处置的基本信息,包括药物在机体内吸收、分布、代谢和排泄的数据,但缺乏药物作用靶细胞/靶器官对于药物处置的认识,无法解释药物分子作用的行为特征。本文以ADM作用的靶细胞-乳腺癌导管上皮细胞（MCF7）和其耐药型细胞（MCF7/ADM）为研究材料,分别体外培养添加ADM后,有机萃取细胞中的ADM及其代谢物,利用UPLC分离提取物组分,并对部分组分进行串联质谱分析。基于ADM及其代谢物在480 nm处有特征吸收,以及其母核m/z 321结构稳定的特点,选择从MCF7/ADM来源的ADM结构类似物进行多级质谱鉴定,发现了3个未见报道的ADM代谢物并推断出其化学结构。生物计算模拟比较了ADM与这些新代谢物对DNA的插入能力,发现这些代谢物与DNA的亲和力下降,这3种代谢物与ADM机体药代动力学获得的代谢物完全不同,提示ADM耐药细胞可能存在独特的药物代谢途径,ADM在其胞内代谢可能与它对干预药物作用的抵抗机制相关。2.以ADM为例建立基于蛋白质微阵列的药物靶点筛选方法研究。药物作用靶点的确认是药理学研究的重要内容,经典和反向药理学均采用从药效和毒理现象来认证药物分子作用靶点的策略,导致对药物机制的解析需要数十年或者更长的时间,且认识层面非常单一和循序渐进。本文设计并合成了生物素化ADM,借助CY5荧光基团标记的亲和素与生物素之间的超强亲和力,构建了药物分子示踪探针。在包含21000多种人类蛋白的芯片上筛选ADM结合蛋白,对获得的具有结合ADM能力的蛋白,采用ADM与生物素化ADM竞争结合反应鉴定ADM特异结合的蛋白。统计荧光信号值得出401个SNR>4.0的蛋白作为ADM的潜在作用靶点,其中包含30个SNR>10.0的高亲和力蛋白。通过方法学优化,建立了操作可行和质量可控的蛋白质微阵列的药物靶点筛选方法。3.ADM作用靶点HRAS的确认。药物分子空间结构的复杂性导致其结合靶点的非单一性已是公识,收集这些靶点蛋白的功能解释,结合药物对靶点蛋白功能影响的研究,既可从分子水平上解析药物的作用机制和潜在的治疗适应症,还可对药物的副作用做前瞻性研究,以及预测靶细胞/靶器官对药物的处置方式。本文使用GO聚类、蛋白质互作等生物信息学手段对401个ADM潜在结合蛋白进行了功能分析,发现主要集中在细胞粘附、胞内代谢和信号传导等方面,进一步研究其中的相关酶蛋白对ADM的修饰作用,有望解析靶细胞产生ADM新代谢物的机制。这些结果提示了ADM可作用于靶细胞的多种功能通路,具有多靶点的特征,远超过目前已知的ADM药物治疗作用。系统的疾病关联分析还发现,部分结合蛋白与ADM心脏毒性副作用呈高度相关性。基于结合聚类分析、蛋白互作网络和SNR值,提出具有较高信噪比的ADM结合蛋白HRAS对于ADM作用靶细胞具有重要作用。采用BLI技术获得HRAS与ADM结合的平衡解离常数KD为10.2 n M。4.阿霉素药理作用机制的新发现。基于HRAS与RAF结合来传导信号的认识,设计了体外ADM干预下的HRAS-RAF定量结合实验,发现ADM可促进HRAS-RAF复合物的生成。生物计算模拟结果也表明ADM参与形成的三元复合物结构更稳定,预测ADM的结合位点在HRAS与RAF结合点附近。以高表达HRAS的膀胱癌细胞RT4、J82为研究材料,验证了ADM通过促进HRAS与RAF结合来激活细胞增殖的相关通路,加快细胞周期进程。对比经典的ADM干扰DNA复制引发细胞周期阻滞来促进细胞凋亡的实验证据,提示ADM具有激活细胞增殖和加速细胞死亡的双向性药理作用。提出了ADM在抗肿瘤治疗过程中,既可以杀伤快速生长的肿瘤细胞,也有望促进异质性肿瘤细胞群中对药物不敏感的处于G0期的细胞进入增殖期,提升ADM的杀伤效果。本研究从靶细胞处置药物和药物作用靶点两个方面,建立了细胞内干预药物及其结合分子的研究方法,发现了新的ADM代谢物及其靶点,丰富了对ADM作用机制的认识。建立的胞内药物代谢物分析方法和基于蛋白质微阵列的药物结合蛋白筛选方法具有普适性,为药理学研究提供了新的工具。
李刘丽[2]（2021）在《ERCC1基因外显子跳跃型可变剪接在肺癌顺铂耐药中的作用及机制研究》文中认为目的:内源性活性氧,以及化学诱变剂等外源性因素导致的DNA损伤负荷,激活机体DNA损伤应答基因,通过协调多层信号级联传导启动DNA损伤反应（DNA damage response,DDR）。核苷酸切除修复系统（nucleotide excision repair,NER）是DDR的关键组成部分,对于保护基因组完整性免受遗传毒性损害至关重要。以顺铂为代表的经典基因毒类药物诱导产生的DNA-加合物,主要由切除修复交叉互补基因1（excision repair cross complementing 1,ERCC1）编码蛋白为核心的NER系统负责修复,因此成为基因毒类化疗药物抗性产生的关键机制。ERCC1基因是NER通路最具特异性的限速酶基因,其基因多态性及表达水平一直作为铂类药物治疗肺癌的预测因子,然而研究结论不尽相同。可变剪接是转录组和蛋白质组多样性的重要来源,也为基因的功能研究提供了全新视角。研究发现可变剪接可作为肿瘤易感及预后的预测因子,同时许多环境致癌因子及化学治疗药物也可影响可变剪接;已经鉴定出许多破坏或操纵剪接体或剪接位点识别的化合物和寡核苷酸作为干预可变剪接的有效策略。近期研究表明靶向DNA损伤修复系统的关键因子,干扰DDR信号级联具有影响肿瘤微环境的生物学特性:DDR介导的细胞外信号可以增强肿瘤局部免疫反应,有利于改善患者预后。其中cGAS-STING作为胞质DNA传感器激活适应性免疫反应和先天性免疫反应通路,与DNA损伤疗法的临床相关性已成为研究的热点,因此,本研究首次探讨ERCC1基因的可变剪接对天然免疫通路cGAS-STING的影响。充分认识和深入探索ERCC1基因的可变剪接机制,并开发应用剪接疗法针对剪接过程的关键因子进行调控,挖掘抗肿瘤免疫激活的有效策略,有望为寻找有效的肺癌治疗靶点与预后生物标志提供重要的理论依据和科学线索。研究方法:1、肺癌病例结合体外顺铂抵抗细胞模型明确ERCC1基因不同剪接异构体与顺铂抗性的关联性:（1）术中收集肺癌组织使用MTT法对其进行药物敏感性试验,检测其顺铂IC50,并使用QPCR检测ERCC1基因外显子3和外显子8跳跃水平,分析其与顺铂抗性的关联;在A549及其顺铂抵抗细胞A549/DDP中验证上述肺癌病例研究结果。（2）在A549及A549/DDP中分别过表达或敲低不同剪接异构体,CCK8和γH2AX免疫荧光实验检测顺铂抗性的变化。（3）COIP实验明确ERCC1不同剪接异构体与NER系统关键因子XPA和XPF的结合能力,探索其作用机制。（4）通过Western blot检测cGAS、STING、IRF3、p IRF3,ELISA检测IFN-β蛋白水平,探索上述细胞cGAS-STING通路的活性。（5）过表达/敲低ERCC1不同剪接异构体,观测cGAS-STING通路活性的变化。2、探索ERCC1基因可变剪接的关键调控因子:（1）生物信息学网站筛查ERCC1基因可变剪接的关键调控因子,使用RIP实验验证A549及A549/DDP中候选剪接因子PRPF8与ERCC1基因pre-m RNA的结合情况。（2）使用si RNA靶向敲低PRPF8,检测ERCC1基因剪接异构体变化,明确其下游cGAS-STING通路相关蛋白的表达变化。（3）敲低顺铂抵抗细胞A549/DDP中PRPF8,CCK8和γH2AX免疫荧光实验评估其化疗增敏作用。（4）免疫组化检测肺癌组织中PRPF8蛋白表达水平,明确其与顺铂抗性(IC50)的关联。3、探索植物活性物质β-榄香烯对RNA结合蛋白PRPF8的影响,明确ERCC1基因可变剪接以及cGAS-STING通路的变化:（1）使用不同浓度β-榄香烯联合顺铂处理A549/DDP细胞,选择β-榄香烯适宜的处理剂量,结合γH2AX免疫荧光实验评估其对顺铂药物抵抗的增敏作用。（2）分析β-榄香烯处理对RNA结合蛋白PRPF8的影响及其靶基因ERCC1基因的剪接调控。（3）检测β-榄香烯处理对cGAS-STING通路活性的影响。结果:1、ERCC1基因外显子跳跃型可变剪接影响肺癌顺铂药物抵抗并改变cGAS-STING通路活性:（1）肺癌病例研究ERCC1基因外显子8包含水平及其与外显子8跳跃的比例与顺铂IC50显着正相关（P<0.05）,即外显子8包含水平越高,患者顺铂抗性越高;ERCC1基因外显子3跳跃水平与顺铂抗性呈负相关,其包含与跳跃的剪接异构体表达之比与之呈显着正相关（P<0.05）,即外显子3跳跃促进肺癌患者对顺铂的敏感性。顺铂处理A549及其顺铂抵抗细胞A549/DDP,证实其耐药株具有顺铂抗性,其耐药株中,ERCC1外显子3剪接指数显着高于敏感株,全长型ERCC1表达（外显子3和外显子8包含）显着高于敏感株。（2）在A549中分别过表达不同剪接异构体,其全长型ERCC1-FL促进顺铂抗性,IC50显着上调,DNA损伤水平显着降低,而外显子3跳跃ERCC1-E3D和外显子8跳跃ERCC1-E8D的剪接异构体过表达,未观测到顺铂抗性的显着变化;顺铂抵抗细胞A549/DDP中针对外显子3和外显子8敲低对应的剪接异构体,显着改善了该细胞的顺铂抗性,IC50显着降低,DNA损伤加剧,其中,外显子3的敲除,损伤较外显子8更显着,且IC50更低。（3）COIP实验证实外显子8缺失的剪接异构体丧失了与NER系统关键因子XPF的结合能力;外显子3的缺失对ERCC1与XPA的结合能力并无显着影响。（4）A549和A549/DDP细胞经过顺铂处理后,前者cGAS-STING通路显着激活,后者该通路活性下降。（5）在A549中分别过表达不同剪接异构体,其全长型ERCC1-FL显着抑制cGAS-STING通路活性,而外显子3跳跃ERCC1-E3D和外显子8跳跃ERCC1-E8D的剪接异构体过表达,未观测到该通路显着变化;顺铂抵抗细胞A549/DDP中针对外显子3和外显子8敲低对应的剪接异构体,该细胞中cGAS-STING通路被显着激活。2、RNA结合蛋白PRPF8调控ERCC1基因可变剪接促进顺铂抗性:（1）生物信息学分析证实PRPF8与ERCC1基因外显子8和外显子3表达呈正相关,RIP实验证实A549及其顺铂抵抗细胞A549/DDP中候选剪接因子PRPF8可与ERCC1基因pre-m RNA结合,调控其可变剪接。（2）使用si RNA靶向敲低PRPF8,ERCC1基因外显子3包含比例显着降低,下游cGAS-STING通路相关蛋白表达上调,呈显着激活状态。（3）敲低顺铂抵抗细胞A549/DDP中PRPF8,IC50显着降低,DNA损伤加剧,即显着改善了细胞的化疗抗性。（4）肺癌组织中PRPF8蛋白表达水平与顺铂抗性(IC50)呈正关联,且执行化疗治疗的患者,PRPF8高表达,预后不良。3、β-榄香烯下调剪接因子PRPF8改变ERCC1基因可变剪接调控cGAS-STING通路逆转肺癌顺铂抗性:（1）β-榄香烯联合顺铂处理A549/DDP细胞,IC50显着降低,DNA损伤加剧,即发挥顺铂增敏作用。（2）β-榄香烯下调RNA结合蛋白PRPF8改变靶基因ERCC1基因的剪接。（3）β-榄香烯处理挽救顺铂所致的cGAS-STING活性抑制,使得该通路重新激活。结论:1、本研究系统分析肺癌组织及细胞中ERCC1外显子跳跃型可变剪接与顺铂药物抵抗的关联,发现全长型ERCC1与XPA和XPF结合具有完善的DNA损伤修复功能,促进肺癌顺铂药物抵抗,同时抑制天然免疫通路cGAS-STING活性;靶向敲除外显子3和外显子对应的ERCC1剪接异构体,DNA损伤修复能力降低,改善肺癌顺铂药物抵抗,同时激活cGAS-STING通路。2、本研究结合生物信息学和实验研究鉴定了ERCC1基因可变剪接的关键调节因子,RNA结合蛋白PRPF8,通过与ERCC1 pre-m RNA的结合,该蛋白调控ERCC1基因外显子3的剪接,促进顺铂药物抵抗,导致患者预后不良;靶向敲低PRPF8,促进ERCC1外显子3跳跃,DNA损伤修复能力降低,改善肺癌顺铂药物抵抗,并激活cGAS-STING天然免疫通路。3、中草药提取物β-榄香烯与顺铂联合使用,通过下调剪接因子PRPF8的表达抑制靶基因ERCC1可变剪接,促使功能性的全长ERCC1表达显着下调,增加顺铂所致的遗传毒性,改善肺癌顺铂药物抵抗并重新激活cGAS-STING通路。
郝书弘[3]（2020）在《结直肠癌患者KRAS、NRAS、BRAF基因突变与关键基因表达的相关性及circGLG1/miR-622/KRAS轴的分子作用机制》文中研究说明背景:结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一。在我国CRC的发病率呈逐渐上升趋势。结直肠癌的病因和发病机制十分复杂,涉及基因组、转录组、蛋白质组学及表观遗传学等多种因素的异常改变。利用现代分子生物学技术,对结直肠癌分子发病机制的更深入研究,对本病的早期诊断及个体化治疗至关重要。作为表皮生长因子受体（epidermal growth fatctor receptor,EGFR）信号通路的关键分子,KRAS、NRAS和BRAF基因突变已被证实在结直肠癌的发生、发展过程中起到重要作用,且对结直肠癌患者的靶向治疗具有重要的指导价值。然而,目前研究大多集中在KRAS、NRAS和BRAF的突变频率及其预后价值上,但对于这些基因突变与患者临床病理学特征及其他基因表达的关系仍缺乏了解。因此,分析上述基因突变和结直肠癌患者临床病理学参数及其他基因表达的内在联系对于更加精准的指导个体化治疗具有重要意义。环状RNA（circular RNA,circRNA）是新发现的一类共价闭合环状非编码RNA。CircRNA以其闭合成环,高度稳定,特异性强,易于检测等特点,逐渐成为恶性肿瘤领域的研究热点,且有望成为肿瘤诊断和评估预后最有潜力的分子标记物。KRAS基因作为结直肠癌中最关键的驱动基因,除了基因突变外KRAS基因是否通过其它方式参与结直肠癌的发生发展,在结直肠癌中,KRAS基因的表达水平如何,其表达还受到哪些非编码RNA,尤其是circRNA的分子调控,目前尚无相关报道。目的:本研究拟通过扩增阻碍突变系统PCR（amplification-refractory mutation system polymerase chain reaction,ARMS-PCR）的方法检测结直肠癌组织中KRAS、NRAS和BRAF的常见突变位点,同时,采用免疫组化的方法检测8个结直肠癌关键基因在蛋白水平的表达情况。通过多种统计学方法,探讨KRAS、NRAS和BRAF基因突变与结直肠癌患者临床病理学特征及关键基因表达的内在联系,旨在为更精准的指导结直肠癌的靶向治疗提供依据。此外,本研究在KRAS、NRAS、BRAF突变的基础之上,选取重要靶点,以KRAS表达调控为切入点,利用生物信息分析的方法筛选出结直肠癌发病过程中的关键circRNA/miRNA/KRAS调控轴,并在分子水平、蛋白水平、细胞功能水平对其进行验证。旨在转录后调控层面进一步完善KRAS基因在结直肠癌中的作用及机制,为结直肠癌患者的诊断、治疗提供新的生物标志物和分子靶点。方法:1.收集我院手术切除CRC组织216例。通过ARMS-PCR方法检测216例CRC组织中KRAS、NRAS和BRAF的常见突变位点。通过χ2检验、Mann-Whitney秩和检验、独立样本t检验等统计学方法分析上述基因突变与患者性别、年龄、肿瘤部位、TNM分期、浸润深度、有无淋巴结转移、病理类型、分化程度等临床指标的相关性。2.采用免疫组化的方法检测了P53、EGFR、CDX2、PMS2、MLH1、MSH6、MSH2和Ki67等8个CRC关键基因在蛋白水平的表达情况。通过χ2检验、Mann-Whitney秩和检验、多重对应分析探讨了上述基因表达与KRAS、NRAS和BRAF突变的相关性。3.收集我院手术切除的CRC组织及癌旁组织40对。通过实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time-polymerase chain reaction,qRT-PCR）方法检测40对肿瘤组织及癌旁组织KRAS表达水平。利用生物信息分析的方法筛选出结直肠癌增殖及侵袭相关的circRNA分子及KRAS基因潜在的上游调控miRNA分子,建立可能的circRNA/miRNA/KRAS调控轴。在40对CRC临床样本中检测上述调控轴中circRNA（circGLG1）及miRNA（miR-622）的表达水平,利用Pearson线性相关法分析其表达与KRAS表达的相关性。4.检测3株结肠癌细胞系（HCT8、HCT116、DLD1）和正常人肠上皮细胞系（NCM460）中circGLG1的表达水平。根据circGLG1序列设计siRNA及其对照,利用Lipofectamine 2000进行细胞转染。在DLD1细胞系中敲低circGLG1后:1)采用CCK-8、克隆形成实验检测细胞增殖活性;2)采用Transwell、划痕愈合实验检测细胞侵袭及迁移能力;3)检测miR-622表达变化,在mRNA水平和蛋白水平检测KRAS表达变化。在成功敲低circGLG1的基础上共转染miR-622 inhibitor,观察细胞增殖、侵袭、迁移能力及KRAS表达变化是否可以回复。5.根据circGLG1及KRAS序列与miR-622互补配对的区域,设计合成野生型及突变型双荧光素酶报告载体质粒,通过双荧光素酶报告实验进一步验证circGLG1与miR-622,miR-622与KRAS的靶向结合作用。结果:1.CRC患者中KRAS基因突变率为39.8%,其突变位点按概率高低依次为G12D（16.2%）、G12V（8.8%）、G13D（8.3%）、G12S（1.9%）、G12C（1.9%）、G12A（1.4%）、G12R（0.9%）、双位点突变（G12D+G12S）（0.5%）。NRAS的突变率为2.7%,其突变位点为G12D、G13D、Q61R各0.9%。BRAF V600E的突变率为1.4%。KRAS突变与性别有关,女性突变率高于男性（53.3%vs 32.6%,P=0.003）。NRAS、BRAF突变与性别无关。KRAS、NRAS、BRAF突变与患者年龄、TNM分期、浸润深度、有无淋巴结转移、组织病理类型、腺癌分化程度等均无显着相关性。2.免疫组化与KRAS、NRAS、BRAF基因突变结果分析显示,EGFR表达与NRAS突变有关,EGFR阳性表达者突变率高于弱阳性表达者及阴性表达者（5.3%vs 1.4%vs 0%,P=0.047）。PMS2、MLH1、MSH2表达与BRAF突变有关,PMS2阴性表达者BRAF突变率高于弱阳性表达者及阳性表达者（16.7%vs 0%vs 1%,P=0.010）。MLH1阴性表达者BRAF突变率高于弱阳性表达者及阳性表达者（16.7%vs 7.7%vs 0.5%,P=0.001）。MSH2阴性表达者BRAF突变率高于弱阳性表达者及阳性表达者（33.3%vs 0%vs 1.0%,P=0.005）。3.在40对CRC组织及癌旁组织中检测KRAS表达,结果显示,与癌旁组织相比,KRAS在CRC组织中的表达水平显着升高（P<0.001）。通过生物信息学分析的方法建立假设:circGLG1可能通过circGLG1/miR-622/KRAS轴调节结直肠癌增殖及侵袭。为了进一步验证上述假设,我们通过临床样本PCR发现,与癌旁组织相比,circGLG1在CRC组织中的表达明显上调（P<0.01）且与KRAS表达水平呈正相关（R2=0.586,P<0.001）。同时miR-622在CRC组织中的表达明显下调（P<0.01）且与KRAS表达水平呈负相关（R2=-0.339,P<0.05）。4.CircGLG1在肠癌细胞中的表达高于正常肠上皮细胞,其中DLD1细胞中circGLG1表达量最高（P<0.001）。成功设计了2条circGLG1 siRNA。在DLD1细胞系中敲低circGLG1后:1)CCK-8、克隆形成实验证实DLD1细胞增殖受到抑制;2)Transwell、划痕愈合实验证实DLD1细胞侵袭及迁移受到抑制;3)miR-622表达升高,KRAS在mRNA水平和蛋白水平表达均降低。在成功敲低circGLG1的基础上通过共转染miR-622 inhibitor下调DLD1细胞中miR-622表达后,circGLG1不能发挥其对细胞增殖、侵袭的调节作用。且miR-622 inhibitor可回复circGLG1对KRAS表达的调控作用。5.双荧光素酶报告实验结果显示,同时加入野生型重组质粒pEZX-MT06-Wt-circGLG1或pEZX-MT06-Wt-KRAS和miR-622 mimic后,DLD1细胞的荧光素酶活性显着减低,而突变型重组质粒与miR-622 mimic共转染时,荧光素酶活性无明显差异,这充分证明了miR-622与circGLG1和KRAS之间的可结合性。综上,本研究全面检测了216例结直肠癌患者中KRAS、NRAS、BRAF的突变分布并分析了其与患者临床病理参数及关键基因表达的相关性,首次发现EGFR表达与NRAS突变有关,证实了PMS2、MLH1、MSH2等错配修复基因表达缺失与BRAF突变有关。此外,我们证实了KRAS基因在结直肠癌及癌旁组织种存在差异表达,其非编码RNA调节机制之一为circGLG1可以通过circGLG1/miR-622/KRAS轴促进结直肠癌细胞的增殖及侵袭。我们的研究为进一步阐明结直肠癌分子机制提供了理论和实验依据,同时为结直肠癌的诊断及治疗提供了新的生物标志物及关键分子靶点。
侯小赛[4]（2018）在《miR-1182通过靶向hTERT抑制卵巢癌的转移和增殖》文中研究指明目的:目前研究发现,micromaRNA（miRNA）与多种危害人类健康的恶性肿瘤发生发展密切相关,其参与调控肿瘤细胞的生物学特性,例如增殖、侵袭、转移、凋亡等阶段,通过对癌基因、抑癌基因以及相关蛋白表达的表观遗传学调控对肿瘤细胞发挥作用,这表明miRNA有望成为癌症治疗靶点。MicroRNA1182（miR-1182）是micromaRNA调控网络的重要组成部分,对许多疾病发挥重要调节作用,然而,其对卵巢癌发生发展和作用机制尚未研究。本研究旨在探讨miR-1182在卵巢癌发生、发展以及转移中的表达情况,及其潜在的变化规律和作用靶点,为临床诊断和治疗卵巢癌提供理伦依据。方法:本研究通过收集我院2015年03月至2018年03月之间卵巢癌患者行手术切除的卵巢上皮癌组织标本,共50例;同时收集癌旁正常卵巢组织标本50例。在第一部分通过荧光实时定量PCR（RT-PCR）法观察比较miR-1182在卵巢癌组织、细胞（SKOV3）和正常卵巢组织及细胞（IOSE80）中的表达情况和变化规律。在第二部分中,为了研究miR-1182的潜在靶点,我们利用TargetScan,miRDB和microRNA三种公开的算法对其进行了检测,以推测阐明miR-1182的可能靶点,并采用双荧光素酶报告系统证实了人端粒酶逆转录酶（human Telomerase Reverse Transcriptase,hTERT）是miR-1182的直接调控靶点,并被实施到下一步的实验中。在第三部分中我们在SKOV3细胞中分别设立三个组进行相似的实验（miR-NC组,miR-1182模拟组和模拟物+ hTERT组）,使用RT-PCR方法和Western blot蛋白印记实验检测miR-1128对靶基因hTRET表达情况的影响,进而明确miR-11H82与其靶基因之间的相关性。在第四部分中我们进一步采用MTT法检测卵巢癌细胞的增殖率,采用Transwell实验检测卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力,从而明确miR-1182对卵巢癌的发生与发展,以及在侵袭和转移方面发挥的作用。结果:1、miR-1182在卵巢癌组织和细胞中表达下调我们通过RT-PCR的方法观察了miR-1182在卵巢癌组织和细胞（SKOV3细胞）及正常卵巢组织和细胞（IOSE80细胞）中miR-1182的表达情况,结果显示,与正常卵巢组织相比,卵巢癌组织中miR-1182的表达水平下调,差异有统计学意义（p<0.0001,见图1-1）,与正常卵巢细胞（IOSE80细胞）相比,卵巢癌细胞（SKOV3细胞）中miR-1182的表达水平也呈下降趋势,差异有统计学意义（p<0.001,见图1-2）,因此我们认为miR-1182在卵巢癌进展过程中具有一定的调节作用。2、卵巢癌中hTERT是miR-1182的直接靶标我们利用TargetScan,miRDB和microRNA三种公开的算法推测出人端粒酶逆转录酶（human Telomerase Reverse Transcriptase,hTERT）是miR-1182的潜在靶点,并建立含有hTERT3’UTR野生型和含有hTERT3’UTR突变型miR-1182种子序列的萤光素酶报告载体,利用模拟物增加miR-1182的表达从而导致野生型hTERT 3’UTR报告基因的荧光素酶活性降低,但对突变型却没有影响（P<0.001,见图2-2）,这表明可通过调节miR-1182来抑制hTERT的表达水平。3、miR-1182和hTERT的相关性我们在SKOV3细胞中分别设立三个组进行相似的实验（miR-NC组,miR-1182模拟组和模拟物+ hTERT组）,通过实时PCR分析和Western blot蛋白质印迹两种实验可以发现,SKOV3细胞中miR-1182的上调可以降低hTERT的表达水平（图3-1,图3-2）,其差异有统计学意义（P<0.05）,这些数据表明hTERT受到miR-1182的负调控。4、miR-1182抑制卵巢癌细胞的增殖、侵袭和迁移我们通过MTT法检测细胞增殖率,MTT结果显示,通过转染miR-1182模拟物上调miR-1182后,SKOV3细胞的细胞增殖率出现降低趋势,相比之下,下调miR-1182反而促进卵巢癌细胞的生长（见图4-1）。在Transwell实验中,我们发现SKOV3细胞的迁移和侵袭能力通过上调miR-1182起到抑制作用。（p<0.05,图4-2,图4-3）。结论:首先实验发现miR-1182在卵巢癌组织、细胞（SKOV3）中的异常表达情况,进而证实hTERT是miR-1182的潜在靶点,hTERT的表达可被miR-1182调节,hTERT受到miR-1182的负调控,从而抑制卵巢癌细胞的增殖和侵袭迁移能力,揭示miR-1182/hTERT轴可能成为诊断和治疗卵巢癌的潜在靶点,为临床提供理论依据。
张英博[5]（2015）在《蝙蝠葛碱调控Hedgehog信号通路对胰腺癌相关基因、蛋白影响的实验研究》文中认为目的:通过蝙蝠葛碱（Dau）抗胰腺癌作用的体内外实验研究,观察Dau对人胰腺癌细胞BxPC-3和裸鼠移植瘤的抑制作用、超微病理学改变及细胞周期与凋亡的影响;观察Dau调控Hedgehog信号通路中Shh、Ptch1、Smo、Gli1 mRNA和蛋白表达对胰腺癌抑制作用的影响,深入探讨蝙蝠葛碱抗胰腺癌的作用机制。方法:通过细胞生物学、超微病理学、免疫化学法、Western blot、实时定量PCR、流式细胞术等技术,从生物学特性、蛋白质和基因水平阐述Dau对胰腺癌的抑制作用以及与Hedgehog信号通路的相关性。胰腺癌BxPC-3细胞培养、传代,分为四组:模型组、Dau高、低剂量组及5-FU组;构建裸鼠移植瘤模型,随机分为五组:模型组、空白对照组、Dau高、低剂量组及5-FU组,药物干预后检测:（1）体外实验通过台盼蓝拒染法、MTT法检测Dau对人胰腺癌BxPC-3细胞生长曲线及增殖的影响;（2）体内实验检测Dau对人胰腺癌BxPC-3移植瘤抑制率及脾脏指数的影响;（3）通过透射电镜观察Dau对人胰腺癌BxPC-3细胞及移植瘤超微结构变化的影响;（4）利用流式细胞术检测Dau对人胰腺癌BxPC-3细胞和移植瘤细胞周期及凋亡变化的影响;（5）采用实时定量PCR、免疫细胞化学、Western blot技术检测Hedgehog信号通路中主要分子Shh、Ptch1、Smo、Gli1 mRNA和蛋白表达水平变化。结果:（1）体外实验中Dau能明显抑制BxPC-3细胞的增殖,抑制率Dau高、低剂量组、5-FU组分别为70.32%、42.68%、56.07%,与模型组比较差异显着有统计学意义（P<0.01）;Dau不同时间、剂量比较具有时间依赖性,统计学有意义（P<0.01）。（2）体内实验中Dau对胰腺癌BxPC-3移植瘤抑制率Dau高、低剂量组、5-FU组分别为50.44%、31.74%、33.64%。与模型组比较差异显着（P<0.01）;Dau高、低剂量组与空白组比较,对荷瘤裸鼠的脾脏指数无明显影响（P>0.05）;而5-FU组与空白组比较差异有统计学意义（P<0.05）。（3）通过透射电镜观察Dau对胰腺癌BxPC-3细胞及移植瘤超微结构变化的影响,镜下可见细胞器发生不同程度的损伤改变,并伴有细胞凋亡出现。（4）在体内、外FCM实验检测中Dau高、低剂量、5-FU各组BxPC-3细胞及移植瘤细胞均出现不同程度阻滞,表现为G1期增长,S期缩短;并随Dau浓度升高细胞凋亡率上升;细胞周期检测中Dau高剂量组、5-FU组与模型组比较差异显着（P<0.01）,Dau低剂量组与模型组比较有差异性（P<0.05）;细胞凋亡检测中药物干预各组与模型组比较各组均有显着差异（P<0.01）。（5）采用免疫化学、Western blot、实时定量PCR技术检测体内、外Hedgehog信号通路中Shh、Ptch1、Smo、Gli1 mRNA和蛋白表达,Dau高、低剂量组、5-FU组表达均下凋,Dau高剂量组与模型组比较差异显着具有统计学意义（P<0.01）。结论:（1）Dau对人胰腺癌BxPC-3细胞具有显着的抑制作用,抑制细胞增殖,且具有时间依赖性。（2）Dau有效抑制胰腺癌BxPC-3裸鼠移植瘤生长,对脾脏无明显损伤作用。（3）Dau干预作用人胰腺癌BxPC-3细胞、移植瘤后,可阻滞细胞周期并诱导肿瘤细胞的凋亡。（4）Dau对体内、外胰腺癌细胞调控作用中均可下调Hedgehog信号通路中Shh、Ptch1、Smo、Gli1 mRNA和蛋白表达,因此我们可以推断Dau抗胰腺癌的作用机理之一就是通过对Hedgehog信号通路的抑制而实现的,Dau通过下调Hedgehog信号通路中相关基因、蛋白的表达而阻滞肿瘤细胞周期、诱导肿瘤细胞凋亡,进而抑制胰腺癌细胞的生长、增殖。
孙德芳[6]（2014）在《C/EBP-β共激活的miR-31和miR-223靶向RASA1促进结直肠癌发生发展》文中研究表明结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是一种常见的严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤疾病。其中,RAS蛋白以及其介导的信号通路对CRC的发生和发展起着非常重要的作用,研究表明在CRC病人中30%～50%存在着K-RAS基因的突变。近十几年来的研究表明miRNA在诸多肿瘤调控中发挥着重要作用,但是具体的miRNA在CRC中对RAS信号通路调控还不是很清楚。此外,利用异常表达的miRNA的前体或者抑制剂来治疗CRC还没有报道。本文我们研究了 miR-31和miR-223调控RAS信号通路中的一个重要的RAS GTP酶激活蛋白-RASA1。首先我们使用miRNA生物芯片技术和实时荧光定量PCR实验分析发现在CRC组织和癌旁组织（NAT）中存在着许多异常表达的miRNA。在这161个异常表达的miRNA中,miR-3 1的变化最为显着。然后我们利用生物信息学的方法预测了 miR-3 1的可能的调控基因,并最终确定RASA1是其重要的靶基因。第一,我们在人的CRC和NAT样本中发现miR-31与RASA1蛋白的表达水平存在负相关性。第二,体外实验证实当用pre-miR-3 1-LV过表达miR-31时,RASA1蛋白表达水平显着下降;而当用anti-miR-3 1-LV处理细胞时会增加RASA1蛋白表达水平。第三,荧光素酶实验证实miR-31可以直接结合到RASA1转录本的3’UTR种子位点序列。通过体外的细胞增殖实验和体内的裸鼠异位瘤实验研究了miR-31调控RASA1所介导的生物学功能。综上所述,我们的结果第一次发现了miR-31在CRC中发挥着重要的作用:miR-31可以抑制RASA1的表达,增强RAS结合GTP的能力和ERK1/2的磷酸化水平,提高促增殖因子KI-67和PCNA的表达水平,促进细胞增殖,最终导致肿瘤生长。接下来,我们利用荧光定量PCR技术在24对CRC组织中检测了以RASA1为靶点的miRNA表达谱,结果显示相比于NAT,miR-223在24组CRC组织中均显着性上调。另外,RASA1作为miR-223的靶点,western blotting和原位免疫荧光结果显示RASA1在CRC组织中表达下调。进一步在Caco-2和HT-29细胞中的研究发现miR-223可以直接结合到RASA1 3’UTR的种子位点序列在转录后水平调控RASA1。通过使用MEK1/2的抑制剂表明miR-223可以通过激活RAS-MAPK信号通路来促进CRC细胞的增殖。体内的裸鼠异位瘤模型表明过表达miR-223会促进肿瘤生长和使用miR-223 AMO来抑制miR-223的表达会抑制实体瘤的生长。综上所述,我们的结果第一次研究了 miR-223在CRC发展过程中的作用,此结果丰富了 miR-223在癌症中的功能“双面性”。以miR-223为靶点的抑制剂可以显着抑制结肠肿瘤的生长,这就为CRC的治疗提供了一种可能的有效方案,使其可能在临床上用于治疗CRC。最后我们研究了在CRC中miR-31和miR-223之间的关系,我们发现在CRC中,C/EBP-β可能会同时调控miR-31和miR-223的形成。第一,荧光定量PCR技术检测发现在24组CRC组织中C/EBP-β和miR-31、miR-223均显着性上调,表明它们在体内存在着正相关。第二,在细胞中发现当C/EBP-β表达上调时,C/EBP-β磷酸化水平上升,同时miR-31和miR-223的水平上升;当C/EBP-β下调时,也出现了类似的调控。第三,通过启动子报告实验分析表明在Caco-2细胞中,C/EBP-β可以分别结合到miR-31和miR-223的启动子上,影响miR-31和miR-223的表达,这表明C/EBP-β是miR-31和miR-223的正调控因子。综上所述,在CRC发生发展过程中,细胞质的C/EBP-β磷酸化后进入细胞核,然后分别与miR-3 1的启动子和miR-223的启动子结合,从而保持miR-3 1和miR-223的高表达,进而导致miR-31和miR-223介导的CRC细胞的增殖和肿瘤的生长。
范晓棠[7]（2013）在《肝硬化基础上肝癌的临床危险因素分析及肝癌与肝硬化微小RNA差异表达研究》文中研究说明目的：1)初探新疆地区肝硬化病因特点及肝细胞性肝癌发生危险因素,以及肝硬化患者血液生化学特征；2)筛选乙肝肝硬化肝癌患者肝癌组织与肝硬化组织微小RNA （microRNA, miRNAs, miRNA）差异表达谱；3)检测差异表达最明显的miRNA在原发性肝癌（Primary Liver Cancer, PLC）患者肝癌组织中的表达。为原发性肝癌分子机制研究提供新的思路和途径,为原发性肝癌早期诊断提供分子指标的筛选奠定基础。方法：1)回顾分析新疆医科大学第一附属医院近11年确诊的7212例肝硬化住院患者病因构成,探讨乙型肝炎病毒（hepatitis B virus HBV）感染、丙肝病毒、饮酒、性别、年龄、民族、2型糖尿病对肝硬化人群肝细胞性肝癌发生的影响；对乙肝病毒合并酒精因素肝硬化患者与乙肝病毒不合并酒精肝硬化组、酒精性肝硬化组在年龄、性别、民族、肝硬化严重程度、血常规、生化指标的特征进行组间比较；2)在7212例肝硬化患者合并原发性肝癌的1169例患者中,选取行肝癌根治治疗的9例患者,取手术切除的肝癌标本（实验组）及距肿瘤5cm以上的肝硬化标本（对照组）。利用Trizol法提取肝癌组织和配对的肝硬化组织细胞中的总RNA,分光光度计NanoDropND-1000进行定量,变性凝胶电泳分析提取的总RNA质量。利用芯片技术对提取的RNA经microRNA芯片进行杂交,结果经扫描读数,最后用Significance Analysis of Microarrays软件version3.02（SAM）挑选差异表达基因。选择筛选出的2个差异表达明显的miRNAs hsa-miR-1269和hsa-miR-199b-3p进行实时荧光定量PCR验证;3)结果采用Rral-time PCR法,进一步测定hsa-miR-1269在肝癌组织和肝硬化组织中的表达水平。结果：1)7212例肝硬化病因构成前五位分别是乙型肝炎55.10%,丙型肝炎13.42%,原发性胆汁性肝硬化9.28%,酒精性6.36%,隐源性9.01%；16.5%发生肝细胞性肝癌,住院期间死亡6.3%,合并糖尿病占总体12.1%。其中3976例乙肝肝硬化患者中24.25%合并酒精因素,合并酒精因素乙肝肝硬化患者、单纯乙肝肝硬化组和酒精性肝硬化患者相比,在白细胞计数、平均红细胞体积、γ-谷氨酰转肽酶、血清尿酸水平呈现出酒精性肝病特征,且均值水平高于单纯乙肝肝硬化组；HBV感染、HCV感染、饮酒、男性、高龄为本组肝硬化患者肝细胞性肝癌发生独立危险因素,而民族（维吾尔族、其他民族与汉族相比）、2型糖尿病未增加本组肝硬化患者肝癌的发生；2)miRNAs在肝硬化肝癌患者肝癌组织与肝硬化组织中的差异表达：实验组和对照组差异表达的miRNAs共有15个,分别为hsa-miR-1269, hsa-miR-18a, hsa-miR-1180, hsa-miR-1301, hsa-miR-182, hsa-miR-222, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-99a, hsa-miR-10a, hsa-miR-30a, hsa-miR-30e, hsa-miR-139-5p, hsa-miR-422a, hsa-miR-199a-3p, hsa-miR-199b-3p。实时荧光定量PCR验证结果：hsa-miR-1269在实验组和对照组中的平均表达丰度分别为12.058±3.954和16.678±2.352,差异具有统计学意义（P=0.0096）。hsa-miR-199b-3p在实验组和对照组中的平均表达丰度分别为5.417±1.633和3.033±0.768,差异具有统计学意义（P=0.0028）。hsa-miR-1269在肝癌组织中表达上调,hsa-miR-199b-3p在肝癌组织中表达下调,与miRNAs微阵列芯片结果一致；3)hsa-miR-1269硬化肝癌患者肝癌组织和肝硬化中的表达：实时荧光定量PCR结果：hsa-miR-1269在实验组和对照组中的平均表达丰度分别为12.634±4.004和16.963±1.832,差异具有统计学意义（P=0.0035）。结论：1)新疆地区乙型肝炎病毒感染是该地区肝硬化主要原因,但酒精因素与HBV重叠较普遍是其特征；HBV合并酒精因素肝硬化组较乙肝肝硬化组面临更高的氧化应激压力,间接提示酒精因素的参与可能增加乙肝感染者发生肝硬化的机会；HBV感染、HCV感染、酒精（包括饮酒史不详者）、男性、高龄为该组肝硬化患者HCC独立危险因素。民族及2型糖尿病并未增加肝硬化患者肝细胞肝癌的发生；2)在乙肝肝硬化肝癌患者肝癌组织与肝硬化组织中筛选出了15种差异表达的miRNAs,其中hsa-miR-1180, hsa-miR-1301在国内外文献中未见报道,而hsa-miR-1269和hsa-miR-10a与其他一些肿瘤的发生和发展有关,但未见在肝癌中的报道；3)在15种差异表达的miRNAs中,hsa-miR-1269在肝硬化肝癌患者肝癌组织中呈明显的高表达,是一种功能上类似促癌基因的miRNAs。
朱丹霞[8]（2012）在《microRNA在慢性淋巴细胞白血病凋亡抑制通路中的作用研究》文中认为第一部分慢性淋巴细胞白血病microRNA表达谱芯片筛选及验证目的：研究证实microRNA（miRNA）与慢性淋巴细胞白血病（CLL）发生发展密切相关，起类似于抑癌基因和癌基因的功能。本研究通过miRNA表达谱芯片筛选在CLL细胞及正常B细胞差异表达的miRNA，并运用实时定量PCR（RQ-PCR）进行验证，并探讨CLL中部分miRNA的表达及预后意义。方法：运用Agilent miRNA芯片对来自6例CLL患者的CD19+肿瘤细胞及30例正常人外周血的淋巴细胞进行miRNA表达差异筛选；提取156例CLL患者外周血标本总RNA，以cDNA为模板进行10倍梯度系列稀释，分别作miRNAs及内参U6RNA的标准曲线并计算扩增效率，设计stem-loop茎环逆转录引物，运用ABI7300定量PCR仪定量检测，采用SYBR Green荧光染料法，循环阈值（Ct）比较法对miRNA表达行相对定量分析，检测CLL细胞miR-15a、miR-16-1、miR-29b、miR-181a及miR-181b的表达水平；采用PCR联合DNA序列测定p53突变和免疫球蛋白重链可变区（IGHV）突变；应用间期荧光原位杂交（FISH）技术检测患者细胞遗传学异常；多色流式细胞术分别检测CLL细胞CD38和ZAP-70表达。分析目的miRNA表达及与上述预后指标（细胞遗传学异常，IGHV状态，ZAP-70，CD38等预后因素）的关系。结果：miRNA芯片筛选出一系列在CLL及正常对照差异表达的miRNAs（显着上调的包括miR-29a、miR-660、miR-20a、miR-106b、miR-142-5p、miR-101、miR-30b、miR-34a、miR-let-7f、miR-21、miR-155等，显着下调的包括miR-126、 miR-572、miR-494、miR-923、miR-638、miR-130a、miR-181a、miR-181b等）；运用RQ-PCR定量发现CLL患者miR-15a、miR-16-1、miR-29b、miR-181a、miR-181b的表达均有不同程度下降。其中，miR-15a/miR-16-1下调与染色体13q14缺失显着相关，miR-29b低表达与IGHV无突变状态显着相关，miR-181a/b低表达与IGHV无突变、CD38阳性、p53缺失和/或突变均显着相关，且与CLL患者总体生存率（OS）及无治疗生存期（TFS）缩短均显着相关。结论：CLL细胞与正常B细胞miRNA表达谱存在显着差异，这些差异表达的miRNA可能参与了CLL的发病机制并与临床预后相关，其中miR-181a/b在CLL表达显着降低且与预后密切相关，可作为后期研究目标。第二部分miR-181s在慢性淋巴细胞白血病凋亡抑制通路中的功能研究目的：部分CLL患者存在p53通路异常，对治疗反应差，并与p53下游BCL-2、TCL-1、MCL-1等原癌蛋白的上调相关。本研究旨在探讨miR-181s在慢性淋巴细胞白血病p53肿瘤抑制通路中的作用。方法：生物信息学方法候选出可能受miR-181s调控，且在CLL显着高表达的抗凋亡基因；构建双荧光素酶报告基因载体，分别构建含有靶基因BCL-2、MCL-1、XIAP3’UTR区的质粒，分别与miR-181a/b mimic、anti-miR-181a/b inhibitor、control mimic共转染耐药细胞株，进行荧光素酶实验鉴定miR-181a/b的靶分子；于CLL原代细胞，分别转染miR-181a、miR-181b及control mimics，用WesternBlot于蛋白水平检测靶基因在转染前后表达变化。40例CLL原代细胞，分别转染miR-15a、miR-16-1、miR-34a、miR-181a、miR-181b mimics后予氟达拉滨处理，培养48小时后流式细胞仪Annexin/PI双染法检测细胞凋亡率改变；PCR联合DNA序列测定p53基因突变，荧光原位杂交（FISH）技术检测40例患者p53及ATM基因缺失情况。结果：双荧光素酶报告实验显示miR-181a/b对BCL-2，MCL-1及XIAP均有显着抑制作用；western blot证实瞬时转染miR-181a/b模拟体后CLL原代细胞的BCL-2，MCL-1及XIAP蛋白表达较转染control组显着下调；40例CLL患者原代细胞，其中10例伴有p53基因缺失和/或突变，30例p53基因正常。流式凋亡检测显示在p53正常组，转染miR-34a、miR-181a、miR-181b mimics后均可显着增强CLL细胞对氟达拉滨的敏感性，而在p53缺陷组，转染各组miRNA后CLL细胞对氟达拉滨的敏感性无明显增加。结论：miR-181a/b低表达与CLL患者不良预后相关，在p53基因正常的CLL肿瘤细胞，恢复miR-181a/b的表达可通过直接负性调节BCL-2/MCL-1/XIAP原癌蛋白显着增强CLL细胞对氟达拉滨的敏感性，从而克服CLL细胞的继发性耐药。第三部分Dicer及Drosha表达在慢性淋巴细胞白血病预后意义研究目的：Dicer及Drosha是成熟miRNA形成过程中的关键剪切酶，其异常表达可致miRNA表达的广泛失调。本研究通过实时定量PCR（RQ-PCR）技术检测慢性淋巴细胞白血病患者Dicer及Drosha的表达，研究CLL中Dicer及Drosha的表达及其与其他临床指标（包括临床分期，细胞遗传学异常，IGHV突变状态、ZAP-70、CD38、p53基因异常等因素）间的关系，首次探讨了其在CLL中的预后意义。方法：提取165例CLL患者骨髓或外周血标本，8例单克隆B淋巴细胞增多（MBL）患者及10名健康对照外周血B细胞总RNA，以cDNA为模板进行10倍梯度系列稀释，分别作Dicer，Drosha及内参β-actin的标准曲线并计算扩增效率，运用运用Stratagene Mx3000P定量PCR仪进行定量检测，采用SYBR Green荧光染料法，循环阈值（Ct）比较法对Dicer、Drosha表达行相对定量分析。同时运用荧光原位杂交技术（FISH）检测CLL患者细胞遗传学异常，流式细胞仪检测CD38及ZAP70表达，多重PCR技术检测IGHV突变状态及p53基因突变状态。结果：临床分期较早（Binet A期）的患者Dicer表达水平高于临床分期较晚（BinetB+C期）的患者（mean±SD，0.017±0.010vs.0.015±0.019；p=0.001）。Dicer表达在MBL患者及正常对照B细胞中无显着差异（mean±SD，0.020±0.012vs0.019±0.09）。伴IGHV基因无突变、CD38表达阳性、ZAP-70表达阳性及p53异常（包括ATM缺失、p53缺失及突变）的患者，Dicer表达水平显着低于无以上不良预后因素者，差异显着（p值分别为p<0.0001、p=0.0304、p=0.0075和p=0.011）。Dicer表达水平在伴有单独13q14缺失的患者显着高于其他核型的患者（p=0.0009）。以IGHV突变情况作为标准对Dicer表达水平做ROC曲线分析确定其最佳分界值为0.012（AUC=0.7241，p<0.0001），Dicer低表达组总生存率显着低于Dicer高表达组（分别为132个月及未到达，p=0.0046），Dicer低表达组的无治疗生存期亦显着低于Dicer高表达组（分别为24个月及110个月，p=0.0006）。Drosha表达在以上各组间未发现明显差异，未见明显预后意义。结论：Dicer表达水平与CLL重要预后因素IGHV基因突变、ZAP-70、CD38、p53状态密切相关，在CLL的预后中具有重要价值。
王爱香[9]（2011）在《FGFR3/P53、H-ras/CD9基因突变检测在判断膀胱癌预后价值中的初步研究》文中提出目的：探讨膀胱癌两通路发生、发展过程中内在的分子变化规律,为膀胱癌早期诊断、早期预测及个体化治疗提供理论依据。方法：应用RT-PCR或RT-COLD-PCR及直接测序法检测88例膀胱癌及5例正常对照组织FGFGR3Ⅲb/P53、H-ras基因突变状况及CD9mRNA表达水平,并将其与传统临床病理学参数相联系；选取39例CD9表达水平明显降低者检测其CD9基因突变状况；根据随访结果,比较各基因状态与膀胱癌复发之间的关系；应用Logistic回归及相关性分析比较各基因状态在膀胱癌复发中的预测意义及各基因之间的相互关系。结果：1.88例膀胱癌中P53突变率随病理分级的增加而增加,低级别（13.7%）中明显低于低-高级别（60.9%）与高级别（64.3%）；P53突变率随病理分期的增加而增加,pTa（9.8%）中明显低于pT1（51.4%）与≥pT2（66.7%）；突变型P53复发率（46.7%）显着高于野生型P53复发率（22.4%）。2. FGFR3Ⅲb突变率随病理分级的增加而降低,低级别（60.8%）明显高于低-高级别（26.1%）及高级别（14.3%）; FGFR3Ⅲb突变率随病理分期的增加而降低,pTa（61.0%）明显高于≥pT2（16.7%）；野生型FGFR3Ⅲb复发率（40.8%）明显高于其突变型者复发率（17.9%）；低分级、低分期肿瘤中以FGFR3mt/P53wt基因型为主,而高分级、高分期肿瘤以FGFR3wt/P53mt基因型为主,二者之间突变率无相关关系；在所有88例膀胱癌患者中同时检测到两个异构体,一个确认为FGFR3Ⅲb常见,另一个NCBI中将其称为剪接异构体2,缺少外显子8、9及10,因此其蛋白缺乏C端一半的IgⅢ区域及跨膜区。3. H-ras中应用COLD-PCR检测到10个错义突变位点（11.4%）,26个（29.5%）沉默突变位点（c.81T>C,H27H）,与普通PCR相比使突变检测率提高了41.7%；H-ras错义突变的总体突变率为11.4%,主要分布于低分期低级别膀胱癌中,在不同病理分级与分期中其突变率无显着性差异；沉默突变型H-ras中膀胱癌复发率（46.2%）较野生型H-ra者复发率高（24.2%）; H-ras突变率与P53及FGFR3突变率之间无相关关系。4. CD9mRNA表达水平随病理分级增高而降低,低级别（0.81±0.22）显着高于低-高级别（0.49±0.17）与高级别（0.38±0.11）; CD9mRNA表达水平随病理分期增高而降低,pTa期（0.81±0.22）显着高于pT1期（0.58±0.22）与≥pT2期（0.37±0.14）,pT1期显着高于≥pT2期；部分CD9基因突变检测后发现15例存在突变,且突变位点位于CD9蛋白功能区；CD9mRNA表达水平与P53突变率之间呈明显负相关关系与FGFR3突变率之间呈明显正相关；多因素Logistic回归分析表明野生型FGFR3Ⅲb膀胱癌患者的复发危险性是突变型患者复发危险性的3.88倍（P=0.022;95%confidence interval [95%CI],0.081-0.826）,突变型P53膀胱癌患者的复发危险性是野生型患者复发危险性的4.53倍（P=0.020；95%confidence interval [95%CI],1.273～16.110）。结论：1.在低级别及低分期膀胱癌发生、发展中,以FGFR3及H-ras基因突变为主；而在高级别及高分期膀胱癌发生、发展中,以P53基因突变、CD9mRNA表达降低为主；FGFR3与P53基因突变是预测膀胱癌复发的有力指标,P53突变预示膀胱癌预后不良,FGFR3突变预示膀胱癌预后良好。2.低分级、低分期肿瘤中以FGFR3mt/P53wt基因型为主,而高分级、高分期肿瘤以FGFR3wt/P53mt基因型为主,FGFR3与P53基因突变在膀胱尿路上皮癌的发生、发展中分别代表不同的遗传学路径。3.在膀胱癌从低级别向高级别形态学转化过程中其分子遗传学特征与高级别癌相似4. FGFR3剪接异构体2是一种可溶性蛋白,在膀胱癌发生、发展中它可能对FGFR3Ⅲb的功能起重要调节作用5.CD9基因的突变可能是CD9蛋白表达降低或缺失的一种机制,但不是唯一机制。6. COLD-PCR是一种高敏感性、经济、快捷的突变富集方法。7.沉默突变可能在膀胱癌的发生中起重要作用
唐兆前[10]（2010）在《卵巢癌耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因的验证与结构和表型变化研究》文中进行了进一步梳理卵巢上皮癌在妇科恶性肿瘤中致死率最高。手术后,以铂类为基础的联合化疗是其主要的治疗方法。但随着化疗的进行,患者最终获得难以治愈的多药耐药,因而其五年生存率一直徘徊在30-50%。为了更好地认识肿瘤抑制基因在卵巢癌多药耐药中的机制,我们对卵巢癌卡铂耐药基因差异表达谱芯片进行了肿瘤抑制基因的筛选及验证,对相关的肿瘤抑制基因启动子区进行了甲基化检测以及突变基因筛选研究。并在组织标本中进行了临床意义的探讨。第二章卵巢癌卡铂耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因的验证目的:筛选卵巢癌卡铂耐药表达谱基因芯片中卡铂耐药细胞系（SKOV3-CB）较其亲本（SKOV3）细胞系差异表达下调的肿瘤抑制基因,并验证其差异表达。方法:应用分子生物信息学方法,分析卵巢癌卡铂耐药表达谱基因芯片中卵巢癌SKOV3-CB细胞系较SKOV3细胞系差异表达下调两倍以上的基因1554条,筛选肿瘤抑制基因。应用real-time PCR技术对基因芯片中差异表达基因检测验证。结果:从卵巢癌卡铂耐药表达谱基因芯片中筛选出RNASET2,VHL,DLG1,COPS2,NOL7,GGNBP2, RBL1, S100A2, PARG1,PERP,TCF3,DNAJA3,PCGF2,ING1,CYLD,RARRES3,RBBP8等17个肿瘤抑制基因,荧光定量PCR技术差异表达验证结果示:RNASET2,VHL, COPS2,NOL7, RBL1, S100A2, PARG1,PERP,TCF3,DNAJA3, ING1,CYLD,RARRES3,RBBP8等基因差异表达下调,下调倍数分别为24.47、65.24、10.81、21.30、72.94、5.95、27.13、1.57、1.32、12.93、46.8、7.57、14.9、14. 00、23.98。GGNBP2,PCGF2,DLG1等基因差异表达上调,上调倍数分别为5.76,2.19,17.1,基因芯片差异表达结果与real-time PCR所验证表达下降趋势的结果一致率为82.35%,下调两倍以上的基因一致率为64.70%。结论:利用基因芯片技术分析基因差异表达结合real-time PCR对其检测结果验证是一种有效的方法,多肿瘤抑制基因参与卵巢癌卡铂耐药的机制。第三章卵巢癌卡铂耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因甲基化检测目的:探讨卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因启动子区甲基化状态与卵巢癌卡铂耐药表达下调的关系。方法:应用分子生物信息学方法,分析肿瘤抑制基因启动子区CPG岛并设计出引物,采用甲基化特异性PCR（MS-PCR）法或亚硫酸盐测序法（bisulphite sequencing）检测SKOV3-CB、SKOV3中的耐药相关肿瘤抑制基因启动子区甲基化状态。结果:表达下调的14个基因（VHL, COPS2, NOL7,RANSET2, RBL1, S100A2, PARG1, PERP, TCF3, DNAJA3, ING1, RARRES3, RBBP8,CYLD）中,有10个基因（VHL, COPS2, NOL7, RBL1, PARG1, PERP, DNAJA3, ING1, RNASET2,CYLD）启动子区能够设计出引物,其中CYLD未检出结果,后改用亚硫酸盐测序法检测。MS-PCR检测结果显示,SKOV3-CB、SKOV3的ING1、DNAJA3、VHL甲基化引物均能够扩增出产物,未甲基化引物均不能扩增出产物;COPS2、PERP甲基化引物均不能够扩增出产物,未甲基化引物均能够扩增出产物;RNASET2,PARG1、NOL7、RBL1甲基化引物与未甲基化引物均能够扩增出产物,CYLD重亚硫酸盐测序提示在SKOV3-CB及SKOV3细胞系均为未甲基化状态。结论:卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因启动子区无超甲基化,甲基化机制不是引起卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因差异表达下调的原因。第四章卵巢癌卡铂耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因突变检测目的:筛查可能的基因突变,探讨其与卵巢卡铂耐药以及相关肿瘤抑制基因表达下调的关系。方法:以亲本细胞系（SKOV3）为对照,在卵巢癌卡铂耐药细胞系（SKOV3-CB）,应用单链构象多态性分析（SSCP）检测RNASET2,VHL, COPS2, NOL7, PARG1, RBL1, PERP, DNAJA3, ING1, CYLD等10个基因RT-PCR扩增片段的突变。结果:以SKOV3细胞系为对照,在SKOV3-CB细胞系中,SSCP检测发现DNAJA3,PERP基因聚丙烯酰胺电泳带型存在差异;RNASET2,VHL,COPS2, NOL7, PARG1, RBL1,ING1, CYLD等基因未检测到差异带型。经测序发现PERP第三外显子1093,1160,1222位点上分别存在A→G突变;1083位点及1085,1086位点,分别存在T,C,C,碱基缺失。DNAJA3第八个外显子87位点处存在A→T突变。结论:DNAJA3,PERP的基因突变以及PERP基因的碱基缺失与卵巢癌卡铂耐药相关,可能是导致其表达下调的原因,宜进一步深入研究。第五章卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因表达与临床病理的关系的研究目的:探讨卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因表达的临床意义方法:Trizol一步法提取卵巢肿瘤患者卵巢组织总RNA,应用RT-PCR检测85例卵巢组织的RNASET2、VHL、PARG1、CYLD、COPS2、PERP、DNAJA3、ING1、NOL7、RBL1基因mRNA表达,其中卵巢癌49例,卵巢良性组织21例,卵巢正常组织15例。结果: RT-PCR结果显示RNASET2、ING1、PARG 1、RBL1、NOL7基因在正常卵巢组织、卵巢良性肿瘤组织、卵巢癌组织中均有一定程度表达;VHL、PERP、COPS2、CYLD基因在正常卵巢组织、良性肿瘤中、卵巢癌组织中均有一定程度表达,但在部分卵巢癌组织中表达沉默,分别为4（4/49）、3（3/49）、2（2/49）、32（32/49）例;采用Fisher确切概率法统计分析,提示RNASET2、ING1、PARG 1、RBL1、NOL7、VHL、PERP、COPS2基因在卵巢癌中的表达沉默阳性率与在卵巢正常组织及卵巢良性肿瘤中的表达沉默阳性率比较差异无意义。CYLD、DNAJA3基因在卵巢癌中的表达沉默阳性率与在卵巢良性肿瘤组织与正常卵巢组织中的表达沉默阳性率比较差异有显着意义（P分别为0.00、0.00;0.00,0.00）。VHL等10个基因表达与卵巢癌临床病理的关系Fisher确切概率法统计分析,提示CYLD在FIGO I-II与III-IV期存在差异有意义外（P<0.05）,其余基因差异均无意义（P均>0.05）。Log Rank分析发现卵巢癌组织VHL、PERP、CYLD基因表达阳性患者与阴性患者的生存时间比较,差异均无统计学意义（P分别为0.183、0.493、0.271）。COPS2基因表达阳性患者与阴性患者的生存时间比较,差异有统计学意义（P=0.005）。COX回归模型多因素生存分析提示FIGO分期、病理分级进入模型（P分别为0.045、0.028）;淋巴结转移及COPS2、PERP、CYLD、ING1基因表达沉默等参数均未进入模型（P分别为0.907、0.476、0.754、0.728、0.304）。结论:结论CYLD、DNAJA3基因表达沉默可作为卵巢癌与卵巢良性肿瘤及正常卵巢组织鉴别诊断的一个潜在的指标,COPS2、PERP、CYLD、ING1不能作为卵巢癌独立的预后因素。
二、应用寡核苷酸芯片检测白血病患者P53和K-ras基因点突变（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、应用寡核苷酸芯片检测白血病患者P53和K-ras基因点突变（论文提纲范文）
（1）肿瘤细胞内阿霉素代谢与作用靶点研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 药理学研究路径 |
| 1.1.1 经典药理学 |
| 1.1.2 反向药理学 |
| 1.2 围绕干预药物分子的药理学研究 |
| 1.2.1 干预药物阿霉素的作用机制 |
| 1.2.2 干预药物阿霉素的代谢 |
| 1.2.3 干预药物阿霉素的耐药机制 |
| 1.3 围绕干预药物结合蛋白的研究 |
| 1.3.1 小分子药物靶点发现方法 |
| 1.3.2 生物芯片介绍 |
| 1.3.3 蛋白芯片 |
| 1.3.4 生物信息学分析 |
| 1.4 RAS的研究进展 |
| 1.4.1 RAS蛋白概述 |
| 1.4.2 RAS与肿瘤的关系 |
| 1.4.3 围绕RAS的药物开发 |
| 1.5 本论文主要研究内容 |
| 1.5.1 立题依据 |
| 1.5.2 研究基础 |
| 1.5.3 本研究的主要内容 |
| 第二章 阿霉素新代谢物的发现 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 细胞株 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 仪器及耗材 |
| 2.2.4 细胞培养 |
| 2.2.5 细胞内代谢物的提取 |
| 2.2.6 LC-MS方法 |
| 2.2.7 计算机模拟阿霉素及其代谢物与DNA间的相互作用 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 UPLC检测MCF7/ADM与 MCF7/WT细胞中阿霉素及其代谢物 |
| 2.3.2 质谱分析MCF7/ADM中的阿霉素代谢物 |
| 2.3.3 阿霉素代谢物的结构推断 |
| 2.3.4 阿霉素代谢物与DNA对接结果 |
| 2.3.5 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 蛋白芯片筛选阿霉素结合蛋白 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 蛋白芯片 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 仪器及耗材 |
| 3.2.4 生物素标记阿霉素的合成 |
| 3.2.5 生物素标记阿霉素的分离鉴定 |
| 3.2.6 蛋白芯片筛选BIO-ADM结合蛋白 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 生物素标记阿霉素的合成 |
| 3.3.2 BIO-ADM结合蛋白的芯片筛选 |
| 3.3.3 阿霉素结合蛋白功能分析 |
| 3.3.4 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 阿霉素作用靶点HRAS的筛选 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 细胞株和蛋白 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 仪器及耗材 |
| 4.2.4 阿霉素结合蛋白的生物信息学分析 |
| 4.2.5 BLI法分子间相互作用检测 |
| 4.2.6 亲和素磁珠法结合验证 |
| 4.2.7 Western blot |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 阿霉素结合蛋白分类 |
| 4.3.2 阿霉素结合蛋白聚类分析 |
| 4.3.3 阿霉素结合蛋白相互作用分析 |
| 4.3.4 亲和素磁珠法验证阿霉素与HRAS的结合 |
| 4.3.5 BLI检测阿霉素与结合蛋白相互作用 |
| 4.3.6 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 HRAS与阿霉素作用关系的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 细胞株 |
| 5.2.2 主要试剂 |
| 5.2.3 仪器及耗材 |
| 5.2.4 阿霉素干预下的HRAS-RAF结合 |
| 5.2.5 生物计算模拟 |
| 5.2.6 细胞培养与样品准备 |
| 5.2.7 Western blot |
| 5.2.8 Quantitative PCR |
| 5.2.9 细胞周期检测 |
| 5.2.10 IC50 检测 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 阿霉素增强HRAS与 RAF结合 |
| 5.3.2 基于计算模拟的阿霉素/HRAS/RAF系统的理论分析 |
| 5.3.3 J82和RT4 携带野生型HRAS基因 |
| 5.3.4 阿霉素激活MAPK通路 |
| 5.3.5 阿霉素影响细胞周期进程 |
| 5.3.6 激活HRAS提高J82和RT4 细胞药敏性 |
| 5.3.7 讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 作者在攻读博士期间发表的论文 |
（2）ERCC1基因外显子跳跃型可变剪接在肺癌顺铂耐药中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:基于肺癌顺铂药物抵抗模型研究ERCC1 基因剪接异构体的功能及其对cGAS-STING通路的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 主要试剂和仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 肺癌组织ERCC1 基因剪接异构体表达与顺铂药物抵抗的关联 |
| 3.2 体外实验验证ERCC1 外显子跳跃与顺铂药物抵抗的关联 |
| 3.3 ERCC1-FL过表达促进A549 细胞顺铂药物抵抗 |
| 3.4 ERCC1-FL敲低改善顺铂药物抵抗 |
| 3.5 ERCC1-FL与 XPA/XPF结合能力强 |
| 3.6 A549 及耐药株A549/DDP中 cGAS-STING通路活性 |
| 3.7 ERCC1-FL过表达抑制A549 细胞中cGAS-STING通路活性 |
| 3.8 ERCC1-FL敲低激活A549/DDP细胞中cGAS-STING通路活性 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:基于肺癌顺铂药物抵抗模型研究RNA结合蛋白PRPF8对ERCC1 基因可变剪接的调控作用及其对cGAS-STING通路的影响 |
| 6 前言 |
| 7 材料与方法 |
| 7.1 研究对象 |
| 7.2 主要试剂和仪器 |
| 7.3 实验方法 |
| 7.4 统计学方法 |
| 8 结果 |
| 8.1 PRPF8 调控ERCC1 基因外显子跳跃型可变剪接 |
| 8.2 敲低 PRPF8 下调 ERCC1-FL 表达 |
| 8.3 敲低PRPF8 激活cGAS-STING信号通路 |
| 8.4 敲低 PRPF8 改善 A549/DDP 细胞顺顺铂药物抵抗 |
| 8.5 PRPF8 与肺癌组织顺铂药物抵抗的关联 |
| 9 讨论 |
| 10 结论 |
| 第三部分:基于肺癌顺铂药物抵抗模型研究β-榄香烯下调PRPF8 表达对ERCC1基因可变剪接及cGAS-STING通路的影响 |
| 11 前言 |
| 12 材料与方法 |
| 12.1 研究对象 |
| 12.2 主要试剂和仪器 |
| 12.3 实验方法 |
| 12.4 统计学方法 |
| 13 结果 |
| 13.1 β-榄香烯改善A549/DDP细胞顺铂药物抵抗 |
| 13.2 β-榄香烯改变ERCC1 基因外显子3 可变剪接 |
| 13.3 β-榄香烯下调剪接因子PRPF8 改变ERCC1 基因可变剪接调控cGAS-STING通路 |
| 14 讨论 |
| 15 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 可变剪接及其调控与恶性肿瘤化疗药物抵抗的相关研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）结直肠癌患者KRAS、NRAS、BRAF基因突变与关键基因表达的相关性及circGLG1/miR-622/KRAS轴的分子作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略表 |
| 第1章 结直肠癌患者KRAS、NRAS、BRAF基因突变与关键基因表达的相关性 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料 |
| 1.2.1 实验试剂 |
| 1.2.2 实验仪器 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 研究对象 |
| 1.3.2 组织DNA提取 |
| 1.3.3 DNA浓度测定 |
| 1.3.4 KRAS、NRAS、BRAF检测位点及突变类型 |
| 1.3.5 ARMS-PCR反应 |
| 1.3.6 KRAS、NRAS、BRAF基因突变结果判定 |
| 1.3.7 免疫组织化学染色 |
| 1.3.8 免疫组化结果判定 |
| 1.3.9 统计学分析 |
| 1.4 结果 |
| 1.4.1 患者一般资料 |
| 1.4.2 KRAS突变分布及其与结直肠癌患者临床病理学特征分析 |
| 1.4.3 NRAS突变分布及其与结直肠癌患者临床病理学特征分析 |
| 1.4.4 BRAF突变情况及其与结直肠癌患者临床病理学特征分析 |
| 1.4.5 免疫组织化学染色结果 |
| 1.4.6 KRAS、NRAS、BRAF基因突变与免疫组化结果分析 |
| 1.4.7 KRAS、NRAS、BRAF基因突变与免疫组化结果的多重对应分析 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 结论 |
| 第2章 Circ GLG1/miR-622/KRAS轴在结直肠癌中的分子作用机制 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 细胞系 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 研究对象 |
| 2.3.2 细胞培养 |
| 2.3.3 RNA提取及浓度测定 |
| 2.3.4 m RNA及 circRNA qRT-PCR反应 |
| 2.3.5 MiRNA qRT-PCR反应 |
| 2.3.6 生物信息学分析方法 |
| 2.3.7 细胞功能学实验 |
| 2.3.8 Western blot实验 |
| 2.3.9 双荧光素酶报告实验 |
| 2.3.10 统计学分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 KRAS在结直肠癌组织中表达上调 |
| 2.4.2 生物信息学方法预测KRAS潜在的上游调控miRNA和circRNA分子 |
| 2.4.3 CircGLG1及miR-622 在临床样本中的表达水平 |
| 2.4.4 Circ GLG1 在结直肠癌细胞系中表达上调并促进结直肠癌细胞增殖及侵袭 |
| 2.4.5 CircGLG1 通过调控miR-622/KRAS轴促进结直肠癌细胞增殖及侵袭 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 第3章 全文总结 |
| 3.1 结论 |
| 3.2 创新点 |
| 3.3 本论文的不足 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述1 RAS突变在肿瘤中的靶向治疗进展 |
| 1 RAS基因及蛋白的结构及功能 |
| 2 RAS基因及蛋白的直接靶向治疗 |
| 3 RAS蛋白下游信号通路靶向治疗进展 |
| 4 RAS突变的其他靶向治疗策略 |
| 5 总结 |
| 参考文献 |
| 综述2 环状RNA在结直肠癌中的研究进展 |
| 1 环状RNA的起源与特点 |
| 2 环状RNA的形成机制 |
| 3 环状RNA的功能 |
| 4 环状RNA在结直肠癌中的研究 |
| 5 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 博士研究生指导组成员和课题基金资助项目 |
| 致谢 |
（4）miR-1182通过靶向hTERT抑制卵巢癌的转移和增殖（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分: miR-1182在卵巢癌组织、细胞中的表达情况及其意义 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第二部分: miR-1182在卵巢癌组织、细胞中靶基因的研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第三部分: 卵巢癌细胞中miR-1182和靶基因hTERT的相关性 |
| 1 前言 |
| 2 实验试剂 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 第四部分: miR-1182抑制卵巢癌细胞的增殖和转移 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文和其他相关成果 |
| 致谢 |
（5）蝙蝠葛碱调控Hedgehog信号通路对胰腺癌相关基因、蛋白影响的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 1. 胰腺癌的研究现状 |
| 1.1 胰腺癌流行病学特点 |
| 1.2 胰腺癌的危险因素 |
| 1.3 胰腺癌的发病机制 |
| 1.4 西医治疗胰腺癌 |
| 1.5 中医药治疗胰腺癌 |
| 2. 蝙蝠葛碱的研究现状 |
| 2.1 蝙蝠葛碱概况 |
| 2.2 蝙蝠葛碱对心脑血管的作用 |
| 2.3 蝙蝠葛碱抗肿瘤研究 |
| 3. Hedgehog信号通路在胰腺癌中的研究现状 |
| 3.1 Hh基因和Hh配体蛋白 |
| 3.2 膜受体 |
| 3.3 核转录因子Gli蛋白家族 |
| 3.4 下游靶基因 |
| 3.5 Hh-Gli信号通路的激活与胰腺癌 |
| 实验部分 |
| 第一部分 蝙蝠葛碱抗胰腺癌体外实验研究 |
| 实验一 蝙蝠葛碱抗胰腺癌BxPC-3细胞活性的研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 实验二 蝙蝠葛碱调控胰腺癌BxPC-3细胞周期及凋亡的研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 实验三 免疫细胞化学法检测Dau对胰腺癌BxPC-3细胞Hedgehog信号通路主要分子的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 实验四 Real-time PCR检测Dau对胰腺癌BxPC-3细胞Hedgehog信号通路相关基因表达影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 实验五 Western blot法检测Dau对胰腺癌BxPC-3细胞Hedgehog信号通路相关蛋白表达影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 第二部分 蝙蝠葛碱抗胰腺癌体内实验研究 |
| 实验一 蝙蝠抗胰腺癌BxPC-3移植瘤活性的研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 实验二 蝙蝠葛碱调控胰腺癌BxPC-3移植瘤细胞周期及凋亡的研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 实验三 免疫组化法检测Dau对胰腺癌BxPC-3移植瘤Hedgehog信号通路相关因子影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 实验四 Real-time PCR检测Dau对胰腺癌BxPC-3移植瘤Hedgehog信号通路相关基因表达影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 实验五 Western blot法检测Dau对胰腺癌BxPC-3移植癌Hedgehog信号通路相关蛋白表达影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 讨论 |
| 1 蝙蝠葛碱临床应用及前景 |
| 2 瘤株与模型动物的选择 |
| 3 Dau对胰腺癌BxPC-3细胞及裸鼠移植瘤的抑制作用 |
| 4 流式细胞术检测Dau对胰腺癌BxPC-3细胞及裸鼠移植瘤细胞周期及凋亡影响 |
| 5 Dau对胰腺癌BxPC-3细胞及裸鼠移植瘤Hedgehog信号通路主要分子的影响 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 个人简历 |
| 创新点 |
（6）C/EBP-β共激活的miR-31和miR-223靶向RASA1促进结直肠癌发生发展（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 研究特色和创新 |
| 1.序言 |
| 1.1 结直肠癌概述 |
| 1.1.1 结直肠癌简介 |
| 1.1.2 结直肠癌病因学分析 |
| 1.1.3 结直肠癌发病机制及其分子生物学基础 |
| 1.1.4 结直肠癌的临床分期 |
| 1.1.5 结直肠癌研究常用的动物模型 |
| 1.1.6 结直肠癌的治疗 |
| 1.1.7 展望 |
| 1.2 miRNA与癌症概述 |
| 1.2.1 miRNA与癌症 |
| 1.2.2 miRNA与结直肠癌 |
| 1.2.3 miRNA与癌症治疗 |
| 1.2.4 小结 |
| 1.3 RAS相关的信号通路与疾病 |
| 1.3.1 RAS蛋白及其相关信号调控 |
| 1.3.2 RAS相关的信号通路与癌症 |
| 1.3.3 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 2.miR-31靶向RASA1在结直肠癌发生发展过程中的功能研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验仪器以及实验试剂 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 结肠癌旁组织和肿瘤组织的收集 |
| 2.3.2 病理分析检测 |
| 2.3.3 K-RAS基因突变的检测 |
| 2.3.4 结直肠癌组织标本miRNA芯片检测 |
| 2.3.5 RNA提取和qRT-PCR检测 |
| 2.3.6 生物信息学靶点预测 |
| 2.3.7 细胞转染和细胞感染 |
| 2.3.8 靶点验证 |
| 2.3.9 免疫印迹 |
| 2.3.10 细胞增殖实验 |
| 2.3.11 裸鼠异位瘤实验 |
| 2.3.12 数据统计 |
| 2.4 实验结果及讨论 |
| 2.4.1 结肠癌旁组织和肿瘤组织病理检测 |
| 2.4.2 CRC病人样本的K-RAS基因突变检测 |
| 2.4.3 结肠癌旁组织和肿瘤组织miRNA表达谱分析 |
| 2.4.4 miRNA靶点预测 |
| 2.4.5 miRNA靶点表达相关性研究 |
| 2.4.6 miR-31对RASA1以及RASA1下游信号通路的影响 |
| 2.4.7 miR-31的生物学功能 |
| 2.4.8 miR-31通过靶向RASA1促进细胞增殖的总结示意图 |
| 2.5 小结 |
| 参考文献 |
| 3.miR-223靶向RASA1在结直肠癌发生发展过程中的功能研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料和实验方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 结肠癌旁组织和肿瘤组织的收集 |
| 3.2.3 病理分析检测和K-RAS基因突变的检测 |
| 3.2.4 RNA提取和qRT-PCR检测 |
| 3.2.5 生物信息学靶点预测 |
| 3.2.6 细胞转染 |
| 3.2.7 靶点验证 |
| 3.2.8 免疫印迹 |
| 3.2.9 细胞增殖实验 |
| 3.2.10 裸鼠异位瘤实验 |
| 3.2.11 miR-223 AMO在体内的治疗效果 |
| 3.2.12 数据统计 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 结肠癌组织样本的K-RAS基因突变检测 |
| 3.3.2 miR-223在CRC中的表达 |
| 3.3.3 miR-223靶向RASA1的靶点验证 |
| 3.3.4 miR-223调控RAS-MAPK信号通路 |
| 3.3.5 miR-223的生物学功能 |
| 3.3.6 miR-223对CRC肿瘤生长的影响 |
| 3.3.7 miR-223 AMO治疗CRC肿瘤的疗效 |
| 3.4 小结 |
| 参考文献 |
| 4.CRC中miR-31和miR-223被C/EBP-β共激活调控 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料和实验方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 结肠癌旁组织和肿瘤组织的收集 |
| 4.2.3 C/EBP-β的过表达 |
| 4.2.4 C/EBP-β的干扰 |
| 4.2.5 RNA提取和qRT-PCR检测 |
| 4.2.6 免疫印迹 |
| 4.2.7 启动子报告基因的检测 |
| 4.2.8 数据分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 C/EBP-β在CRC中与miR-31和miR-223的相关性分析 |
| 4.3.2 C/EBP-β的过表达与干扰以及对miR-31和miR-223表达的影响 |
| 4.3.3 C/EBP-β调控miR-31和miR-223的分子机制 |
| 4.3.4 C/EBP-β在CRC中调控miR-31和miR-223的总结示意图 |
| 4.4 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（7）肝硬化基础上肝癌的临床危险因素分析及肝癌与肝硬化微小RNA差异表达研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 7212例新疆地区肝硬化病例特征及肝硬化基础上肝癌的临床危险因素分析 |
| 引言 |
| 1 研究内容和方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 观察指标 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 慢乙肝相关肝硬化肝癌患者相关miRNA表达谱研究 |
| 引言 |
| 1 研究内容和方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 miRNA微阵列芯片 |
| 1.3 方法 |
| 1.4 统计分析 |
| 1.5 技术路线流程图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 MiR-1269在慢乙肝相关肝硬化肝癌组织中的差异表达研究 |
| 引言 |
| 1 研究内容和方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 1.4 技术路线流程图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（8）microRNA在慢性淋巴细胞白血病凋亡抑制通路中的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 慢性淋巴细胞白血病microRNA表达芯片筛选及验证 |
| 1. 主要材料和仪器 |
| 2. 结果 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 miR-181 在慢性淋巴细胞白血病肿瘤抑制通路中的功能研究 |
| 1. 主要材料和仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 Dicer 及 Drosha 表达在慢性淋巴细胞白血病的预后意义研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 1 英文缩写表 |
| 附录 2 攻读学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（9）FGFR3/P53、H-ras/CD9基因突变检测在判断膀胱癌预后价值中的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、FGFR3及P53的突变检测 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 主要试剂、仪器设备 |
| 1.1.2 对象 |
| 1.1.3 方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 组织总RNA提取 |
| 1.2.2 P53及FGFR3 PCR扩增结果 |
| 1.2.3 膀胱癌新病理分级的组织形态学特征 |
| 1.2.4 病例的随访结果 |
| 1.2.5 P53、FGFR3两种异构体在正常及膀胱癌组织中的测序结果 |
| 1.2.6 P53、FGFR3Ⅲb在膀胱癌及正常对照中的突变情况 |
| 1.2.7 膀胱癌中P53、FGFR3Ⅲb突变率之间的相关关系 |
| 1.2.8 膀胱癌中各分级及分期间P53、FGFR2Ⅲb突变的基因分布类型 |
| 1.2.9 膀胱癌中P53、FGFR3Ⅲb基因突变情况 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 两类癌的发展及概述 |
| 1.3.2 P53概述 |
| 1.3.3 P53与膀胱肿瘤 |
| 1.3.4 FGFR3概述 |
| 1.3.5 FGFR3与膀胱肿瘤 |
| 1.3.6 FGFR3与P53的关系 |
| 1.4 小结 |
| 二、应用COLD-PCR技术检测H-ras基因突变 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 主要试剂、仪器设备 |
| 2.1.2 对象 |
| 2.1.3 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 H-ras基因普通PCR与COLD-PCR结果 |
| 2.2.2 H-ras基因普通PCR与COLD-PCR测序结果 |
| 2.2.3 膀胱癌中H-ras基因错义突变与临床病理学参数之间的关系 |
| 2.2.4 膀胱癌中野生型与错义突变型H-ras基因复发率的比较 |
| 2.2.5 膀胱癌中H-ras基因沉默突变与临床病理学参数之间的关系 |
| 2.2.6 膀胱癌中野生型与沉默突变型H-ras基因复发率的比较 |
| 2.2.7 膀胱癌中H-ras基因错义突变率与沉默突变率的相关性比较 |
| 2.2.8 膀胱癌中H-ras基因错义突变率与FGFR3Ⅲb相关性比较 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 H-ras概述 |
| 2.3.2 COLD-PCR概述 |
| 2.3.3 H-ras与膀胱肿瘤 |
| 2.3.4 沉默突变与癌症 |
| 2.4 小结 |
| 三、CD9mRNA表达及基因突变的检测 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 主要试剂、仪器设备 |
| 3.1.2 对象 |
| 3.1.3 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 CD9基因RT-PCR扩增结果 |
| 3.2.2 膀胱癌中CD9基因RT-PCR突变检测结果 |
| 3.2.3 膀胱癌中不同病理分级及分期间CD9mRNA表达水平 |
| 3.2.4 CD9mRNA表达水平与其它临床病理学参数的比较 |
| 3.2.5 CD9mRNA表达水平在膀胱癌复发组与未复发组间的比较 |
| 3.2.6 CD9mRNA表达水平与P53、FGFR3Ⅲb及H-ras之间的相关性比较 |
| 3.2.7 膀胱癌复发的多因素非条件Logistic回归分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 CD9基因概述 |
| 3.3.2 CD9基因与膀胱肿瘤 |
| 3.3.3 CD9基因突变的研究 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 |
| 膀胱癌分子遗传学：诊断及治疗的靶点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）卵巢癌耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因的验证与结构和表型变化研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 卵巢上皮恶性肿瘤多药耐药研究现况(文献综述) |
| 1 卵巢恶性肿瘤概述 |
| 1.1 卵巢癌的发病情况简述 |
| 1.1.1 卵巢癌的发病率及生存率 |
| 1.1.2 流行病学与致病因素 |
| 1.2 卵巢上皮恶性肿瘤的主要临床表现及诊断 |
| 1.2.1 肿瘤标志物 |
| 1.2.2 影像学检查 |
| 1.2.3 细胞学检查 |
| 1.2.4 腹腔镜探查术 |
| 1.2.5 联合诊断 |
| 1.3 卵巢上皮性癌一线常规治疗现况 |
| 1.3.1 卵巢癌手术治疗的研究近况 |
| 1.3.1.1 早、中期卵巢癌的手术治疗现状 |
| 1.3.1.1.1 全面分期手术的定义与价值 |
| 1.3.1.1.2 早期卵巢癌的手术切除范围及注意事项 |
| 1.3.1.1.3 阑尾切除在卵巢上皮性癌治疗中的价值 |
| 1.3.1.1.4 大网膜切除在卵巢癌治疗中的价值 |
| 1.3.1.1.5 腹膜后淋巴结清扫在卵巢癌治疗中的价值 |
| 1.3.1.1.6 卵巢癌的保守性手术现状 |
| 1.3.1.1.6.1 保守性手术的适应症与禁忌症 |
| 1.3.1.1.6.2 保守性手术的手术范围 |
| 1.3.1.1.6.3 保守性手术的价值 |
| 1.3.2 晚期卵巢癌的手术治疗现状 |
| 1.3.2.1 肿瘤细胞减灭术的原由及范围 |
| 1.3.2.2 肿瘤细胞减灭术的注意事项 |
| 1.3.2.3 影响肿瘤细胞减灭术的因素及在晚期卵巢癌临床治疗中的价值 |
| 1.3.2.4 复发卵巢癌的手术治疗 |
| 1.3.2.4.1 手术的目的与意义 |
| 1.3.2.4.2 手术的适应症,禁忌症及范围 |
| 1.3.2.4.3 影响手术效果的预后因素 |
| 1.3.3 化疗 |
| 1.3.3.1 一线化疗药物及方案的选择 |
| 1.3.3.1.1 一线化疗的指征 |
| 1.3.3.1.2 一线化疗药物以及方案的选择 |
| 1.3.3.2 腹腔化疗 |
| 1.3.3.3 维持或巩固化疗的临床价值 |
| 1.3.3.4 新辅助化疗 |
| 1.3.3.5 影响化疗疗效的临床病理因素 |
| 1.3.3.5.1 FIGO 分期 |
| 1.3.3.5.2 病理类型 |
| 1.3.3.5.3 残余灶的大小 |
| 1.3.3.5.4 化疗的用药剂量 |
| 1.3.3.5.5 肿瘤细胞产生耐药性 |
| 1.3.3.5.6 其它因素 |
| 1.3.4 影响腹腔化疗临床应用的因素 |
| 1.3.5 影响化疗疗效的分子病理因素 |
| 1.4 生物治疗 |
| 1.4.1 免疫治疗 |
| 1.4.2 过继性免疫治疗 |
| 1.4.3 抗体 |
| 1.4.4 细胞因子 |
| 1.4.5 肿瘤疫苗 |
| 1.5 基因治疗 |
| 1.5.1 自杀基因治疗 |
| 1.5.2 癌基因与抑癌基因治疗 |
| 1.5.3 免疫基因治疗 |
| 1.5.4 耐药基因治疗 |
| 1.5.5 抗肿瘤血管生成基因治疗 |
| 2 卵巢上皮恶性肿瘤的多药耐药 |
| 2.1 卵巢上皮恶性肿瘤多药耐药的原因及机理 |
| 2.1.1 卵巢癌多药耐药的分子机理 |
| 2.1.1.1 细胞内化疗药物浓度降低 |
| 2.1.1.2 P-糖蛋白 |
| 2.1.1.3 多药耐药相关蛋白 |
| 2.1.1.4 肺耐药蛋白 |
| 2.1.1.5 乳腺耐药蛋白 |
| 2.1.2 细胞内化疗药物代谢解毒增加 |
| 2.1.3 DNA 损伤修复能力增加 |
| 2.1.4 抗凋亡能力增加 |
| 2.1.5 p53 基因突变 |
| 2.1.6 信号传导通路 |
| 2.1.7 其它机制 |
| 2.1.7.1 细胞间连接 |
| 2.1.7.2 DNA 聚合酶 |
| 2.1.7.3 ATP7B |
| 2.2 卵巢上皮恶性肿瘤多药耐药的诊断 |
| 2.2.1 卵巢癌多药耐药的诊断 |
| 2.2.1.1 MDR-1 基因 |
| 2.2.1.2 肺耐药蛋白 |
| 2.2.1.3 GST-π |
| 2.2.1.4 mtP53 |
| 2.2.1.5 c-erbB-2 基因(HER-2 基因) |
| 2.2.1.6 DNA 错配修复基因 |
| 2.2.1.7 ATP7B |
| 2.2.1.8 多药耐药基因 SNPs 的检测 |
| 2.2.1.9 细胞凋亡相关基因 |
| 2.2.1.10 多基因联合检测在诊断多药耐药的价值 |
| 2.3 卵巢上皮恶性肿瘤多药耐的治疗 |
| 2.3.1 卵巢癌多药咐药的分型及治疗原则和目的 |
| 2.3.1.1 卵巢癌多药耐药的分型 |
| 2.3.1.2 卵巢癌多药耐药的治疗原则 |
| 2.3.1.3 治疗的目标及价值 |
| 2.3.2 多药耐药的化疗 |
| 2.3.2.1 二线化疗药物及方案的选择及疗效评价 |
| 2.3.2.2 顽固型卵巢癌的治疗 |
| 2.3.2.3 耐药型和难治型卵巢癌的治疗 |
| 2.3.2.4 影响二线化疗疗效的主要因素 |
| 2.3.2.5 常规化疗药物疗效预测分子靶向化疗 |
| 2.3.2.6 自体骨髓移植加大剂量化疗在卵巢癌多药耐药治疗中的应用 |
| 2.3.3 多药耐药的逆转耐药治疗 |
| 2.3.3.1 反义核酸技术 |
| 2.3.3.2 反义 RNA 技术 |
| 2.3.3.3 RNA 干涉技术 |
| 2.3.3.4 核酶基因转移技术 |
| 2.3.3.5 细胞因子基因逆转技术 |
| 2.3.3.6 针对 P-gp 的增敏治疗 |
| 2.3.3.7 针对 MRP 的增敏治疗 |
| 2.3.3.8 针对 BCRP 的增敏剂 |
| 2.3.4 多药耐药的手术治疗 |
| 2.3.5 多药耐药的的基因治疗 |
| 2.3.5.1 药物敏感基因 |
| 2.3.5.2 肿瘤免疫基因治疗 |
| 2.3.5.3 骨髓细胞修饰 |
| 2.3.6 多药耐药的综合治疗方案筛选及临床验证 |
| 2.3.6.1 单克隆抗体 |
| 2.3.6.2 腺病毒载体 |
| 2.3.6.3 中药治疗 |
| 2.3.6.4 亚致死量陡脉冲 |
| 3 卵巢上皮癌多药耐药差异表达基因研究现况 |
| 3.1 卵巢上皮癌多药耐药差异表达基因筛选鉴定技术 |
| 3.1.1 基因芯片技术 |
| 3.1.2 DDRT-PCT |
| 3.1.3 比较基因组杂交法 |
| 3.1.4 表达序列标签 |
| 3.1.5 基因表达的系列分析 |
| 3.1.6 消减杂交基因克隆技术 |
| 3.1.7 差异显示技术衍生的方法 |
| 3.1.8 差异基因的鉴定技术 |
| 3.2 卵巢上皮癌多药耐药差异表达基因筛选鉴定现况及临床价值 |
| 3.2.1 基因芯片应用 |
| 3.3 卵巢上皮癌多药耐药差异表达基因筛选鉴定存在问题 |
| 4 卵巢上皮癌多药耐药与基因甲基化的关系 |
| 4.1 基因甲基化的定义及主要检测手段 |
| 4.1.1 基因甲基化定义 |
| 4.1.2 主要检测手段 |
| 4.1.2.1 高效液相色谱柱(HPLC)及相关方法 |
| 4.1.2.2 SssI 甲基转移酶法 |
| 4.1.2.3 免疫化学法 |
| 4.1.2.4 氯乙醛法 |
| 4.1.2.5 特异性位点的 DNA 甲基化的检测 |
| 4.1.2.5.1 甲基化敏感性限制性内切酶法 |
| 4.1.2.5.2 直接测序法 |
| 4.1.2.5.3 甲基化特异性的 PCR |
| 4.1.2.5.4 甲基化敏感性单核苷酸引物延伸 |
| 4.1.2.5.5 结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法 |
| 4.1.2.5.6 甲基化敏感性单链构象分析 |
| 4.1.2.5.7 甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳 |
| 4.1.2.5.8 荧光法 |
| 4.1.2.5.9 DNA 微阵列法 |
| 4.1.2.5.10 甲基化敏感性斑点分析 |
| 4.1.2.5.11 甲基化特异性多连接依赖性探针扩增 |
| 4.2 卵巢上皮癌多药耐药与基因甲基化的关系 |
| 4.3 卵巢上皮癌多药耐药基因甲基化检测的临床意义 |
| 4.3.1 治疗反应的标志物 |
| 4.3.2 化疗耐药和预后 |
| 5 卵巢上皮癌多药耐药与基因突变的关系 |
| 5.1 基因突变的定义及主要检测手段 |
| 5.1.1 基因突变的定义 |
| 5.1.2 基因突变主要检测手段 |
| 5.1.2.1 直接 DNA 序列分析法 |
| 5.1.2.2 单链构象多态性分析技术 |
| 5.1.2.3 温度梯度凝胶电泳分析 |
| 5.1.2.4 变性梯度凝胶电泳分析 |
| 5.1.2.5 变性高效液相色谱 |
| 5.1.2.6 异源双链分析 |
| 5.1.2.7 核酸分子杂交 |
| 5.1.2.8 核糖核酸酶切法 |
| 5.1.2.9 限制性内切酶酶谱分析 |
| 5.1.2.10 蛋白截短试验 |
| 5.1.2.11 聚合酶链反应—限制性片段长度多态性分析 |
| 5.1.2.12 等位基因特异性扩增法 |
| 5.1.2.13 等位基因特异性寡核苷酸分析法 |
| 5.1.2.14 毛细管电技术 |
| 5.2 卵巢上皮癌多药耐药与基因突变的关系 |
| 5.3 卵巢上皮癌多药耐药基因突变检测的临床意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 卵巢上皮癌卡铂耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因的验证 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 卵巢上皮癌卡铂耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因甲基化检测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 卵巢上皮癌卡铂耐药细胞与非耐药细胞筹异表达基因突变检测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因表达与临床病理的关系研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、应用寡核苷酸芯片检测白血病患者P53和K-ras基因点突变（论文参考文献）
- [1]肿瘤细胞内阿霉素代谢与作用靶点研究[D]. 王叙. 江南大学, 2021(01)
- [2]ERCC1基因外显子跳跃型可变剪接在肺癌顺铂耐药中的作用及机制研究[D]. 李刘丽. 中国医科大学, 2021(02)
- [3]结直肠癌患者KRAS、NRAS、BRAF基因突变与关键基因表达的相关性及circGLG1/miR-622/KRAS轴的分子作用机制[D]. 郝书弘. 吉林大学, 2020(08)
- [4]miR-1182通过靶向hTERT抑制卵巢癌的转移和增殖[D]. 侯小赛. 武汉大学, 2018(01)
- [5]蝙蝠葛碱调控Hedgehog信号通路对胰腺癌相关基因、蛋白影响的实验研究[D]. 张英博. 黑龙江中医药大学, 2015(01)
- [6]C/EBP-β共激活的miR-31和miR-223靶向RASA1促进结直肠癌发生发展[D]. 孙德芳. 南京大学, 2014(05)
- [7]肝硬化基础上肝癌的临床危险因素分析及肝癌与肝硬化微小RNA差异表达研究[D]. 范晓棠. 新疆医科大学, 2013(02)
- [8]microRNA在慢性淋巴细胞白血病凋亡抑制通路中的作用研究[D]. 朱丹霞. 南京医科大学, 2012(01)
- [9]FGFR3/P53、H-ras/CD9基因突变检测在判断膀胱癌预后价值中的初步研究[D]. 王爱香. 天津医科大学, 2011(01)
- [10]卵巢癌耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因的验证与结构和表型变化研究[D]. 唐兆前. 广西医科大学, 2010(08)