一、人源性肝细胞生长因子高效真核表达载体的构建（论文文献综述）
张欣[1]（2020）在《猪FGL1单克隆抗体的制备及其双抗夹心ELISA检测方法的建立》文中研究表明纤维蛋白原样蛋白1（Fibrinogen-like protein 1,FGL1）,又称为肝细胞源性纤维蛋白原相关蛋白1（Hepatocyte-derived fibrinogen-related protein 1,HFREP1）或促肝细胞增殖因子（hepassocin）,是一种具有肝细胞丝裂原活性的肝脏因子,最初作为一种在肝癌细胞中过表达的转录产物被发现,该蛋白与血管生成素、血管生成素相关蛋白、纤维蛋白原样蛋白2等都属于纤维蛋白原超家族。在正常生理条件下,FGL1主要由肝细胞分泌,参与肝细胞的有丝分裂和代谢功能。与正常肝细胞相比,在肝癌细胞中,FGL1的m RNA和蛋白表达水平均下降或缺失。来源于人和小鼠的研究表明,宿主细胞共抑制分子表达上调是持续性感染、肿瘤和自身免疫病形成的重要原因之一。淋巴细胞活化基因3（lymphocyte activation gene 3,LAG3）,是一类主要表达于活化的T细、胞表面的共抑制分子。研究表明,FGL1是LAG3的主要抑制性配体,FGL1与LAG3互作在体内外均可抑制T细胞的抗肿瘤效应,沉默FGL1基因在小鼠模型中可以促进T细胞的抗肿瘤效应,从而揭示了一种新的免疫逃避机制。为了研究猪纤维蛋白原样蛋白1在免疫抑制性猪病发病机制中的作用,并为相关研究积累材料,本研究提取猪肝脏组织总RNA,采用RT-PCR方法扩增猪FGL1基因,原核表达获得纯化的猪FGL1重组蛋白,分别免疫小鼠和家兔,制备抗猪FGL1的鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体,在对抗体进行鉴定的基础上,利用制备的抗体建立了检测猪FGL1的双抗夹心ELISA检测方法,以期为猪FGL1在猪群免疫抑制性疾病中的相关研究积累资料并提供基础。本研究的内容和结果如下:（1）提取猪新鲜肝脏组织总RNA,采用RT-PCR方法成功扩增到删除信号肽序列的猪FGL1基因片段,将目的基因插入p QE-30载体构建了原核表达载体（p QE-30-FGL1）,IPTG诱导后获得了原核表达的猪FGL1,对获得的目的蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,进行大量表达,最终获得了纯化猪FGL1蛋白;（2）用纯化的猪FGL1免疫Balb/C小鼠,经细胞融合、亚克隆等,获得了2株能够稳定分泌猪FGL1抗体的杂交瘤细胞,分别命名为2D7和4G7;抗体亚型鉴定显示两株细胞分泌的抗体均为Ig G1,通过Western blot和IFA鉴定结果显示,4G7既可用于猪FGL1的Western blot检测,也可用于该蛋白的IFA检测;采用纯化的目的蛋白免疫家兔,获得了效价较高的抗猪FGL1多克隆抗体;（3）利用获得的猪FGL1鼠单克隆抗体与兔多克隆抗体,以单克隆抗体作为捕获抗体,兔多克隆抗体作为检测抗体,在对一系列条件进行优化的基础上,建立了检测猪FGL1的双抗夹心ELISA方法。结果显示,以10μg/m L鼠抗猪FGL1单克隆抗体为捕获抗体,100μL/孔4℃包被过夜,加入待测样品,37℃孵育1 h,然后加入1:1,000稀释的兔抗猪FGL1多克隆抗体,37℃孵育1 h,再加入1:3,000稀释的HRP标记的马抗兔Ig G,37℃孵育1 h,最后加入TMB底物显色液,室温避光显色20 min,酶标仪检测OD450nm。综上所述,本研究成功表达了猪FGL1蛋白,并制备抗猪FGL1的特异性单克隆抗体及兔多克隆抗体,利用制备的抗体建立了猪FGL1双抗夹心ELISA的检测方法,以期为后续探究猪FGL1在猪群免疫抑制性疾病中的作用研究提供技术支持。
赵良中[2]（2020）在《靶向PHD2胞内抗体对对乙酰氨基酚诱导肝损伤的保护作用及机制研究》文中研究表明由病毒感染、肝毒素、酒精摄入或药物引起的肝损伤已成为世界范围内严重的人类健康问题,其发病率不断上升。目前,除了肝移植治疗急性肝衰竭和终末期慢性肝损伤外,没有有效的治疗方法。然而,由于供体组织的来源有限且成本高昂,严重限制了通过肝移植进行的治疗。因此,迫切需要探索新的有效的预防和治疗策略。过量服用对乙酰氨基酚（4’羟基乙酰苯胺,扑热息痛,APAP）已成为药物引起的急性肝衰竭的最常见原因。APAP诱导急性肝损伤（APAP-induced liver injury,AILI）的研究显示,血管生成和氧化还原稳态在肝保护和修复中起着重要作用。低氧诱导因子-1（HIF-1）是一种转录因子,在调节血管生成、氧化还原稳态和能量平衡相关基因的表达中发挥关键的调节作用。在包括急性肝损伤在内的急性组织损伤过程中,HIF-1作为急性低氧应激最敏感的因子,它的上调是促进血管生成和组织损伤修复的关键。HIF-α上的脯氨酸残基可以被细胞内的脯氨酰羟化酶（PHDs）羟化,羟化后的HIF-α通过泛素-蛋白酶体途径降解,因此,PHD是调节细胞中HIF-α稳定性的限速酶。其中PHD2是催化HIF-1α脯氨酸羟化的关键限速酶。研究表明,抑制PHD2的活性导致HIF-1α的稳定,从而增强了HIF-1下游大量靶基因的诱导,这些基因调节广泛的低氧反应,如血管生成,能量补偿,氧化还原,pH稳态以及许多其他过程,最终改善急慢性低氧时组织损伤。因此,PHD2已成为促进血管生成和组织损伤修复的一个潜在靶点。鉴于目前PHDs抑制剂缺乏特异性和靶向性,会产生大量的毒副作用,因此如何获得高效特异抑制PHD2活性的抑制剂备受关注。由于抗体具有高特异性和高亲和性作用特点,近年来备受关注。随着抗体工程技术的发展,派生出来的胞内抗体技术,通过对抗体分子的适当修饰,实现细胞内重要靶分子的表型敲除。为此,本研究利用胞内抗体技术制备了一种在细胞内靶向失活PHD2的胞内单链抗体,并对其生物学活性和在APAP肝损伤中的作用进行研究。课题组前期研究中纯化了人源PHD2蛋白,以此蛋白为抗原,通过噬菌体库筛选的方法获得了抗PHD2单链抗体（scFv）,并且通过可溶性表达、纯化及ELISA分析,发现此scFv能够特异性结合重组PHD2。本研究为了靶向失活细胞内的PHD2,以抗PHD2的scFv基因为模板,用内质网（ER）滞留信号序列修饰,从而制备了内质网滞留型的抗PHD2胞内抗体（ER-INP）,检测此胞内抗体是否会在细胞中成功表达,并对其活性进行表征,然后探讨了ER-INP在小鼠APAP诱导的急性肝损伤中的作用和可能的机制。取得如下结果:一、成功构建了内质网滞留型的抗PHD2胞内抗体（ER-INP）。以抗PHD2人源单链抗体scFv基因为模板,通过PCR引入滞留于内质网的细胞内定位信号和E-tag序列,成功制备内质网滞留型抗PHD2胞内抗体基因ER-INP,并将其克隆入真核表达载体中构建重组人ER-INP真核表达载体pER-INP。将pER-INP转染进细胞中,RT-PCR、免疫荧光和Western blot实验分析结果表明,引入内质网定位信号和E-tag序列的抗PHD2胞内抗体基因能够在细胞中有效表达和实现目标蛋白的内质网定位。二、抗PHD2胞内抗体特异性结合细胞内PHD2并抑制其脯氨酰羟化酶活性。将pER-INP转染进细胞中,免疫共沉淀实验、Western blot和免疫荧光实验分析抗PHD2胞内抗体的作用效能。结果表明,细胞内表达的抗PHD2胞内抗体ER-INP能够识别并结合细胞内的PHD2蛋白,抑制PHD2脯氨酰羟化酶活性,即抑制其羟化HIF-1α的Pro564和Pro402的活性,明显上调HIF-1α的蛋白水平。三、抗PHD2胞内抗体在体外和体内均显示出明显的促血管生成活性。为了检测ER-INP在体外和体内是否具有促血管生成活性,分别采用划痕实验检测人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的迁移能力,3D培养模型来检测HUVEC的成管能力,利用鸡胚绒毛尿囊膜（CAMs）模型来检测其体内血管生成情况。通过实时定量PCR、Western blot和ELISA等实验方法分析HIF-1下游促血管生成相关靶基因的表达。实验结果表明ER-INP的表达显着促进了HUVEC的迁移和管状形成能力,并增强了鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成能力。此外,实时定量PCR检测结果表明ER-INP促进了HIF-1下游促血管生成相关靶基因VEGF、ANGPTL-2、MMP-2和MMP-13等的表达,而且Western blot和ELISA结果表明ER-INP显着提高VEGF、MMP-2和MMP-13等促血管生成因子的蛋白水平。四、抗PHD2胞内抗体保护APAP诱导的急性肝损伤。将带有GFP的对照质粒尾静脉注射入小鼠体内,发现从注射后的第1天到第3天可以检测到该蛋白的表达,第3天在肝脏中的表达达到最高水平,由此推测该表达载体携带的ER-INP基因尾静脉注射入小鼠体内后可能主要在肝脏中表达,并在第3天达到最高水平;和对照组相比,正常小鼠尾静脉注射表达ER-INP的质粒不影响肝脏的组织形态学以及小鼠血清谷丙转氨酶（alanine transaminase,ALT）和谷草转氨酶（aspartate transaminase,AST）水平,总之ER-INP不损害小鼠肝脏,并且ER-INP可以在小鼠肝脏中成功表达;小鼠腹腔注射250 mg/kg剂量的APAP溶液,于注射后24 h,48 h和72 h处死小鼠,发现24 h达到肝损伤的高峰期,表现为ALT和AST水平显着升高以及肝脏小叶中央区出现明显的坏死,而尾静脉注射表达靶向PHD2胞内抗体ER-INP质粒预处理48 h后再给予APAP,可显着抑制APAP引起的血清ALT和AST的升高以及肝小叶中央区的坏死也明显改善。五、ER-INP对APAP诱导急性肝损伤的保护作用机制。一方面,ER-INP预处理的APAP肝损伤小鼠肝组织出现了明显促血管生成效应,表现为免疫组化结果显示肝脏中血管新生标志分子CD31表达明显上调,同时具有促血管生成作用的HIF-1α水平显着上调,Western blot和ELISA结果显示HIF-1下游与血管生成密切相关的VEGF和MMP-2的蛋白表达水平明显上调,实时定量PCR结果显示HIF-1下游与血管生成密切相关的VEGF、ANGPTL-2和MMP-2的基因转录水平明显上调;另一方面,ER-INP预处理有利于维持APAP肝损伤小鼠肝组织的氧化还原稳态,表现为ER-INP预处理显着抑制肝脏氧化应激标志分子丙二醛（malondialdehyde,MDA）的水平,Western blot结果显示ER-INP预处理显着抑制了内质网应激标志分子葡萄糖调节蛋白78（Glucose regulated protein 78,GRP78）水平的升高,然而显着增强抗氧化酶即过氧化物氧化还原酶4（peroxiredoxin 4,PRDX4）的活性和显着抑制抗氧化分子即谷胱甘肽（L-glutathione,GSH）的消耗。总之,ER-INP可能通过促进血管生成和维持氧化还原稳态来保护APAP诱导的急性肝损伤。综上所述,成功制备在细胞内特异性结合PHD2的胞内抗体ER-INP,靶向PHD2的胞内抗体能够在体内外抑制PHD2活性,提高HIF-1α的稳定性,促进HIF-1下游靶基因的转录激活,可能通过促进血管生成和维持氧化还原稳态来保护APAP诱导的肝损伤,这为组织损伤和局部缺血性疾病的临床治疗开辟了新途径,为新药研发提供了新思路和实验依据。
王静[3]（2019）在《新型免疫毒素降低非特异性毒性的设计与研究》文中提出免疫毒素是一种由靶向部分连接毒素部分组成的融合蛋白。其中,靶向部分通常是抗体、抗体片段或生长因子等具有导向功能的生物活性分子,能够通过特异性识别细胞表面的受体将毒素部分靶向传递至病变细胞。毒素部分普遍具有较强的细胞毒性,通过受体介导进入细胞后,可以发挥杀灭病变细胞的功能。根据来源不同划分,毒素部分可以来自微生物、植物、昆虫和动物等。绿脓杆菌外毒素和白喉毒素是两种获得广泛研究的细菌毒素,目前已有相应的药品Lumoxiti和Ontak被批准上市,对许多不同类型的血液瘤具有明显的治疗效果。然而,临床上广泛应用免疫毒素还存在许多待解决的问题,例如,免疫毒素存在免疫原性、非特异性毒性和低渗透性等。免疫毒素的非特异性毒性主要来源于两部分,一部分是由于毒素分子与内皮细胞的非特异性结合,对内皮细胞的损伤导致血管渗漏综合征的发生;另一部分则是靶向部分与表达肿瘤相关抗原的正常细胞非特异性结合,对正常组织的损伤引发对机体的毒副作用。由于毒素本身的异源性以及肿瘤特异性抗原极少存在,所以免疫毒素的非特异性毒性问题较难解决,于是我们设计新型的免疫毒素,分别对传统免疫毒素的毒素部分和靶向部分进行修饰与改造,从而降低免疫毒素的非特异性毒性。本课题针对靶向表皮生长因子受体2的免疫毒素scFvPE38进行改造,首次设计并制备无毒性两段式免疫毒素。断裂型内含肽是一种能够自我剪切并将两侧蛋白（外显肽）以天然共价键进行连接的自处理功能序列。我们借助断裂型内含肽将免疫毒素分成两段,两段分别与断裂型内含肽融合,在到达靶细胞后,通过控制反应条件,发生内含肽介导的蛋白反式剪接反应,使两段式免疫毒素重新连接形成完整免疫毒素。实验表明,两段式免疫毒素均不具有毒素活性,即使在高浓度条件下,也不会产生细胞毒性。两段式免疫毒素可以在还原性条件下发生内含肽介导的反式蛋白剪接反应,生成完整免疫毒素,并且恢复免疫毒素的细胞毒性,通过受体介导的内吞入胞后,引起靶细胞的凋亡。本课题同时设计新型的抗原屏蔽型免疫毒素M-Fab-PE24,通过连接抗原屏蔽肽至免疫毒素的靶向部分,降低免疫毒素对表达肿瘤相关抗原的正常组织产生的非特异性毒性。在免疫毒素Fab部分的轻链N端通过酶解型连接肽连接抗原屏蔽肽,屏蔽抗体的抗原结合位点,在循环过程中降低免疫毒素对正常组织的结合。在达到肿瘤部位后,接受肿瘤微环境特异性蛋白酶处理,切除屏蔽肽,释放Fab的抗原结合部位,恢复其抗原结合亲和力,选择性对肿瘤细胞发挥杀伤作用。本课题分别从体外和体内验证了抗原屏蔽型免疫毒素的抗原亲和力和生物活性。体外研究结果显示,抗原屏蔽型免疫毒素的抗原结合能力和细胞毒性明显下降,但在接受特定蛋白酶活化后,能够恢复原有的结合亲和力和细胞毒性;使用小鼠异种移植瘤模型进行药效研究显示,抗原屏蔽型免疫毒素M-Fab-PE24具有明显的抑瘤效果,并且与未屏蔽型免疫毒素Fab-PE24相比,对肝脏的损伤较轻,显示出更好的安全性。本课题设计的两种新型免疫毒素分别从1)降低细胞毒性与肿瘤靶位定点恢复以及2)抑制抗原结合能力与肿瘤靶位定点恢复两个方面来研究降低免疫毒素非特异性毒性的通用方法,使其可以用于不同抗体和毒素的任意组合,而不用局限于毒素的来源以及抗原的特异性表达。对以上两种新型免疫毒素的研究,为降低免疫毒素非特异毒性建立了一定的基础,有助于推动免疫毒素广泛应用于临床。本论文首创的新型低非特异性毒性免疫毒素的设计具有较高的开发应用价值。
周兵[4]（2018）在《快速抗体人源化平台的建立及乙型肝炎病毒人源化抗体的成药性研究》文中研究说明感染性疾病是指由细菌、病毒等致病微生物侵袭人体,进而引起机体所发生的一系列具有感染性临床症状的疾病,严重威胁着人类的生命及健康。近年来,抗感染的抗体药物研究发展十分迅速,目前,已经有25种抗感染的抗体药物正在进行临床研究。HBV感染可以导致慢性乙型肝炎、肝硬化和肝细胞癌等疾病,全世界每年约有88万人死于急性或慢性HBV感染。尽管现有预防性疫苗已显着减少了新发HBV感染,全球仍有3亿的慢性HBV感人者需要得到有效的治疗,以预防该病的并发症。当前FDA批准用于慢乙肝治疗的药物有两大类,干扰素和核苷类似物,分别通过调节宿主免疫和抑制病毒的复制从而起到抗病毒的效果。现有的药物虽有着很强的安全性和抗病毒活性,但治疗效果十分有限。这些药物HBsAg的阴转率都不足5%,无法实现临床治愈。因此,需要开发更有效的新药物,以改善HBV相关疾病的临床管理。尽管全人源抗体技术的发展极大增加了全人源抗体成为临床候选株的数量,但FDA批准的大部分治疗性抗体药物仍然以人源化抗体为主。抗体人源化技术主要包括CDR移植（常用噬菌体展示等抗体库技术）、表面重塑、链替换以及计算机辅助设计等,但是现有技术存在改造后人源化抗体亲和力降低、具有较大的免疫原性、工作量大、筛选不可视以及与转换成完整抗体活性不一致等问题,这些都延长了抗体人源化的时间,因此发展新的快速人源化方法势在必行。本研究旨在建立快速点突变抗体人源化新方法,实现快速获得人源化程度高、保持亲本鼠抗活性的人源化抗体。并利用该方法对HBV鼠抗E6F6进行人源化改造,获得有临床治疗潜力的人源化抗体。本研究分为两部分,第一部分是快速点突变抗体人源化平台的建立。通过对CDR划分方法、人源化模板选择方法的比较和分析,确定结合采用Kabat和Contact定义CDR区域,并选择同源性最高的人胚系基因作为模板。通过对现有大量上市或者临床试验中抗体序列和结构的分析以及一些前期人源化改造工作经验总结,抗体序列中每个氨基酸的位置和功能是有一定的规律可寻的。总结规律包括:（1）FR中有些氨基酸存在于CDR接触面上,直接或间接参与抗体与抗原的结合或者对维持抗体CDR构象具有重要的作用,突变时通常选择保留;（2）有些FR残基存在于VH-VK的交界面上,突变时通常选择保留;（3）还有些FR残基属于抗体序列中内部包埋的氨基酸,突变时选择性保留;（4）最后剩下的FR残基就是对抗体活性影响很小的氨基酸,可以直接突变。不管是属于哪一种功能的FR残基,它的位置是相对固定的。12G6是本实验室筛选获得的一株能高效中和乙型流感病毒（Flu-B）的具有广谱性的鼠源单克隆抗体,我们首先分别对它的轻重链可变区进行Kabat编号,然后按照Kabat和Contact定义的CDR区域划分CDR。再利用IMGT网站搜索比对,找出同源性最高的2-3条人胚系基因,进行序列比对。最后根据上述总结的氨基酸规律,对和胚系基因FR中存在的差异氨基酸进行选择性突变,共设计4条重链和4条轻链,分别将其两两互搭进行真核表达,以亲本鼠抗为对照,检测16株人源化抗体的表达情况、结合活性、中和活性等生物学功能。最终,针对12G6,我们挑选出7株优势的人源化抗体。发现在2个不同亚系的乙型流感病毒HA蛋白的结合实验、中和实验和HI实验中,7株人源化抗体保留了 12G6的生物学活性。5B11和7G5是本实验室筛选获得的两株能同时高效中和A/B型呼吸道合胞病毒（RSV）的鼠源单克隆抗体。根据12G6的实验结果,分别对5B11和7G5各设计一种人源化方案,获得N-5B11和N-7G5两株人源化抗体。两株人源化抗体均显示出良好的反应活性和中和活性,且活性与亲本相当。至此我们针对12G6、5B11和7G5三株鼠抗的人源化改造初步完成,验证了改造方案的可行性,完成快速点突变抗体人源化平台的构建。本研究第二部分是利用第一部分建立的新的人源化平台对乙型肝炎病毒鼠抗E6F6人源化,并对获得的人源化抗体进行性质验证及成药性评估。E6F6是本实验室筛选获得的一株针对HBV外膜蛋白（HBsAg）上一个特定表位的鼠源单克隆抗体;它能够有效并持久地清除转基因小鼠体内的HBV和HBsAg,具有发展成为HBV治疗性抗体的潜力。在前期研究中,我们利用噬菌体展示技术对其进行了人源化及亲和力成熟,成功获得了人源化程度为89%,体内外活性与鼠抗相当的人源化抗体162。本研究利用BIAcoreT200对162进行了亲和力测定,其亲和力为4.18×10-10M。通过对162 Fab的晶体培养及结构解析,获得了 162晶体三维结构。将162与HBsAg表位短肽进行对接,得到抗原-抗体相互作用的重要氨基酸。为了验证第一部分所建立的人源化平台的可行性及提高抗体的人源化程度,本研究第二部分利用第一部分中建立的快速点突变抗体人源化平台,结合162氨基酸序列、162晶体结构、与HBsAg短肽对接数据及Discovery Studio模拟平台,对E6F6进行人源化改造,获得3株人源化抗体,huAb1、huAb2和huAb3。在CHO-S细胞中瞬时表达和纯化,并从抗体的均一性、与抗原反应性、中和活性、体内病毒清除效果、成药性评估等方面进行综合分析。huAb1、huAb2和huAb3的人源化程度高达97%,体外结合及中和活性与162相当,但是在HBV转基因小鼠体内持续清除HBsAg的能力有所下降。C57b1/6小鼠体内发现人源化程度为97%的huAb1清除速率较快。说明人源化程度高的抗体在异源小鼠动物模型中免疫原性增加,被较快的清除,但是人源化程度高的抗体在人体内可能具有更高的优势。同时,huAb1、huAb2和huAb3的反嵌合抗体的体外结合、中和以及体内活性均与鼠抗E6F6相当。162、huAb1、huAb2和huAb3的溶解度高达140mg/mL以上,粘度小于14,等电点在8-9之间,达到了抗体药物的标准,TM值大于80℃,具有较好的热稳定性。在人体内环境和药物储存环境的模拟条件下同样具有较好的稳定性。食蟹猴体内药代动力学实验评估162、huAb1、huAb2和huAb3的半衰期符合标准,均能持续有效的清除食蟹猴体内的HBsAg,其中意外发现huAb3的半衰期较长,分析与其表面电荷分布有关,表面电荷降低可能会延缓抗体的清除。药代动力学参数及食蟹猴血常规和血生化结果提示,162、huAb1、huAb2和huAb3具有良好的药物有效性和安全性。进一步研究发现162、huAb1、huAb2和huAb3与HBsAg形成免疫复合物较小,有利于细胞的高效吞噬。通过对人IgG1Fc区域的突变,获得了体外活性与162相当,吞噬效应显着提高的162-IgG1-KD突变体。发现CH的替换可能导致Fc不依赖与FcγR作用途径,而是通过改变Fab与靶标的结合方式,形成不同大小的免疫复合物,影响吞噬效应。同时首次发现了抗体VH和CH1之间的linker对吞噬的影响,在162重链可变区末端引入柔性linker（Gly4Ser）3可能会增大Fab双臂间的距离,降低抗体的吞噬功能。综上所述,本研究建立了快速点突变抗体人源化方法并利用3株不同靶点的鼠抗完成了全面的验证,大大缩短了改造的时间,为鼠源抗体人源化的改造奠定了坚实的基础,丰富了人源化技术手段,为抗体人源化改造提供了新的选择。获得了具有专利保护的用于HBV感染相关疾病治疗的人源化抗体分子162、huAb1、huAb2和huAb3,并完成了较为全面的体内外活性评估及成药性分析,完善了抗体人源化改造平台,为相应疾病治疗性人源化抗体的研发奠定了坚实的基础,有望成为治疗慢乙肝的新药物。
肖江强[5]（2013）在《构建人源性可调控稳定表达细胞系及大规模肝向诱导分化的实验研究》文中研究指明第一部分:构建Tet-on调控稳定表达HGF、FGF4的人类MSCs细胞株目的:通过慢病毒转染UE7T-13细胞,构建Tet-on基因开关调控稳定表达HGF、FGF4的人类骨髓间充质干细胞株。方法:全基因合成HGF和FGF4序列,通过酶切、重组分别构建包含目的基因HGF、FGF4的两个慢病毒载体plenti6.3/TO-HGF和plenti6.3/TO-FGF4,包装并计算其滴度。以UE7T-13细胞最适MOI值稀释慢病毒Lenti3.3/TR,并转染UE7T-13细胞,加入加入抗生素Zeocin筛选,获得带有Tet-on基因调控开关的UE7T-13-TR细胞株。采用已构建好的慢病毒plenti6.3/TO-HGF和plenti6.3/TO-FGF4分别转染UE7T-13-TR细胞并经过抗生素Blasticidin筛选,构建Tet-on调控稳定表达HGF的UE7T-13-TR-HGF细胞株和Tet-on调控稳定表达FGF4的UE7T-13-TR-FGF4细胞株。通过QPCR、Western Blot及Elisa在基因、蛋白及蛋白分泌水平检测目的基因HGF、FGF4的表达情况。结果:成功构建UE7T-13-TR-HGF和UE7T-13-TR-FGF4细胞株。经QPCR检测,当Tet存在时,HGF基因在UE7T-13-TR-HGF中的表达为无Tet时的78倍;FGF4基因则超过2万倍,且1μg/ml的Tet为较佳浓度。WesternBlot及Elisa结果在蛋白表达水平及蛋白分泌水平验证了以上结果,证明已合成的HGF及FGF4能成功分泌到细胞外。结论:通过慢病毒转染UE7T-13细胞,我们成功构建出Tet可调控稳定表达HGF、FGF4细胞株（UE7T-13-TR-HGF和UE7T-13-TR-FGF4细胞株）,为进一步的研究奠定了良好的实验基础。第二部分:可调控稳定表达HGF、FGF4人干细胞肝向自身诱导分化能力的验证目的:验证由第一部分构建成功UE7T-13-TR-HGF和UE7T-13-TR-FGF4细胞的肝向自身诱导分化能力。方法:通过细胞表面标记验证UE7T-13-TR-HGF和UE7T-13-TR-FGF4细胞的MSCs细胞特性;通过MTT实验鉴定以上两种细胞的增殖能力;肝向诱导分化实验分为4组:A 组:UE7T-13-TR-HGF/UE7T-13-TR-FGF4 细胞外源性加入诱导因子 35 ng/ml HGF 及 35 ng/ml FGF-4;B 组:UE7T-13-TR-HGF 加入 1μg/ml Tet;C 组:UE7T-13-TR-FGF4 加入 1μg/ml Tet;D 组:UE7T-13-TR-HGF 细胞与UE7T-13-TR-FGF4细胞共培养（按共培养比例不同,分为三个亚组:2:1;1:1;1:2）加入1μg/mlTet。通过细胞形态学、RT-PCR、免疫荧光、流式及肝细胞相关功能检测鉴定诱导分化后的细胞。结果:约90%的细胞为CD90+CD44+CD45-,表明转染后细胞仍保留间充质干细胞特有的表面标记,且纯度较高。MTT实验证明UE7T-13-TR-HGF细胞及UE7T-13-TR-FGF4细胞保留了 UE7T-13细胞原有的增殖能力;但在Tet存在条件下其增殖能力受到抑制。诱导分化实验证实UE7T-13-TR-HGF细胞及UE7T-13-TR-FGF4细胞保留了 MSCs细胞的肝向诱导分化能力,且能在1μg/ml Tet的调控下自身表达、分泌高浓度HGF、FGF4,并诱导自身分化为肝样细胞。结论:由第一步构建的两种细胞能在Tet存在条件下,高效诱导自身分化为有功能的肝样细胞,且UE7T-13-TR-HGF细胞与UE7T-13-TR-FGF4细胞以1:2比例混合具有更高的自身诱导分化能力,为最佳搭配方案,并有望应用于肝脏组织工程及再生医学。。第三部分:可调控稳定表达HGF、FGF4人干细胞大规模增殖及自身诱导分化能力验证目的:验证由第一部分构建成功的可调控稳定表达HGF、FGF4人干细胞的大规模增殖及其自身诱导分化能力。方法:通过微载体Cytodex 3培养方式将UE7T-13-TR-HGF和UE7T-13-TR-FGF4细胞以1:2比例进行悬浮培养培养,显微镜下动态观察细胞生长情况并计数,验证细胞在微载体上增殖情况并得到最佳增殖时间。采用第一步按最佳增殖时间大规模增殖,第二步加入Tet进行自身诱导分化的方法进行细胞肝向诱导分化,光镜、电镜观察细胞形态变化,免疫荧光及功能鉴定分化后的细胞。结果:细胞密度于培养第7天达到高峰,为1.76±0.12×109/L。干细胞于诱导分化第8天可见细胞形态改变,且经免疫荧光及肝细胞相关功能鉴定为肝样细胞。结论:通过Cytodex 3微载体培养,我们发现UE7T-13-TR-HGF细胞与UE7T-13-TR-FGF4细胞能增殖到肝脏组织工程及再生医学所需的细胞量,且成功分化为有肝细胞功能的肝样细胞,有望应用于肝脏组织工程及再生医学。由此,我们确立了第一步增殖、第二步分化,由干细胞获得大规模有功能肝样细胞的有效方案。
常菁[6]（2009）在《HPPCn在肝癌发生、发展过程中的功能及作用机制研究》文中研究表明原发性肝癌发病率位于肿瘤发病率第五位,是严重危害人类健康的重大疾病。近期研究表明,原发性肝癌发病率呈上升趋势。在我国每年死于肝癌约11万人。肝癌手术切除率低,对化疗药物不敏感,缺乏有效的系统治疗策略,且在治疗过程中容易产生耐药和复发,导致治疗失败。因此,深入研究肝癌发病机制并发展新的治疗策略是关系人类健康的重大科学问题。HPPCn（Hepatopoietin cn）是我们从新生小牛肝脏中分离到的一个新的肝细胞刺激因子,生物活性分析表明,重组人HPPCn蛋白能够特异的促进原代培养大鼠肝细胞、正常肝细胞系L02和肝癌细胞系SMMC7721/HepG2的DNA合成和细胞分裂。动物实验显示重组HPPCn蛋白能够促进70%肝切除小鼠的肝脏再生,对CCl4诱导的急性肝损伤和肝纤维化有明显的保护作用。因为其在肿瘤细胞中呈现出高表达,那么HPPCn和肝癌的发生、发展会有着什么样的关系呢?我们研究HPPCn及其信号途径在肝癌发生发展中的作用。为此做了如下的研究工作。首先,构建和制备了携带小鼠Alb启动子和增强子序列的HPPCn的肝特异性真核表达载体,并在体外水平对载体的肝特异性表达进行验证,结果表明HPPCn在HEK293,L02,HepG2,SMMC7721细胞中的表达量分别为0.94%,35.48%,58.94%,62.51%。为研究转基因动物体内肝脏过表达HPPCn对肝癌发生的影响奠定了基础。同时我们还构建了HPPCn有效干涉载体pGPU6/GFP/Neo-shRNA,在蛋白水平的干涉率达到76.4% ,并通过G418筛选获得了稳定干涉HPPCn的HepG2/si-HPPCn的细胞,为研究肿瘤细胞中HPPCn的功能奠定了基础。其次,我们研究了HPPCn对肝癌细胞及肝干细胞特性的影响。实验表明,HPPCn能够保护TSA诱导的肝癌细胞的凋亡,促进肿瘤细胞的增殖。上调肝癌细胞中MCl-1的表达,并且确定这种上调作用是通过PI3K/AKT,JAK-STAT3两条信号通路来实现的。我们通过干涉肿瘤细胞中HPPCn的表达,证明HPPCn表达的下调能够抑制细胞的增殖、增加细胞的凋亡率,抑制细胞迁移和克隆形成率,并且FAK磷酸化程度降低。我们利用WB-F344细胞作为模型,研究HPPCn对肝干细胞特性的影响,结果表明HPPCn能够促进WB-F344细胞的增殖,促进细胞的迁移,增加细胞的克隆形成率,激活WB-F344细胞的SPK,Erk,Stat3三条信号通路,证明HPPCn可能在肿瘤发生过程中发挥一定的作用。最后,我们在体内研究了HPPCn对肿瘤发展的影响。用裸鼠作为动物模型,建立皮下移植正常HepG2和HepG2/si-HPPCn细胞的移植瘤模型。实验结果表明接种HepG2细胞后给予Ad-HPPCn刺激的裸鼠的肿瘤大于给予PBS和Ad-GFP组;接种HepG2/si-HPPCn细胞的裸鼠肿瘤体积小于接种正常HepG2细胞。这和体外实验的结果是一致的。综上所述,我们的研究结果表明HPPCn及其信号途径在肿瘤发生、发展过程中起着非常重要的作用,该研究结果将为原发性肝癌治疗提供新的治疗靶点。
赵清涛[7]（2007）在《1．人源肝癌单链抗体的表达及功能研究 2．COX-2在肝癌诱导肿瘤新生血管形成中作用机制研究》文中研究表明利用细胞融合技术成功制备的杂交瘤单克隆抗体（mAb）在疾病的预防和诊治等方面显示出了重要作用,但因为鼠源性抗体在人体应用时容易诱发HAMA,产生不良反应。抗体库技术为制备高亲和性的人源抗体提供了有力工具。该技术无需免疫即可制备全人源性抗体,可有效避HAMA。我实验室利用噬菌体抗体库技术,构建了全人源肝癌单链抗体噬菌体库,并筛选到了一株肝癌特异性单链抗体。目的构建单链抗体的原核表达系统,实现蛋白的高效表达,并鉴定其与肝癌组织结合的特异性及亲和力,为其下一步应用研究打下基础。方法1全人源肝癌单链抗体载体构建和原核非融合表达及复性,与肝癌细胞特异性结合鉴定。以肝癌单链抗体噬菌体载体pDAN5/ScFv-D25为模板,利用重叠延伸PCR,将VL和VH基因以（Gly4ser）3 linker连接成单链,将PCR产物连接入T载体并测序,将目的片段酶切插入表达载体pET28a（+）,转化大肠杆菌BL21（DE3）,诱导目的蛋白表达,SDS-PAGE电泳检测表达情况。对包涵体进行溶解、变性、复性、纯化,得到可溶性目的蛋白,应用细胞ELISA检测与肝癌细胞结合的特异性及亲合能力。2全人源肝癌单链抗体（D25）在大肠杆菌中的分泌表达及与人体肝癌组织特异性结合鉴定;酶切pGEM/D5载体,酶切片段插入表达载体pET32a+的酶切位点中,转化E. coli BL21trxB,蛋白表达, SDS-PAGE电泳检测表达情况。应用细胞ELISA检测与肝癌细胞结合的特异性及结合能力。利用63例肝癌组织芯片、5例正常肝组织及3例胰腺癌组织,免疫组化方法检测D25与人体肝癌组织特异性结合情况。结果1构建了D25原核表达载体,经IPTG诱导,成功获得了表达,表达蛋白相对分子质量32KD左右。目的蛋白表达量占菌体总蛋白的26%,包涵体经过复性纯化后,细胞ELISA鉴定能与SMMC-7721细胞特异性结合,亲和常数为:3.6×107 L/mol。2构建了pET32/d25单链抗体载体,转化E. coli BL21trxB诱导表达后,成功获得目的蛋白与TrxB蛋白融合可溶性表达,表达产物主要存在于周质腔中。SDS-PAGE电泳检测结果表明:融合蛋白分子量为42KD左右。ELISA检测,表达产物与SMMC-7721细胞有很好的结合活性,利用组织芯片行免疫组化结果显示其与5例正常肝组织及3例胰腺癌组织无结合,而与人肝癌细胞结合阳性反应率68.3%（43/63）,与前两组比较差异显着。结论通过噬菌体抗体库筛选得到的肝癌特异性单链抗体可以通过原核表达系统,实现蛋白的高效表达;肝癌特异性单链抗体能与肝癌SMCC-7721细胞系及人肝癌组织特异性结合,并且有较强的亲和力,为今后进行免疫学检测和开发肿瘤靶向治疗提供了研究手段。在亚洲、非洲地区,在患恶性肿瘤病人中,肝细胞肝癌（HCC）是导致患者死亡的主要原因,尽管目前对肝癌可以采取手术切除、动脉插管化疗、放疗及局部治疗等方法,但效果欠佳,人们一直在寻找一种有效治疗肝癌的途径,抑制肝癌血管生成是治疗肿瘤的新策略。目的肿瘤新生血管形成在肿瘤发生发展过程中起着重要作用。本实验主要探讨COX-2在肝癌及其诱导血管形成过程中的作用机制及途径。方法1.构建COX-2小干扰RNA（siRNA）表达质粒,设计有小发夹结构的2条COX-2 siRNA对应模板DNA序列,煺火处理后克隆至pSIREN-Shuttle质粒,构建重组质粒pSIREN/COX-2 siRNA,同样方法构建阴性对照质粒pSIREN/negative siRNA。将重组质粒转化大肠杆菌DH5α,酶切鉴定,再将pSIREN/COX-2 siRNA和pSIREN/negative siRNA转染HuH-7细胞系,构建稳定转染细胞系,采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、Westernblot检测COX-2表达。采用PGE2试剂盒检查细胞培养液PGE2的变化情况。2.利用基因芯片技术观察COX-2特异性抑制剂SC-58635应用后HuH-7细胞系所表达的与血管形成相关的22条基因的变化情况。根据基因芯片法抽提细胞mRNA,进行反转录cDNA探针,与GEArray Q Series Human CancerPathway Finder Gene Array芯片进行杂交,并对结果进行分析。3.分别利用选择性COX-2抑制剂（SC-58635）和COX-2siRNA抑制HuH-7细胞系COX-2的表达,收集抑制前后HuH-7细胞培养液,研究以上培养液在体外对人脐静脉血管内皮细胞增殖能力、迁移能力及细胞小管形成能力的影响,以及在体内对血管生成的影响。结果1.酶切电泳证实,重组质粒pSIREN/COX-2 siRNA和pSIREN/negative siRNA载体构建成功,转染HuH-7细胞后,COX-2siRNA可以显着抑制HuH-7细胞的COX-2 mRNA及蛋白的表达,而对COX-1表达无影响。COX-2 siRNA抑制COX-2表达后可以使PGE2的合成量下降约72%。2.我们通过基因芯片技术观察了HuH-7在应用特异性COX-2抑制剂SC-58635后, 22条血管生成相关基因表达的变化情况,结果显示,血管内皮生长因子（VEGF）、肝细胞生长因子（HGF）、原纤维细胞生长因子2（FGF2）、血管生成素1（ANGPT1）及血管生成素2（ANGPT2）等促血管生成因子在COX-2抑制后表达下降超过2倍,VEGF下降达到4.5倍。3.选择性COX-2抑制剂SC-58635和COX-2siRNA抑制HuH-7细胞系COX-2的表达后,HuH-7细胞培养液明显抑制了HUVEC的增殖能力、迁移能力及细胞小管形成能力,在体内的血管生成也同样受到抑制。并且在细胞培养液中加入外源性PGE2后可以部分逆转这种对血管生成的抑制作用。结论体内及体外的血管形成实验均证实,COX-2抑制剂及COX-2 siRNA均可以通过抑制COX-2的表达从而抑制肝癌诱导的肿瘤血管形成。在HuH-7诱导血管形成过程中,COX-2促进PGE2合成,PGE2直接作用于血管内皮细胞促进血管形成。除了COX-2通过促进PGE2合成直接促进血管形成途径外,COX-2还可以通过促进PGE2的释放,刺激血管内皮生长因子等血管形成因子合成增加,促进血管形成。本实验说明:COX-2是肝癌诱导血管形成过程中的关键因素,COX-2使通过诱导PGE2合成,PGE2通过直接刺激血管形成以及促进血管形成相关因子的表达间接促进血管形成两种途径起作用。提示COX-2抑制剂在治疗肝癌反面是一个很有前途的化学药物。
董红霖[8]（2005）在《抗人肝癌基因工程抗体单双价嵌合Fab的构建和在大肠杆菌及毕赤酵母中的表达》文中研究表明目的: 抗体的高效表达是制备有应用价值的治疗性抗体的重要前提,目前小分子抗体在基础研究、临床诊断和治疗中的广泛应用使之成为研究热点。为了提高产量并获得高结合活性的抗人肝癌嵌合Fab抗体,我们利用大肠杆菌和巴氏酵母高效表达抗人肝癌嵌合Fab和F（ab’）2两种形式的抗体形式,并分析其与相应抗原的结合活性,进而明确基因工程抗体大规模培养的可行性。产物经过鉴定和纯化,得到高表达的抗人肝癌嵌合Fab并为其下一步应用研究打下基础。 方法:根据研究目的,实验内容共分为四个部分: 1 抗人肝癌基因工程双价嵌合Fab抗体两种形式的载体构建和原核非融合表达及复性 以克隆载体pET32/cFab为模板,用设计的含有相应酶切位点的特异引物扩增cL、cFd基因,,并分别通过PCR延伸直接得到了Linker32和Lingker21连接序列,之后分别连接成两对匹配序列:①cL-Linker32-cL和cFd-Linker32-cFd,②cL-Linker21-cL和cFd-Linker21-cFd,之后对以上CL和cFd片段酶切,将cL序列克隆入原核表达载体pET21a后,而将cFd序列克隆入
唐世刚,苏先狮[9]（2003）在《人源性肝细胞生长因子高效真核表达载体的构建》文中研究指明目的 :通过基因克隆构建人源性肝细胞生长因子 （hHDSSF）真核高效表达重组体。方法 :通过T A克隆构建hHDSSF中间重组体pGEM hHDSSF ;酶切鉴定后构建真核表达重组体pcDNA3.1hisB hHDSSF ;末端终止法测定插入片断基因序列。结果 :酶切证实hHDSSF完整插入pGEM中 ;酶切筛选得到正向插入的真核表达重组体pcDNA3.1hisB hHDSSF ,并经序列分析证明。结论 :成功构建了真核表达重组体pcDNA3.1hisB hHDSSF ,为进一步转染真核细胞建立稳定的转染表达细胞株和高效表达hHDSSF奠定了坚实的基础。
周世水[10]（2003）在《重组人源抗HBsAg单链抗体—干扰素γ在巴氏毕赤酵母中表达的研究》文中指出目前乙型肝炎病毒感染是全球性公共卫生问题,现有3.5亿患者受其困扰。随着抗HBsAg单克隆抗体和抗体片段的研究开发,发现能够和乙肝病毒表面特异性位点结合并封闭其侵袭肝细胞的活性,而融合了对病毒有较好临床治疗效果的干扰素γ的双功能抗体将能够起到导向性预防和治疗的双重作用。本文在前期工作的基础上,将抗HBsAg单链抗体（single-chain Fv against HBsAg,HBscFv）基因与干扰素γ（IFNγ）基因在体外拼接成单一基因,然后转入巴氏毕赤酵母中分泌表达,并对表达产物进行了纯化及体外生物学活性和理化性质鉴定。 体外基因及其表达载体的构建。首先是设计合适的引物并分别从含干扰素γ基因的载体和含抗HBsAg单链抗体的质粒中PCR扩增出干扰素γ基因和HBscFv基因。接着成功采用重叠PCR技术,通过基因SOEing方法将两基因拼接成单一基因HBscFv-IFNγ,并进行序列测定,其结果表明,所获得的基因产物为正确的HBscFv-IFNγ基因。将此HBscFv-IFNγ基因插入真核高效表达的载体pPICZaA中,获得含目的基因的表达载体pPICZaA/HBscFv-IFNγ,并成功转入E coli. TOP10。对此载体进行体外多拷贝的构建,最后成功地构建出pPICZaA/（HBscFv-INFγ）2、pPICZaA/（HBscFv-INFγ）4、pPICZaA/（HBscFv-INFγ）6的表达载体,并分别成功转入E coli. TOP10。因此,通过液体培养可大量提取各类多拷贝含目的基因的表达载体,为进行酵母转化奠定了良好的基础。 在P. pastoris中分泌表达融合蛋白HBscFv-IFNγ。将测序确认正确的酵母表达质粒pPICZaA/HBscFv-IFNγ用酶PmeI线性化,同多拷贝表达载体pPICZaA/（HBScFv-IFNγ）n=2、4、6一起,分别采用LiCl法或电穿孔转化法转化P. pastoris GS115或X33,获得大量转化子。对转化菌落基因组进行PCR鉴定,发现70%转化子中含有目的基因HBscFv-IFNγ的整合。高浓度Zeocin抗性筛选试验,发现4%左右的转化子能够在含2000mg/L Zeocin的抗性平板上生长,并且电转化法的转化子中高抗性菌株比例稍微高于LiCl法转化子。将转化子经甲醇诱导培养后,发现培养上清中含有HBScFv-IFNγ样蛋白。对此蛋白用鼠抗HBscFv单克隆抗体作为第一抗体的Western-blotting分析表明,酵母培养上清中含有分子量为42kD的HBScFv-IFNγ融合蛋白。间接ELISA结果表明,酵母培养上清中的HBscFvI-IFN具有结合HBsAg活性。定量分析结果表明,酵母培
二、人源性肝细胞生长因子高效真核表达载体的构建（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人源性肝细胞生长因子高效真核表达载体的构建（论文提纲范文）
（1）猪FGL1单克隆抗体的制备及其双抗夹心ELISA检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 纤维蛋白原样蛋白1研究进展 |
| 1.1 FGL1的发现及其结构 |
| 1.2 FGL1在肝组织再生中的作用 |
| 1.3 FGL1与癌症 |
| 1.3.1 FGL1与肝癌 |
| 1.3.2 FGL1与胃癌 |
| 1.4 FGL1与急性期蛋白 |
| 1.5 FGL1与代谢 |
| 1.6 FGL1与免疫抑制性疾病 |
| 1.7 本研究的的目与意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 猪FGL1的克隆表达与鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒及肝脏组织样品 |
| 2.1.2 主要试剂与耗材 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 猪肝脏组织总RNA的提取 |
| 2.2.2 cDNA合成 |
| 2.2.3 猪FGL1基因的克隆 |
| 2.2.4 重组猪FGL1的原核表达与鉴定 |
| 2.2.5 重组猪FGL1大量表达与纯化 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 p QE-30-FGL1 表达载体的构建 |
| 2.3.2 重组猪FGL1的表达与鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 猪FGL1单克隆抗体与多克隆抗体的制备 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 试验动物与细胞 |
| 3.1.2 主要仪器与设备 |
| 3.1.3 主要试剂与耗材 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 重组猪FGL1 免疫Balb/C小鼠 |
| 3.2.2 小鼠血清抗体效价检测 |
| 3.2.3 猪FGL1单克隆抗体的制备 |
| 3.2.4 单克隆抗体的鉴定 |
| 3.2.5 腹水制备及抗体效价检测 |
| 3.2.6 IFA鉴定 |
| 3.2.7 初步鉴定获得的单克隆抗体是否识别相同的抗原表位 |
| 3.2.8 腹水的纯化 |
| 3.2.9 兔抗猪FGL1多克隆抗体的制备 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 免疫小鼠血清抗体效价检测 |
| 3.3.2 阳性杂交瘤细胞筛选 |
| 3.3.3 单克隆抗体的鉴定 |
| 3.3.4 IFA鉴定 |
| 3.3.5 杂交瘤细胞腹水制备及其抗体效价检测 |
| 3.3.6 初步鉴定获得的单克隆抗体是否识别相同的抗原表位 |
| 3.3.7 腹水的纯化 |
| 3.3.8 兔抗猪FGL1多克隆抗体的制备及检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 猪FGL1 双抗夹心ELISA检测方法的初步建立 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 最佳捕获抗体与检测抗体使用浓度的确定 |
| 4.2.2 抗原孵育时间的确定 |
| 4.2.3 检测抗体孵育时间的确定 |
| 4.2.4 酶标抗体作用时间的确定 |
| 4.2.5 底物最佳显色时间的确定 |
| 4.2.6 标准曲线的绘制 |
| 4.2.7 双抗夹心ELISA方法的初步应用 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 最佳抗体稀释度的确定 |
| 4.3.2 最佳抗原孵育时间的确定 |
| 4.3.3 检测抗体最佳孵育时间的确定 |
| 4.3.4 酶标抗体作用时间的确定 |
| 4.3.5 TMB显色时间的确定 |
| 4.3.6 双抗夹心ELISA方法的确立 |
| 4.3.7 双抗夹心ELISA方法检测猪FGL1 标准曲线的绘制 |
| 4.3.8 双抗夹心ELISA方法的初步应用 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（2）靶向PHD2胞内抗体对对乙酰氨基酚诱导肝损伤的保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤 |
| 1.1.1 对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤现状 |
| 1.1.2 对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤机制 |
| 1.2 低氧诱导因子/脯氨酰羟化酶通路 |
| 1.2.1 低氧诱导因子/脯氨酰羟化酶通路的发现 |
| 1.2.2 氧平衡与低氧 |
| 1.2.3 低氧诱导因子 |
| 1.2.4 低氧诱导因子脯氨酰羟化酶 |
| 1.2.5 靶向PHD抑制剂的应用 |
| 1.3 胞内抗体 |
| 1.3.1 胞内抗体的概述 |
| 1.3.2 胞内抗体的分类 |
| 1.3.3 胞内抗体的优势和应用 |
| 1.4 本研究的立题目的和研究内容 |
| 第2章 靶向PHD2 胞内抗体的构建和活性表征 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 成功制备靶向PHD2 胞内抗体ER-INP |
| 2.3.2 靶向PHD2 胞内抗体ER-INP在细胞中的表达及定位 |
| 2.3.3 靶向PHD2 胞内抗体ER-INP的生物学活性 |
| 2.3.4 靶向PHD2 胞内抗体ER-INP不影响细胞形态和生存率 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 靶向PHD2 胞内抗体体内和体外的促血管生成效应 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 靶向PHD2 胞内抗体在体内外有效促进血管生成 |
| 3.3.2 靶向PHD2 胞内抗体显着上调HIF-1 下游靶基因 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 靶向PHD2 胞内抗体保护APAP诱导的肝损伤 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.3.1 建立了APAP诱导的肝损伤动物模型 |
| 4.3.2 小鼠尾静脉注射GFP质粒靶向富集肝脏 |
| 4.3.3 ER-INP能在小鼠肝脏表达,但不影响正常肝脏组织形态和酶学特征 |
| 4.3.4 靶向PHD2 胞内抗体对APAP诱导肝损伤的保护作用 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 靶向PHD2 胞内抗体对APAP诱导肝损伤的保护作用机制 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果与分析 |
| 5.3.1 靶向PHD2胞内抗体有效促进APAP诱导肝损伤小鼠肝脏血管生成 |
| 5.3.2 靶向PHD2 胞内抗体对肝损伤小鼠体内细胞应激的影响 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 讨论 |
| 6.1 靶向PHD2 胞内抗体的制备及其促血管生成效应 |
| 6.2 靶向PHD2 胞内抗体对APAP诱导肝损伤的保护作用及机制 |
| 第7章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（3）新型免疫毒素降低非特异性毒性的设计与研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 第一章 绪论 |
| 1.免疫毒素及其研究进展 |
| 2.免疫毒素的作用机制 |
| 2.1 植物毒素的作用机制 |
| 2.2 细菌毒素的作用机制 |
| 2.3 人源毒素的作用机制 |
| 3.免疫毒素的制备方法 |
| 3.1 化学偶联法 |
| 3.2 基因融合法 |
| 4.免疫毒素的缺陷及解决方法 |
| 4.1 借助蛋白内含肽设计两段式免疫毒素降低非特异毒性 |
| 4.2 设计抗原屏蔽型免疫毒素降低非特异性毒性 |
| 第二章 新型两段式免疫毒素的制备与鉴定 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 菌株、细胞和质粒 |
| 2.2 实验物品和试剂 |
| 2.3 实验仪器与设备 |
| 2.4 实验相关溶液 |
| 2.5 表达载体的构建 |
| 2.6 重组蛋白的表达 |
| 2.7 目的蛋白的纯化 |
| 2.8 细胞毒性的检测 |
| 2.9 体外反式剪接反应 |
| 3.结果 |
| 3.1 两段式免疫毒素的制备策略 |
| 3.2 构建免疫毒素表达载体 |
| 3.3 免疫毒素的表达与纯化 |
| 3.4 免疫毒素的细胞毒性 |
| 3.5 两段式免疫毒素的载体构建 |
| 3.6 两段式免疫毒素的表达 |
| 3.7 两段式免疫毒素的纯化 |
| 3.8 体外蛋白反式剪接反应 |
| 4.讨论 |
| 第三章 新型两段式免疫毒素的活性检测 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 细胞及其培养条件 |
| 2.2 实验试剂和仪器 |
| 2.3 抗原亲和力分析 |
| 2.4 细胞摄取分析 |
| 2.5 细胞毒性检测 |
| 2.6 细胞凋亡检测 |
| 3.结果 |
| 3.1 两段式免疫毒素的抗原结合活性 |
| 3.2 两段式免疫毒素的细胞摄取 |
| 3.3 两段式免疫毒素的细胞毒性 |
| 3.4 两段式免疫毒素诱导细胞凋亡 |
| 4.讨论 |
| 第四章 抗原屏蔽型免疫毒素的制备与验证 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 菌株、质粒和细胞 |
| 2.2 实验材料和试剂 |
| 2.3 实验仪器和设备 |
| 2.4 实验相关溶液配制 |
| 2.5 表达载体的构建 |
| 2.6 重组蛋白的表达 |
| 2.7 目的蛋白的纯化 |
| 2.8 体外反式剪接反应 |
| 2.9 体外酶切反应 |
| 2.10 抗原结合亲和力检测 |
| 2.11 细胞毒性检测 |
| 3.结果 |
| 3.1 表达载体的构建 |
| 3.2 抗体片段的表达与分析 |
| 3.3 毒素片段的表达和鉴定 |
| 3.4 抗体片段的纯化 |
| 3.5 毒素片段的纯化 |
| 3.6 免疫毒素的生成 |
| 3.7 免疫毒素的纯化 |
| 3.8 免疫毒素的体外活化 |
| 3.9 免疫毒素抗原亲和力检测 |
| 3.10 免疫毒素细胞毒性检测 |
| 4.讨论 |
| 第五章 抗原屏蔽型免疫毒素体内药效学评价 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 细胞和动物 |
| 2.2 实验物品和试剂 |
| 2.3 实验仪器和设备 |
| 2.4 实验相关溶液配制 |
| 2.5 肿瘤细胞培养 |
| 2.6 小鼠皮下接种 |
| 2.7 体内药效研究 |
| 2.8 肿瘤分布研究 |
| 2.9 非特异性毒性评价 |
| 3.结果 |
| 3.1 免疫毒素的抑瘤作用 |
| 3.2 免疫毒素的肿瘤分布 |
| 3.3 免疫毒素的非特异性毒性 |
| 4.讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 1.研究总结 |
| 2.特色与创新 |
| 3.课题展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 攻读博士学位期间申请的专利 |
| 致谢 |
（4）快速抗体人源化平台的建立及乙型肝炎病毒人源化抗体的成药性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 抗体(Antibody)的概述 |
| 1.1.1 抗体的结构与功能 |
| 1.1.2 抗体的人源化 |
| 1.1.3 抗体药物市场 |
| 1.1.4 抗感染抗体药物的概况及趋势 |
| 1.1.5 Fc改造对效应功能的影响 |
| 1.2 乙型肝炎病毒(HBV)的概述 |
| 1.2.1 HBV基因组 |
| 1.2.2 HBV的病毒结构 |
| 1.2.3 HBV的生命周期 |
| 1.2.4 HBV基因编码的蛋白 |
| 1.2.5 HBV的基因型 |
| 1.2.6 HBV的流行病学 |
| 1.2.7 HBV的预防 |
| 1.2.8 HBV感染的抗病毒治疗 |
| 1.3 本研究的目的、意义和思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要耗材 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 实验常用溶液及试剂配置 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 常规分子克隆实验方法 |
| 2.2.2 常规细胞生物学方法 |
| 2.2.3 抗体的表达、纯化及鉴定 |
| 2.2.4 免疫学相关实验方法 |
| 2.2.5 体外调理吞噬实验 |
| 2.2.6 抗原-抗体免疫复合物特征分析 |
| 2.2.7 HBV相关抗体的小鼠体内实验方法 |
| 2.2.8 亲和力常数测定 |
| 2.2.9 抗体晶体培养及结构解析 |
| 2.2.10 食蟹猴体内评估抗体的药代动力学 |
| 2.2.11 抗体生物物理特性相关实验方法 |
| 2.2.12 数据处理统计学分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 第一部分 快速点突变抗体人源化平台的构建 |
| 3.1 流感病毒鼠源抗体12G6的人源化 |
| 3.1.1 12G6-cAb体外活性的评估 |
| 3.1.2 12G6-cAb的人源化设计 |
| 3.1.3 12G6人源化抗体真核表达载体的构建 |
| 3.1.4 12G6人源化抗体小量转染细胞上清性质鉴定 |
| 3.1.5 12G6人源化抗体大量表达、纯化及性质鉴定 |
| 3.2 呼吸道合胞病毒鼠源抗体5B11和7G5的人源化 |
| 3.2.1 5B11-cAb和7G5-cAb体外活性的评估 |
| 3.2.2 5B11-cAb和7G5-cAb的人源化设计 |
| 3.2.3 5B11和7G5人源化抗体构建、表达、纯化及性质鉴定 |
| 3.3 第一部分小结 |
| 第二部分 乙型肝炎病毒治疗性抗体的改造及成药性评估 |
| 3.4 E6F6人源化抗体162的亲和力测定 |
| 3.4.1 E6F6人源化抗体162的晶体培养及结构解析 |
| 3.4.2 E6F6鼠抗的人源化改造 |
| 3.4.3 E6F6人源化抗体体内外活性的评估 |
| 3.4.4 E6F6人源化抗体的成药性评估 |
| 3.4.5 E6F6人源化抗体与HBsAg免疫复合物的结构特征分析 |
| 3.4.6 E6F6人源化抗体162 Fc改造对吞噬的影响 |
| 3.5 第二部分小结 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 鼠源抗体人源化方法 |
| 4.2 抗体CDR的划分和人源化模板的选择 |
| 4.3 FR区人源化点突变规则 |
| 4.4 E6F6人源化抗体在小鼠体内的清除速率 |
| 4.5 E6F6人源化抗体huAb1和huAb3在食蟹猴体内的半衰期 |
| 4.6 抗原-抗体复合物电镜观察与纳米流式检测 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间的科研成果 |
| 致谢 |
（5）构建人源性可调控稳定表达细胞系及大规模肝向诱导分化的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 绪论 |
| 参考文献 |
| 第一部分 构建Tet-ou调控稳定表达HGF、FGF4人类MSCs细胞株 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 可调控稳定表达HGF、FGF4人干细胞肝向自身诱导分化能力的验证 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 可调控稳定表达HGF、FGF4人干细胞大规模增殖及自身诱导分化能力验证 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 博士研究生期间科研情况 |
| 致谢 |
（6）HPPCn在肝癌发生、发展过程中的功能及作用机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分携带Alb 启动子的HPPCn 真核表达载体和携带HPPCn 干涉序列载体的构建 |
| 第一节：携带Alb 启动子的HPPCn 真核表达载体的构建 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第二节：携带HPPCn 干涉序列载体的构建 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第二部分HPPCn 调控肝癌细胞和肝干细胞生物学特性和作用机制的研究 |
| 第一节：HPPCn 调控肝癌细胞生物学特性的作用和机制研究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第二节：HPPCn 对肝干细胞功能的影响 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第三部分 HPPCn 在体内对肝癌发展的影响 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 博士期间发表论文 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（7）1．人源肝癌单链抗体的表达及功能研究 2．COX-2在肝癌诱导肿瘤新生血管形成中作用机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 肝癌的生物导向治疗 |
| COX-2 与肝癌 |
| 第一部分 全人源性肝癌单链抗体的的表达、纯化及功能鉴定 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 人源性肝癌单链抗体的可溶性表达及与人肝癌组织的结合特性鉴定 |
| 实验材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 COX-2 在肝癌诱导肿瘤新生血管形成机制中作用的研究 |
| 1 实验材料及仪器 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）抗人肝癌基因工程抗体单双价嵌合Fab的构建和在大肠杆菌及毕赤酵母中的表达（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 文献回顾 |
| 前言 |
| 正文 |
| 1 抗人肝癌基因工程双价嵌合Fab抗体两种形式的载体构建和原核非融合表达及复性 |
| 2 抗人肝癌基因工程嵌合Fab抗体载体的构建及其在大肠杆菌中的分泌表达 |
| 3 抗人肝癌基因工程嵌合F(ab′)_2抗体载体的构建及其在大肠杆菌中的分泌表达 |
| 4 抗人肝癌基因工程嵌合Fab抗体在巴氏毕赤酵母的分泌表达 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 博士期间撰写的文章和待发表的论文 |
| 致谢 |
（10）重组人源抗HBsAg单链抗体—干扰素γ在巴氏毕赤酵母中表达的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 重组抗体的种类 |
| 1.2 双功能抗体的类型 |
| 1.2.1 双功能抗体 |
| 1.2.2 酶标抗体 |
| 1.3 干扰素γ的生物活性及其与肝炎的临床治疗 |
| 1.4 E.coli表达系统 |
| 1.5 昆虫表达系统 |
| 1.5.1 杆状病毒表达系统 |
| 1.5.2 稳定表达系统 |
| 1.6 哺乳动物细胞表达系统 |
| 1.7 毕赤酵母表达系统 |
| 1.7.1 甲醇代谢途径和甲醇代谢表型 |
| 1.7.2 表达载体构成元件 |
| 1.7.3 宿主菌 |
| 1.7.4 遗传操作特性 |
| 1.7.5 表达质粒与酵母基因组整合 |
| 1.7.6 构建多拷贝整合菌株 |
| 1.7.7 高密度发酵 |
| 1.7.8 分泌蛋白的糖基化 |
| 1.7.9 蛋白表达量 |
| 1.8 抗体表达系统的选择 |
| 1.9 抗HBsAg基因工程抗体及双功能抗体的研究现状 |
| 1.10 本课题的研究背景、意义和主要内容 |
| 1.10.1 研究背景和意义 |
| 1.10.2 主要内容 |
| 第二章 体外人源抗HBsAg单链抗体-干扰素γ基因及其多拷贝载体的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株和质粒 |
| 2.2.2 引物 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 主要仪器和设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 质粒的小量提取 |
| 2.3.2 PCR反应 |
| 2.3.3 DNA片段胶回收 |
| 2.3.4 ScFv-INFγ片段克隆至pPICZaA |
| 2.3.5 DNA序列测定 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 体外构建单链抗体-干扰素γ基因 |
| 2.4.2 构建重组质粒pPICZaA／HBscFv-INFγ |
| 2.4.3 HBscFv-INFγ.序列测定结果 |
| 2.5 pPICZaA／HBScFv-INFγ体外多拷贝的构建 |
| 2.5.1 体外构建pPICZaA／HBScFv-INFγ多拷贝的设计方案 |
| 2.5.2 pPICZaA／(HBScFv-INFγ)2的构建 |
| 2.5.3 pPICZaA／(HBscFv-INFγ)n=4，6拷贝载体的构建 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 抗HBsAg单链抗体-干扰素γ融合蛋白在毕赤酵母中的表达 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株和质粒 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 主要仪器和设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 质粒DNA的大量制备 |
| 3.3.2 重组质粒的线性化 |
| 3.3.3 制备酵母感受态细胞 |
| 3.3.4 重组质粒转化酵母细胞 |
| 3.3.5 菌落PCR检测目的基因整合 |
| 3.3.6 多拷贝转化子的筛选 |
| 3.3.7 转化菌株Mut类型的确定 |
| 3.3.8 转化菌株的诱导表达 |
| 3.3.9 蛋白质的浓缩 |
| 3.3.10 制备鼠抗HBscFv单克隆抗体 |
| 3.3.11 Western-blotting分析 |
| 3.3.12 间接ELISA |
| 3.3.13 竞争ELISA |
| 3.3.14 酵母表达HBscFv-INFγ的初步提取纯化 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 LiCl法转化酵母GS115 |
| 3.4.2 电转化法转化酵母X33 |
| 3.4.3 酵母基因组DNA的提取与PCR检测 |
| 3.4.4 HBscFv-INFγ.基因在工程菌中的诱导表达 |
| 3.4.5 Western-blotting分析酵母表达上清中的HBscFv-INFγ |
| 3.4.6 酵母菌体蛋白SDS-PAGE分析结果 |
| 3.4.7 多拷贝转化子筛选结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章：重组人源HBScFv-INFγ融合蛋白的纯化和理化性质的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌株 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 主要仪器设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 Con-Sepharose 4B亲和层析纯化重组HBScFv-INFγ |
| 4.3.2 14F7亲和层析纯化重组HBScFv-INFγ融合蛋白 |
| 4.3.3 糖蛋白分析 |
| 4.3.4 Bradford法测定蛋白含量 |
| 4.3.5 ELISA测定重组HBScFv-INFγ抗体抗原结合活性 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 HBScFv-INFγ融合蛋白理化性质的预测结果 |
| 4.4.2 转化菌株表达上清的浓缩 |
| 4.4.3 凝胶过滤脱盐 |
| 4.4.4 Con-Sepharose 4B亲和层析纯化HBScFv-INFγ |
| 4.4.5 14F7亲和层析纯化HBScFv-INFγ |
| 4.4.6 糖蛋白分析 |
| 4.4.7 ELISA结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小节 |
| 第五章 工程酵母表达HBscFv-INFγ的发酵工艺优化 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 菌株 |
| 5.2.2 主要试剂 |
| 5.2.3 培养基和溶液 |
| 5.2.4 主要仪器设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 培养时间对HBScFv-INFγ表达的影响 |
| 5.3.2 摇瓶装液量对HBScFv-INFγ表达的影响 |
| 5.3.3 不同接种量对HBScFv-INFγ表达的影响 |
| 5.3.4 添加不同甲醇浓度对HBScFv-INFγ表达的影响 |
| 5.3.5 发酵液甲醇浓度测定 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 重组HBScFv-INFγ工程菌的生长曲线和产物累积曲线 |
| 5.4.2 摇瓶装液量对HBScFv-INFγ表达的影响 |
| 5.4.3 不同接种量对HBScFv-INFγ表达的影响 |
| 5.4.4 甲醇浓度对重组HBScFv-INFγ工程菌表达的影响 |
| 5.4.5 培养工艺参数的优化 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文 |
| 致谢 |
四、人源性肝细胞生长因子高效真核表达载体的构建（论文参考文献）
- [1]猪FGL1单克隆抗体的制备及其双抗夹心ELISA检测方法的建立[D]. 张欣. 西北农林科技大学, 2020(03)
- [2]靶向PHD2胞内抗体对对乙酰氨基酚诱导肝损伤的保护作用及机制研究[D]. 赵良中. 吉林大学, 2020(08)
- [3]新型免疫毒素降低非特异性毒性的设计与研究[D]. 王静. 上海交通大学, 2019(06)
- [4]快速抗体人源化平台的建立及乙型肝炎病毒人源化抗体的成药性研究[D]. 周兵. 厦门大学, 2018(06)
- [5]构建人源性可调控稳定表达细胞系及大规模肝向诱导分化的实验研究[D]. 肖江强. 南京大学, 2013(01)
- [6]HPPCn在肝癌发生、发展过程中的功能及作用机制研究[D]. 常菁. 中国人民解放军军事医学科学院, 2009(09)
- [7]1．人源肝癌单链抗体的表达及功能研究 2．COX-2在肝癌诱导肿瘤新生血管形成中作用机制研究[D]. 赵清涛. 第四军医大学, 2007(04)
- [8]抗人肝癌基因工程抗体单双价嵌合Fab的构建和在大肠杆菌及毕赤酵母中的表达[D]. 董红霖. 第四军医大学, 2005(06)
- [9]人源性肝细胞生长因子高效真核表达载体的构建[J]. 唐世刚,苏先狮. 湖南医科大学学报, 2003(06)
- [10]重组人源抗HBsAg单链抗体—干扰素γ在巴氏毕赤酵母中表达的研究[D]. 周世水. 华南理工大学, 2003(06)