一、DESIGN OF ANTI-CD3 ScFv-B7.1 FUSION MOLECULE AND PREDICTION OF ITS BIOLOGICAL CHARACTERISTICS（论文文献综述）
方佳成[1]（2021）在《泛实体瘤相关抗原图谱的构建及其在抗体偶联药物和嵌合抗原受体T细胞上的应用》文中研究指明癌症已经成为危害人类健康的主要疾病,据世卫组织国际癌症研究机构数据显示,2020年,全球男性和女性将合计出现约1930万和1000万的新发病例和癌症死亡病例,其中的1800万例和930万例将来自实体瘤。然而,对肿瘤治疗的系统评估数据显示,欧洲药物管理局在2009-2013年度批准的大多数抗癌药物未能对患者的整体生命质量产生重大改善。因此,需要继续提高抗肿瘤药物的临床疗效。抗体偶联药物（Antibody-Drug Conjugates,ADC）和嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor,CAR）T细胞疗法是发展迅速的肿瘤靶向治疗技术,它们通过特异性识别在恶性细胞和正常组织细胞之间差异过表达的靶标抗原,达到辨识肿瘤和消融肿瘤的目的。ADC和CAR-T实现安全性与有效性的关键,在于其所识别的靶标抗原是否具备足够的肿瘤特异性。因而,鉴别出理想的靶标抗原至关重要。理想的靶标抗原由恶性细胞特异性表达,然而肿瘤特异性抗原屈指可数。肿瘤相关抗原在肿瘤细胞上表达升高,在正常细胞上限制性表达,这一特性使得它们亦能够作为有效定位恶性肿瘤的靶标分子。目的:以发现理想的肿瘤相关抗原为出发点,着力于打造肿瘤相关抗原发现新平台,构建全面的泛实体瘤肿瘤相关抗原图谱,为癌症研究人员和广泛的科学与医药界科研工作者提供研究便利。方法:1.使用经统一处理的TCGA和GTEx的RNA序列数据,对19种类型实体瘤中的20242个HUGO基因进行差异分析;通过将阈值设置为Benjamini-Hochberg adjusted p值为0.01,log2Fold Change为1.0,保留那些在肿瘤细胞群中显着差异表达的HUGO基因;结合蛋白质亚细胞定位信息,排除不具备胞外结构域的蛋白;使用集成了GTEx,HPA和FANTOM5的m RNA表达信息和HPA和HPM的蛋白质丰度信息的数据集,获取在正常组织中受限表达的蛋白分子;使用公开的Blood Spot平台,发现那些在骨髓Lin-CD34+CD38-CD90+CD45RA-HSCs和Lin-CD34+CD38-CD90-45RA-MPPs中限制性表达的蛋白分子。2.将RNA测序的读段计数数据转换为TPM格式,并将每个基因在其配对适应症和正常组织中的TPM值作为差异表达分析的输入数据。采用非参数Mann-Whitney U检验分析,计算并绘制每个候选靶标分子在特定适应症中的表达相比其在各个人体正常组织中的表达的差异表达谱。3.提取并整理TCGA中泛癌表型数据中的癌组织学分级,病理分级和TNM分期信息;通过挖掘MC3（“多中心多癌种突变识别”）TCGA MAF（“突变注释格式”）数据,确定靶标基因的非沉默体细胞突变（SNP和INDEL）。结合m RNA表达数据,汇编用于评价靶标基因的异质表达模式的综合数据集。4.从TCGA下载并提取靶标基因组变异数据,从Onco KB收集致癌或功能性基因组变异信息,注释并统计靶标基因的变异类型及发生频率,确定在临床上有应用价值的携带特异性驱动变异的功能性靶标。5.通过杂交瘤技术制备CDH17特异性单克隆抗体,进而运用流式细胞术、过表达共定位分析、结合亲和力检测、抗体测序和可变区序列进化关系分析等,多重表征抗体的各项指标。通过偶联mc-Val Cit PABC-MMAE,制备CDH17靶向型ADC。结合体外杀伤实验与细胞内化评估,完成效应分子的初筛验证。6.通过构建KM12SM和COLO205结肠癌细胞系CDX动物模型,综合评估chi2E21-MMAE和chi2F12-MMAE的体内抗肿瘤活性。通过制备和人鼠CDH17蛋白交叉反应的ADC分子,并对给药的荷瘤小鼠的心/肺/肝/肾/结肠/直肠/脾脏进行HE染色,评估CDH17靶向型ADC对小鼠的组织毒性。7.通过慢病毒载体感染CD3+T细胞,制备LYPD3靶向型CAR-T细胞。通过对CAR-T细胞进行分化检测,确定其向效应细胞持续分化的能力。通过体外细胞杀伤实验和细胞因子分泌检测,研究LYPD3靶向型CAR-T细胞对肿瘤细胞的的特异性杀伤作用。通过对荷瘤小鼠循环血中的CAR-T细胞进行计数和检测肿瘤组织中的T细胞浸润水平,揭示LYPD3靶向型CAR-T细胞在小鼠体内发挥持久抗肿瘤作用的机制。结果:1.开发专门的算法和汇编整合有泛实体瘤和正常组织的大型转录组、蛋白质组和基因组信息的综合数据集。2.系统地识别肿瘤相关抗原。通过我们的肿瘤相关抗原发现平台,筛选得到75个潜在的肿瘤相关抗原分子。特别是BACE2、CDH17、CELSR1、CELSR2、COL17A1、COL23A1、CRIM1、DSC3、GPR87、LYPD3、MUC17、NOX1、PTPRN2、SCTR、TRPM8、VCAM1等分子值得做进一步的临床前研究。3.基于CDH17蛋白定向开发的ADC分子可以在体内显着消融KM12SM和COLO205异种移植瘤,并对高表达CDH17蛋白的结肠癌病人来源的异种移植瘤表现出一定的肿瘤抑制效果。chi2F12-MMAE在体外对高药敏度的COLO205显示高水平的细胞毒性（IC50=60.9p M）,chi2E21-MMAE和chi1A13-MMAE对COLO205的抑瘤水平相当（IC50:925.8 p M vs.998.3 p M）。两次单药静脉注射（Q2W）chi2E21-MMAE或chi2F12-MMAE,均能以剂量依赖性的方式抑制KM12SM在小鼠体内的生长,但无法完全清除肿瘤。在COLO205 CDX模型中,按同样的给药方式静注chi2F12-MMAE,1.5 mg/kg剂量的第一针治疗可以起到平缓异种移植肿瘤增长的效果,且两周后的第二针治疗亦能继续起到溶瘤效果;3 mg/kg的中剂量治疗组有部分小鼠的肿瘤在后期出现反弹;6 mg/kg的高剂量治疗可以根治异种移植瘤。4.CDH17靶向型ADC在小鼠体内具有相对可控的组织毒性。制备了能和人鼠CDH17蛋白交叉反应的ADC分子677-MMAE,观察到在677-MMAE给药组小鼠的结直肠的局部组织中有炎症反应,聚集了大量的淋巴细胞;但在其它组织中没有出现炎症反应。此外,在观察期内,小鼠对chi2E21-MMAE、chi2F12-MMAE或677-MMAE的体内耐受良好,用药期间未有小鼠死亡个例出现,亦没有观察到10%以上的减重。5.LYPD3靶向型CAR-T细胞能够在小鼠体内对PC9异种移植肿瘤发挥持久的抗肿瘤作用。且小鼠对LYPD3-CAR-T的耐受良好,在观察期内未有小鼠死亡个例出现,亦没有观察到10%以上的减重。进一步调查发现,LYPD3-CAR-T细胞不仅在小鼠外周血中大量存在,还在高响应LYPD3-CAR-T治疗的PC9异种移植瘤组织中大量浸润。此外,LYPD3-CAR-T治疗组的小鼠脾脏内出现大量CD3+T细胞,但在对照组中却没有。CAR-T细胞的记忆表型对于激发持久的免疫应答至关重要。数据显示,LYPD3-CAR-T细胞在输注前,其中的Tn/Tscm细胞和Tcm细胞比例分别高达52.4%和21.7%,具有良好的向效应细胞分化的潜能。结论:通过开发肿瘤相关抗原识别算法和整合来自19种实体瘤和正常组织的大型转录组、蛋白质组和基因组数据,完成了泛实体瘤相关抗原的探索。通过考察CDH17靶向型ADC和LYPD3靶向型CAR-T细胞在模型小鼠中的抗肿瘤活性,例证了CDH17和LYPD3蛋白分别作为ADC和CAR-T靶标开发的可行性。
余怡[2]（2021）在《人胎肝间充质干细胞与成人骨髓间充质干细胞的免疫调节功能的比较研究》文中指出研究背景:自从首次发现间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）,经过几十年的研究,MSCs被发现其可通过多种分子作用机制介入免疫调节并在免疫调控时展现出独特的优势。与其他来源的MSCs相比,成人骨髓来源MSCs（Bone marow mesenchymal stem cells,BM-MSCs）已经成为临床应用的“金标准”。大量的临床前研究和临床应用研究数据证实了这种细胞应用的安全性和有效性,同时也证明了它对T细胞存活和功能有一定的影响作用。然而,我们对MSCs这些功能的潜在作用机制并没有太多深入的了解。现有的研究认为,细胞间的相互接触,可溶性因子的产生,重编程抗原呈递细胞为免疫耐受表型等途径都可能会成为BM-MSCs为Tregs的扩增和发挥其功效提供合适免疫调节环境的机制。前期研究发现,BM-MSCs不仅可直接抑制CD 4+T helper（辅助性T细胞）和CD 8+T cytotoxic（杀伤性T细胞）的增殖,而且也可以间接作用于Tregs（调节性T细胞）的产量来抑制适应性免疫应答反应。在本研究中,我们比较胎肝MSCs（Fetal liver mesenchymal stem cells,FL-MSCs）和 BM-MSCs 的生物学特性,发现 FL-MSCs 可以直接抑制活化的CD 4+T和CD 8+T的增殖,并且表现出较BM-MSCs更为持续的免疫调节能力。本研究还探讨了 FL-MSCs是否会通过诱导产生Tregs从而间接发挥其强大的免疫抑制作用。研究目的:BM-MSCs的获取需要侵入性操作,细胞存活时间较短且易衰老等缺陷,极大的限制了其广泛临床应用。本研究旨在寻找较为合适的MSCs种子细胞替代来源。最终,我们选取了 FL-MSCs,并将之与BM-MSCs进行比较,观察两种细胞的免疫调节功能的差异,评价其是否适合应用于细胞治疗,或者能成为优于BM-MSCs的更好的替代选择。研究方法:1)分别从胎肝和成人骨髓中分离、纯化、培养、传代和体外低温保存MSCs,并从表面抗原表达、多向分化和增殖潜能等三个方面进行细胞鉴定。2)从周龄为6-12周的C57BL/6小鼠脾脏中新鲜分离出单个核细胞,通过磁珠分选法获得较纯的分选后CD 3+CD 25-T细胞,之后对分离获得的细胞进行体外培养、传代和低温保存。3)体外试验将FL-MSCs或BM-MSCs与小鼠CD 3+CD 25-T细胞不同比例共培养,研究两种来源的MSCs对T细胞的作用,进一步研究将细分为分别对CD 4+T传统淋巴细胞和对CD 8+T传统淋巴细胞的免疫抑制作用。4)选择一定比例的MSCs与T细胞继续共培养分组,分别检测T细胞典型的细胞活化表面标记GITR,TNFR 2,ICOS等在CD 4+T传统细胞和CD 8+T传统细胞中的表达情况.5)在上述进行共培养时,我们观察到Tregs在FL-MSCs共培养组中较BM-MSCs共培养组中有所增加,因此我们决定实验量化两种细胞诱导传统T细胞转化为Tregs细胞的能力差别,同时测定诱导产生的Tregs（iTregs）细胞表面典型活化因子的表达量,最后进一步通过设计MLR实验（Mixed Lymphocyte Reaction,体外混合淋巴细胞反应）,以衡量这类诱导型Tregs细胞是否能有效的发挥它们功能的情况。实验结果:1)两种类型的MSCs均成功分离,良好贴壁生长,细胞呈现典型均匀的成纤维样长梭状形态;两种来源的细胞均表达MSCs典型的表面特征标志物,且比例相似;增殖实验结果显示,在观察的实验周期内,FL-MSCs的增殖能力明显优于BM-MSCs,且FL-MSCs持续增殖的时间维持的更长。2)体外成功分离得到的新鲜小鼠脾脏T细胞,获取所需经磁珠分选后的目标分群,待与MSCs体外共培养。3)用anti CD 3/CD 28磁珠刺激,且经CFSE标记后的T细胞,在与MSCs共培养时,不同比例混合情况下的CD 4+传统T细胞和CD 8+传统T细胞的增殖能力均不同程度的受到抑制,但其中,传统T细胞在与FL-MSC共培养分组中受抑制效果均明显强于于BM-MSCs。4)根据检测T细胞表面活化标记物的表达情况,在抑制CD 4+传统T细胞和CD 8+传统T细胞的活化能力方面,FL-MSCs优于BM-MSCs,具有更强的促进它们转变为活性更低表型的能力。5)FL-MSCs具有较BM-MSCs更强的将CD 3+CD 25-Foxp 3-T细胞转化为CD 3+CD 25+Foxp 3+T细胞的能力,同时可作用于CD 3+CD 4+CD 25+Foxp 3+细胞亚群和CD 3+CD 8+CD 25+Foxp 3+细胞亚群。因此,这些FL-MSCs iTregs可以被认为是能更有效地抑制CD 4+传统T淋巴细胞和CD 8+传统T淋巴细胞（统称为“T convs”）,因此更能发挥其免疫调节作用。研究结论:我们的结果表明了与BM-MSCs相比,FL-MSCs的增殖能力和对T细胞的免疫抑制作用更强,并且首次证实了 FL-MSCs的免疫调节的机制与诱导产生的更具活性的功能型Tregs相关。
邓垂文[3]（2021）在《T细胞免疫检查点CD226/TIGIT在原发性胆汁性胆管炎发病机制中的作用研究》文中研究表明目的:原发性胆汁性胆管炎（Primary biliary cholangitis,PBC）是一类以非化脓性中、小胆管损伤为主要病理特点的自身免疫性肝病。既有研究发现,过度活化的T细胞在PBC的发生、发展中有重要作用,但具体机制尚未阐明。近年来,免疫检查点作为调节淋巴细胞活性的分子开关而引起广泛关注。其中,CD226/TIGIT这一新型T细胞免疫检查点更被认为可能与自身免疫病的发生、发展密切相关,有望成为其潜在的治疗靶点。本研究首次对CD226/TIGIT在PBC发病机制中的作用进行探索。方法:本研究入组就诊于北京协和医院PBC患者42例,以及包括有疾病对照（Diseasecontrol,DC）和健康对照（Healthcontrol,HC）的对照组 55 例。采用流式细胞检测、分选技术,免疫组化技术,体外细胞培养,荧光实时定量PCR技术和统计分析等方法完成CD226/TIGIT免疫检查点相关外周血T淋巴细胞表型检测、细胞功能测定、受累组织免疫分析、可溶性免疫检查点分子检测、体外免疫检查点干预和临床相关性分析等。通过上述多个视角,探究该检查点对PBC发生、发展的影响及可能的分子机制。结果:PBC组外周血CD8+T细胞和CD4+T细胞均存在明显的CD226和TIGIT表达异常。PBC组与HC组相比,CD8+CD226+T细胞占比（%）、CD8+TIGIT+T细胞%、CD4+CD226+T细胞%和 CD4+TIGIT+T 细胞%均显着升高（71.8±12.0vs.52.0± 14.1,p<0.001;60.0± 15.60 vs.41.7± 12.9,p<0.001;63.0± 13.3 vs.50.1±11.7,p<0.001;31.5±8.7 vs.26.2±7.1,p=0.032）。PBC 组与 DC 组相比亦有相似趋势。DC组和HC组在上述各细胞亚群占比的比较中未见统计学差异。在相关性分析中,CD8+T细胞相关CD226/TIGIT亚群占比与PBC临床生化指标的关系尤为密切:CD8+TIGIT+T细胞%与患者碱性磷酸酶（r=-0.39,p=0.01）,γ-谷氨酰转肽酶（r=-0.35,p=0.02）,总胆红素（r=-0.38,p=0.01）,直接胆红素（r=-0.43,p<0.01）和总胆汁酸（r=-0.35,p=0.03）呈负相关,与血小板计数（r=0.38,p=0.03）呈正相关。CD8+CD226+T细胞%则与碱性磷酸酶（r=0.37,p=0.02）呈正相关。采用CD226/TIGIT比值进行相关性分析时,PBC患者CD8+T细胞的CD226/TIGIT比值与碱性磷酸酶（r=0.42,p<0.01）,γ-谷氨酰转肽酶（r=0.31,p=0.04）,总胆红素（r=0.31,p=0.04）,直接胆红素（r=0.35,p=0.02）和总胆汁酸（r=0.47,p<0.01）呈正相关,与血小板计数（r=-0.34,p=0.04）呈负相关。此外,该比值还和PBC患者预后指标天冬氨酸转氨酶与血小板计数的比值之间存在正相关（r=0.35,p=0.04）,和血清白蛋白水平之间存在负相关（r=-0.40,p=0.02）。在组间差异分析模型中,CD226/TIGIT表型数据分辨PBC组和DC组以及PBC组和HC组时有较好的准确度,分别为80%-89%和86%-92%。其中CD8+T细胞相关表型数据处于区分PBC组重要特征的第一位。进一步的细胞活化和功能分析证实CD226+T细胞群较CD226-T细胞群拥有更强的效应功能:CD226+T细胞群的CD107a+细胞%（77.5±7.8 vs.67.8±9.8,p<0.001）,IFN-γ+细胞%（71.3±13.9 vs.55.6 ± 15.7,p=0.04）和 TNF-α+细胞%（68.0±10.7 vs.56.9±14.4,p<0.001）较 CD226-T 细胞明显增多;而TIGIT+T细胞则可能为机体免疫系统异常活化后反馈调节的产物:PBC患者HLA-DR+细胞中TIGIT+细胞%较HLA-DR-细胞显着增加（63.2±17.4 vs.42.6±14.0,p<0.01）;且流式细胞分选和体外培养显示TIGIT-T细胞体外刺激72小时后有TIGIT+T细胞生成。病理相关研究发现受累组织中亦存在CD226/TIGIT失衡:在PBC患者肝脏中未染出TIGIT阳性细胞,但可见大量CD226阳性淋巴细胞,同时肝组织出现了 CD155 阳性染色。此外,可溶性CD226和CD155在各组中阳性率较低且无统计学差异。在体外干预方面,封闭CD226可以显着减少CD8+CD226+T细胞中 CD107a+细胞%（81.1±5.1 vs.72.7±7.8,p=0.032）、IFN-γ+细胞%（69.2±6.7 vs.52.9±15.6,p=0.024）和 TNF-α+细胞%（76.4±5.9 vs.58.6±14.7,p=0.021）并抑制细胞增殖。加入CD226/TIGIT的配体,即CD155重组蛋白则对CD8+TIGIT+T细胞的功能无显着影响。结论:PBC中存在有CD226/TIGIT免疫检查点失衡,是潜在的发病机制之一。未来应在更全面的队列以及动物模型中开展更深入的研究,阐明CD226/TIGIT免疫检查点参与PBC发生发展的模式并进一步评价其潜在临床应用价值。
仇驰逍[4]（2021）在《肿瘤特异性递呈抗原作为抗体类药物靶点的可行性初探》文中认为靶点选择对肿瘤的诊断、治疗至关重要。目前以抗体为基础的抗肿瘤药物展示出良好的抗肿瘤效果。抗体药物的靶点主要集中于肿瘤相关膜蛋白抗原（Tumor associated antigen,TAA）,如HER2、CD20、EGFR、CD19等。然而,这类靶点并非肿瘤细胞特有,靶向TAA的疗法在杀伤肿瘤细胞的同时,难以避免对正常体细胞造成损伤,存在显着的安全隐患。因此,我们亟需寻找高肿瘤特异性的靶点以提高肿瘤治疗的安全性。肿瘤存在大量体细胞突变,是区分肿瘤细胞与正常细胞的潜在特异性靶点。但突变蛋白大部分存在于细胞内部,无法被传统抗体识别。细胞通过抗原递呈机制,将突变蛋白水解成多肽,进而与主要组织相容性复合物（Major histocompatibility complex,MHC）I类分子结合,生成肿瘤特异的多肽/主要组织相容性复合物（Peptide/MHC complex,pMHC）,并递呈到细胞表面被T细胞受体（T cell receptor,TCR）识别。目前已有研究证明pMHC也可以作为抗体的识别靶标。然而,肿瘤特异性pMHC作为抗体药物靶点在肿瘤治疗中的可行性尚无系统性研究。本研究从递呈多肽序列选择、特异性抗体筛选及抗体药物合理设计出发,首次较为全面地对靶向肿瘤特异性pMHC的抗体药物进行探讨,旨在为该类抗体药物的理性设计提供方案。首先,本研究以肿瘤特异性融合蛋白BCR-ABL为例,探索递呈多肽的鉴定方法。通过递呈预测软件分析,我们得到两个候选pMHC（A9K多肽及K9R多肽与HLA-A*03:01分型的复合物）,并以复性及液质联用的方法进行确证。紧接着,研究通过构建鼠源噬菌体免疫文库对A9K-pMHC和K9R-pMHC进行特异性抗体的筛选,并获得了两株对A9K-pMHC具有一定特异性的抗体。我们以这两株抗体为基础制备了抗体偶联药物（Antibody-drug conjugate,ADC）和双特异抗体,并研究影响其抗肿瘤活性的相关因素。结果显示,ADC药物对抗原阳性A431-A9K细胞的EC50高于3.5μg/m L,活性并不理想;而双特异抗体会对抗原阴性细胞产生非特异性杀伤,可能与靶向pMHC的抗体特异性不足有关。为了验证该猜想,我们选择了已报道的高特异性pMHC靶向抗体2G1（靶向HLA-A*02:01/KRAS G12V）,对双特异抗体（2G1/CD3-Ig G1）的抗肿瘤活性进行深入研究。2G1/CD3-Ig G1能有效介导T细胞杀伤抗原阳性肿瘤细胞,同时可避免对抗原阴性细胞的损伤;且2G1/CD3-Ig G1能有效抑制小鼠移植瘤的生长,证明其高活性和高特异性。通过上述研究,我们得出:肿瘤特异性pMHC可以作为抗体类药物的靶点。与传统抗体的靶点相比,肿瘤特异性pMHC由于递呈量过低,使得靶点鉴定十分困难。我们通过结合软件递呈预测和实验验证,可以有效鉴定出阳性递呈多肽。此外,抗原的递呈量过低,这对抗体药物的分子形式提出了更高的要求。我们分别评价了ADC和双特异抗体两种形式,并提出双特异抗体能通过激活T细胞进行杀伤,在针对这类靶点时能发挥出良好的抗肿瘤活性。这类双特异抗体对靶向肿瘤细胞的特异性具有较高要求,然而肿瘤特异性pMHC的抗体特异性识别表位仅在多肽部分,这增大了抗体获得的难度。我们通过鼠源免疫噬菌体文库的构建及筛选,建立了抗体筛选及评价方法,可以快速得到可用于初步研究的抗体。本研究从靶点鉴定、抗体筛选、药物设计以及活性评价四个方面系统地研究了以肿瘤特异性pMHC为靶点的抗体类药物,并揭示了影响其活性的相关因素。我们进一步证明了双特异抗体在靶向肿瘤特异性pMHC治疗中的优势,提出肿瘤特异性pMHC靶点在肿瘤治疗中的可行性方案及巨大潜力。
李玲[5]（2021）在《基于PD-L1、HER2联合靶点研究归芪白术方对胃癌细胞增殖和T细胞活性的影响》文中研究说明研究目的:前期研究证实归芪白术方辅助治疗胃癌（Gastric Cancer,GC）有效改善机体不良反应,提高患者的生存质量,但发挥作用的物质基础和分子机制尚不清楚。本研究运用化学信息学-分子对接-分子动力学结合蛋白检测方法及细胞生物学方法,揭示归芪白术方通过健脾扶正促进免疫活性（靶向免疫检查点PD-L1（程序性死亡受体配体1,Programmed cell death ligand 1）调节免疫细胞功能）同时兼备化瘀祛邪抑制肿瘤增殖（靶向HER2（人表皮生长因子受体2,Human epidermal growth factor receptor 2）抑制肿瘤细胞增殖）的药效物质基础,以及探讨该复方“多点显效,协同增效”的功效特点。研究方法:1.结合临床治疗靶向及数据库筛选归芪白术方治疗GC的作用靶点。使用化学信息学方法构建归芪白术方小分子成分结构库,筛选促进肿瘤细胞增殖的HER2和抑制淋巴细胞活性的PD-L1作为研究靶蛋白;确定靶蛋白（HER2/PD-L1）晶体结构及活性位点,应用分子对接技术,筛选能够与靶蛋白有效结合的代表性靶向成分,并进行分子动力学模拟、结合自由能计算和微量热泳动实验（Microscale thermophoresis,MST）,验证其与靶蛋白结合的亲和力,酶活实验检测中药（Traditional Chinese Medicine,TCM）小分子对HER2的作用。2.检测靶向HER2的中药小分子在不同GC细胞株的抗肿瘤效果;使用靶向HER2的中药小分子干预EGF（表皮细胞生长因子,Epidermal growth factor）刺激的胃癌MKN-45细胞,检测其对GC细胞增殖、克隆形成能力以及对PI3K/AKT（磷脂酰肌醇3激酶（Phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K）/蛋白激酶B（Protein kinase B,AKT））通路相关蛋白及基因表达的影响;使用抑制PD-L1的中药小分子干预可溶性PD-L1刺激的人外周血T淋巴细胞,检测其对T细胞增殖、细胞因子IFN-γ/IL-2（干扰素γ（Interferon-gamma,IFN-γ）/白介素2（Interleukin-2,IL-2））表达量、PD-1+（程序性死亡受体1,Programmed cell death protein 1）T细胞数量及T细胞功能相关蛋白、基因表达的影响。3.构建人胃癌MKN-45细胞和人外周血T淋巴细胞共培养体系;使用抑制PD-L1的中药小分子formononetin,靶向HER2的中药小分子quercetin,以及quercetin和formononetin配伍干预共培养体系,检测中药小分子干预对T细胞增殖、细胞因子（IFN-γ/IL-2）表达量、T细胞凋亡的影响,观察中药小分子对共培养体系中T细胞功能抑制的干预作用;同时检测中药小分子对GC细胞增殖、凋亡的影响,研究其对GC细胞增殖的抑制作用。研究结果:1.筛选得到HER2和PD-L1作为研究归芪白术方治疗GC物质基础及作用机制的有效靶点。2.归芪白术方中有385个中药小分子与HER2蛋白对接得分值≤-4,189个中药小分子与PD-L1蛋白对接得分值≤-4。选择对接得分较高的中药小分子进行MST,黄芪中的daidzein（大豆苷元）、黄芪/甘草中的quercetin（槲皮素）与HER2具有较高结合亲和力,Kd值分别为3.7μM/490 n M;黄芪/甘草中的isorhamnetin（异鼠李素）/formononetin（刺芒柄花素）与PD-L1具有较高结合亲和力,Kd值分别为667 n M/355 n M。50 ns分子动力学模拟结果显示quercetin与HER2结合模式较稳定,结合自由能为-26.55 Kcal/mol,formononetin与PD-L1结合模式较稳定,结合自由能为-19.41 Kcal/mol。酶活性检测结果显示quercetin能够明显抑制HER2激酶活性,IC50为570.7 n M,daidzein对HER2没有明显的抑制作用。3.通过单独干预EGF刺激的胃癌MKN-45细胞和PD-L1刺激的人外周血T淋巴细胞,发现quercetin能够抑制EGF诱导的GC细胞增殖和克隆形成（P<0.05）,同时抑制HER2、PI3K、AKT蛋白及基因的表达（P<0.05）。Quercetin可通过阻断PI3K/AKT信号通路抑制GC细胞增殖;formononetin能够一定程度降低PD-1在T淋巴细胞的表达,提高细胞上清液中细胞因子（IFN-γ/IL-2）的表达量,提高PI3K、AKT、p-zap70（T细胞受体相关蛋白激酶70,Zeta chain of T cell receptor associated protein kinase 70）等蛋白的表达（P<0.05）,解除PD-L1导致的T淋巴细胞功能抑制,是通过阻断PD-1/PD-L1信号通路及活化下游PI3K/AKT信号通路实现的。4.靶向HER2和PD-L1的中药小分子配伍干预GC细胞与T淋巴细胞共培养体系,结果显示formononetin、quercetin以及formononetin和quercetin配伍干预能够解除T淋巴细胞增殖抑制、减少T淋巴细胞凋亡、提高细胞因子（IFN-γ/IL-2）表达量、降低PD-1在T淋巴细胞的表达（P<0.05）,并抑制GC细胞增殖（P<0.05）、促进GC细胞凋亡、降低靶蛋白（HER2/PD-L1）在GC细胞的表达,且中药小分子配伍干预效果更好,表明中药小分子配伍干预可以提高共培养体系中的T淋巴细胞活性并且抑制胃癌MKN-45细胞增殖。研究结论:1.分子对接结果从大数据角度初步表明归芪白术方的药效物质基础中既具有可以与促进肿瘤细胞增殖靶蛋白HER2结合的小分子成分,也具有与抑制淋巴细胞活性靶蛋白PD-L1结合的小分子成分,通过“多点显效,协同增效”的功效特点,在阻断HER2抑制肿瘤细胞增殖的同时干预PD-L1通路促进免疫细胞活性;2.细胞生物学研究揭示了归芪白术方“多点显效,协同增效”促进免疫活性并抑制肿瘤的物质基础及健脾化瘀法治疗GC的作用机制;3.揭示中药归芪白术方通过健脾化瘀法治疗胃癌的科学内涵,为归芪白术方的有效性提供更具体的化学、生物信息学支撑,为归芪白术方的开发与转化提供依据,同时为中药复方的现代化研究提供方法学参考。
王傲晨[6]（2021）在《SCAP外泌体通过hsa-piR-15254抑制Th17分化治疗舍格伦综合征的实验研究》文中研究指明目的:舍格伦综合征（Sjogren’s syndrome,SS）是一种以唾液腺进行性分泌功能下降和淋巴细胞浸润为主要病理特征的慢性自身免疫性疾病,主要表现为口干、唾液腺及泪腺肿大,可累及或伴发全身多系统免疫性损害,严重影响患者的生活质量。T淋巴细胞大量浸润和功能异常是SS的重要病理机制,其中辅助性T细胞17（T helper 17,Th17）是一类具有促炎作用的T细胞亚群,在SS的发病和进展过程中起着重要作用。间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）因其具有自我更新、多向分化潜能及免疫调节特性为SS提供了新的治疗方向。MSCs来源的外泌体（exosomes derived from MSCs,MSC-Exo）是MSCs分泌的一种纳米级别的膜性囊泡,具有和MSCs相似的免疫调节能力,对SS具有一定的疗效。根尖牙乳头干细胞（stem cells from apical papilla,SCAP）分离提取于年轻恒牙根尖牙乳头,是神经嵴来源的成体干细胞群,体外扩增能力强,来源充足,获取无医源性创伤,尤其在调控T细胞分化中表现出独特的优势。SCAP来源的外泌体（exosomes derived from SCAP,SCAP-Exo）对SS的治疗效果和作用机制尚不清楚。MSC-Exo中的非编码RNA被认为是其发挥功能的主要物质,其中PIWI-interactingRNA（piRNA）是新发现的一类内源性非编码小RNA,可通过靶向结合mRNA的3’UTR区并诱导其降解,进而调控细胞表型与功能,在自身免疫性疾病的发病和T细胞的分化中均具有重要作用。本实验应用SS小鼠模型,通过尾静脉注射SCAP-Exo,观察其对SS小鼠唾液分泌、颌下腺淋巴细胞浸润水平以及外周血和脾脏内Th17细胞比例的影响;并通过体外实验探究SCAP-Exo及其piRNA对Th17分化的调控作用,为牙源性MSC-Exo应用于SS治疗提供理论基础。研究方法:1.分离提取SCAP,采用流式细胞术、成骨和成脂分化实验对其进行鉴定。采用超高速离心法提取SCAP-Exo,通过纳米颗粒跟踪技术和透射电镜对SCAP-Exo的形态及粒径进行分析;Western blot检测外泌体特异性标记蛋白Alix、CD9、CD63及细胞内质网特异性蛋白Calnexin的表达。2.以NOD/Ltj小鼠作为SS动物模型,检测唾液分泌水平并通过HE染色观察颌下腺淋巴细胞浸润程度,对SS小鼠进行鉴定;尾静脉注射SCAP-Exo,检测唾液分泌水平,ELISA检测血清中IL-17A表达水平,流式细胞术检测脾脏及外周血中Th17亚群比例,HE染色观察颌下腺淋巴细胞浸润程度,免疫荧光染色观察颌下腺Th17细胞浸润程度。3.免疫磁珠法分离外周血中CD4+T细胞,并构建CD4+T细胞向Th17分化的诱导体系,分别加入不同浓度的SCAP-Exo（20,40μg/m L）,流式细胞术检测Th17细胞比例,ELISA检测细胞上清液中IL-17A表达水平,qRT-PCR检测Th17相关基因IL-17A、IL-21、RORγt的mRNA表达水平。4.以骨髓间充质干细胞来源的外泌体（exosomes derived from bone marrow MSCs,BMMSC-Exo）为对照组,对SCAP-Exo和BMMSC-Exo中的piRNA进行高通量测序,统计、分析piRNA表达谱,并对SCAP-Exo中表达量前四十的piRNA进行靶基因预测和生物信息学分析,筛选与Th17分化相关的piRNA。通过数据分析,选取hsa-piR-15254为目标piRNA,IL-6R为其候选靶基因。5.PKH67荧光标记SCAP-Exo,观察SCAP-Exo被CD4+T细胞胞吞情况;SCAP-Exo处理CD4+T细胞,qRT-PCR检测hsa-piR-15254表达水平;双荧光素酶报告基因活性检测hsa-piR-15254与IL-6R mRNA的靶向结合性;构建hsa-piR-15254 mimics及hsa-piR-15254 inhibitor,并加入CD4+T细胞向Th17分化的诱导体系,流式细胞术检测Th17细胞比例,ELISA检测细胞上清液中IL-17A表达水平,qRT-PCR检测IL-6R、IL-17A、IL-21、RORγt的mRNA表达水平。6.应用SPSS 21.0统计软件,两两比较采用方差分析（LSD-t检验）,颌下腺病理评分分级采用秩和检验,P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.SCAP阳性表达间充质干细胞表面标记物CD73、CD90及CD105,不表达造血干细胞表面标记物CD31、CD34、CD45;成脂诱导4周后,可见细胞内脂滴形成;成骨诱导4周后可见矿化结节形成。超高速离心法能够成功从SCAP培养上清中提取SCAP-Exo,粒径大小为30-150 nm,透射电镜下可见SCAP-Exo呈椭圆形杯状囊泡样结构,Western blot显示SCAP-Exo阳性表达Alix、CD9和CD63,而不表达细胞内质网特异性蛋白Calnexin。2.NOD/Ltj小鼠具备SS的病理特征,HE染色可见颌下腺内呈现明显的淋巴细胞浸润灶,唾液分泌量显着低于健康小鼠（P<0.01）。尾静脉注射SCAP-Exo后,SS小鼠唾液分泌水平得到显着改善;HE染色发现颌下腺淋巴细胞浸润团明显减少、缩小,甚至消失;免疫荧光染色发现颌下腺中Th17细胞浸润减少,流式细胞术检测脾脏及外周血中Th17细胞比例下降;ELISA检测血清中IL-17A表达水平降低,且差异均具有统计学意义（P<0.01）。3.免疫磁珠法分离的外周血中CD4+T细胞纯度可达90%以上;20μg/m L、40μg/m L的SCAP-Exo均能抑制CD4+T细胞向Th17分化,细胞上清液中IL-17A浓度及Th17相关基因RORγt、IL-17A、IL-21的mRNA表达水平显着下调;且40μg/m L的SCAP-Exo抑制效果更为明显（P<0.05）。4.高通量测序发现SCAP-Exo中piRNA表达丰富,共发现593种piRNA表达;表达量前四十的piRNA的靶基因与Th17细胞分化相关信号通路呈显着富集关系;其中,hsa-piR-15254在SCAP-Exo中高表达,并且可能靶向抑制Th17细胞分化通路的关键信号IL-6R。故选取hsa-piR-15254作为研究SCAP-Exo调控CD4+T细胞向Th17分化机制的目标piRNA。5.外泌体示踪实验发现荧光标记的SCAP-Exo能够被CD4+T细胞胞吞,并上调CD4+T细胞中hsa-piR-15254的表达;双荧光素酶报告基因检测证实hsa-piR-15254与Th17分化的关键信号IL-6R的mRNA存在靶向结合作用;SCAP-Exo中高表达的hsa-piR-15254可通过靶向结合IL-6R抑制CD4+T细胞向Th17分化,细胞上清液中IL-17A浓度（P<0.05）及Th17相关基因RORγt、IL-17A、IL-21的mRNA表达水平下调（P<0.05）。结论:SCAP-Exo能够改善SS小鼠唾液分泌,减少颌下腺淋巴细胞浸润,降低颌下腺、脾脏以及外周血内Th17细胞亚群比例与血清中IL-17A表达水平;SCAP-Exo能够被CD4+T细胞胞吞并转运hsa-piR-15254,靶向调控IL-6R的表达,抑制CD4+T细胞向Th17分化及Th17相关基因和蛋白表达水平,进而发挥免疫调控作用。
刘航[7]（2021）在《抗CD19和FcγRIIb双特异性抗体（XmAb5871）通过调控B细胞谱系转录因子抑制IgG4相关性疾病中纯真B细胞活化的相关研究》文中研究表明目的:探究人源化抗CD19和FcγRIIb双特异性抗体XmAb5871对IgG4相关性疾病（IgG4-related disease,IgG4-RD）外周循环中纯真B细胞活化通路中染色质可及性和基因表达的相关变化。方法:收集符合入组要求的20例IgG4-RD患者,给予药物XmAb5871治疗前后和治疗后外周血中单个核细胞。运用磷酸化流式细胞术研究IgG4-RD患者外周血中B细胞各个亚群（纯真B细胞亚群;转化记忆B细胞亚群;未转化记忆B细胞亚群;双阴性B细胞亚群）中p BTK和p SYK的表达。运用流式细胞分离术提纯纯真B细胞,运用Assay for transposase-accessible chromatin using sequencing（ATAC-seq）技术研究XmAb5871对纯真B细胞染色质可及性的改变;运用Cleavage under targets and release using nuclease（CUT&RUN）技术进一步确认染色质开放区域的基因组件;运用Whole genome bisulfite sequencing（WGBS）技术探究XmAb5871对纯真B细胞DNA甲基化的改变;运用RNA sequencing（RNA-seq）技术探究XmAb5871对纯真B细胞表达基因组的改变。最后,对转录因子靶数据库ENCODE,基因本体数据库GO和京都基因与基因组百科全书数据库KEGG进行基因组富集分析（PGSEA）对比ATAC-seq数据和RNA-Seq数据,探究发生改变基因的重要生理功能和生物学意义,从进一步探究XmAb5871对B细胞的广泛抑制作用机制。结果:IgG4-RD患者外周血各个亚型B细胞（CD3-CD20+Ig D+CD27-:纯真B细胞亚群;CD3-CD20+Ig D-CD27+:转化记忆B细胞亚群;CD3-CD20+Ig D+CD27+:未转化记忆B细胞亚群;CD3-CD20+Ig D-CD27-:双阴性B细胞亚群）中p BTK在XmAb5871治疗后表达有所降低,而p SYK的表达未见明显改变。ATAC-seq结果显示,大约7000个开放性染色质区域在治疗前后具有明显改变,这些改变区域中对应了708个下调基因和1040个上调基因。开放性染色质区域在ATAC-seq基因组上与对应表达基因距离约为10Kb,此距离相对应的是转录起始位点增强子的区域。CUT&RUN检测再次对开放性染色质区域的转录增强子进行验证。WGBS检测结果显示,治疗前后发生改变开放性染色质区域并无相对应的DNA甲基化的显着改变。RNA-seq结果显示,XmAb5871治疗后检测出808个下调基因和775个上调基因。同时对比分析XmAb5871治疗后ATAC-seq染色质开放性可及性改变的富集分析和RNA-seq基因表达改变的富集分析。结果显示,XmAb5871治疗后的患者表现出EBF,E2A,PAX-5,EBF1,WRNIP1等转录因子的表达降低,ELF1,CHD2,UBTF等转录因子的表达升高。我们进一步利用转录因子靶数据库（Encyclopedia of DNA Element,ENCODE）基因本体数据库（Gene Ontology,GO）和京都基因与基因组百科全书数据库（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）,对比分析XmAB5871治疗后ATAC-seq染色质开放性可及性改变的富集分析和RNA-seq基因表达改变的富集分析。针对ATAC-seq结果,我们在GO数据库中发现富集基因包括:增强细胞骨架形成,减少代谢等;在KEGG数据库中发现富集基因包括:氧化磷酸化,肌动蛋白细胞骨架调节等。针对RNA-seq结果,在KEGG数据库中发现富集基因包括:通过胞浆和细胞膜的细胞间粘附,细胞核有丝分裂和细胞核分裂负调控,染色体分离的负调控,树突细胞形态建成的调控等。结论:XmAb5871以FcγRIIb依赖性方式下调B细胞中BTK磷酸化。在纯真B细胞BCR信号传导中,可观察到用药治疗前后染色质可及性和基因表达水平的改变,而Cp G甲基化则未见明显改变。药物诱导后染色质可及性和表达改变的基因具有转录因子靶标的高度富集特征。XmAb5871改善患者病情与B细胞BCR信号通路,代谢和细胞骨架重组改变的生物学途径中磷酸肌醇水平的变化有关。这可以解释观察到的外周循环B细胞数量的变化,并阐明该药物的广泛抑制作用。此研究为更好的理解IgG4-RD疾病的全貌提供帮助,也为防治纯真B细胞分化为自身抗原所引起的特异性组织浸润性疾病临床治疗提供了理论依据。
曹韪凡[8]（2020）在《靶向CD19抗原的新型嵌合抗原受体NK细胞的优化构建和功能研究》文中研究指明近年来,嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor,CAR）修饰的T细胞为代表的靶向免疫细胞治疗方案受到广泛关注。该技术通过在T细胞中转染并表达人工CAR,促使T细胞可以特异性靶向结合肿瘤表面抗原。同时,利用人工CAR胞内段结构域提供T细胞活化信号,使其成为具有精准靶向性、并持续维持杀伤活性的新一代细胞治疗技术,在多种肿瘤治疗领域特别是血液系统肿瘤的治疗中表现出良好的治疗效果。目前,大多数关于CAR的研究主要集中在T细胞,然而伴随而来的细胞因子风暴、脱靶效应等副作用已成为限制CAR-T细胞临床应用的重要因素。针对这些副作用或缺陷,促使我们将注意力转移到以自然杀伤（natural killer,NK）细胞与因子诱导杀伤细胞为代表的非特异性免疫细胞的人工CAR的改造研究中。NK细胞属于先天固有免疫系统中的重要组成部分,是机体天然免疫屏障中的主要承担者。NK细胞在肿瘤的免疫治疗中具有特殊优势。首先,NK细胞不受主要组织相容性复合体识别限制,并且无需抗原提呈细胞就可以激活自身免疫应答反应;其次,NK细胞在过继性细胞回输疗法中,体内存活周期短,不会诱发抗移植物宿主反应,相较于T细胞,NK细胞诱发因子风暴反应可控。然而人体肿瘤细胞可以通过多种免疫逃逸机制逃避NK细胞非特异杀伤作用,使得NK细胞在肿瘤免疫治疗中的作用受到了制约。基于以上因素和前期我们在CAR-CIK细胞研究工作中的基础与策略,本次在NK细胞中引入CAR的修饰改造,引导NK细胞对血液肿瘤细胞靶向杀伤,同时利用CAR胞内段细胞活化信号结构域的表达来增强免疫细胞自身的活性。以B淋巴细胞白血病的特异性靶标CD19为靶点,针对不同来源的NK细胞生物学特点,开展了人工CAR胞内段和跨膜区的改造工作。在胞内段优化过程中,将具有NK细胞活化功能的含有IL-15分子、4-1BB细胞共刺激信号分子、CD3 ζ链胞内区分子、CD8引导链和Kozak序列等胞内段活化结构域相关分子序列进行串联整合,融入到CAR结构中,制备特性化针对NK细胞的人工CAR重组质粒,然后通过病毒载体,在体外进行转导,成功构建出带有靶向识别杀伤功能的人工CAR修饰的NK细胞。同时,优化了 NK细胞体外培养与活化体系,为后续大剂量的细胞制备,开展体外、体内试验以及未来临床试验和应用奠定了基础。在此基础上,为了进一步检验人工CAR修饰细胞的靶向杀伤能力,采用乳酸脱氢酶法、杀伤因子检测和流式细胞检测等多种方法,对构建的CAR-CIK、CAR-NK-92、CAR-NK细胞杀伤效果进行了验证与分析评估。利用药效学,研究分析了我们构建的人工CAR修饰细胞在小鼠急性B淋巴细胞白血病模型中的靶向杀伤作用以及安全性。结果表明,构建的人工CAR修饰细胞具有明显的靶向杀伤能力和可靠的生物安全性。此外,利用单细胞转录组测序技术和基因表达水平以及生物信息学分析,研究脐血NK细胞分别在人工CAR载体转导前后以及增殖过程中基因的表达谱变化。结果显示,以CX3CR1为代表的功能成熟的NK细胞基因高表达,而且具有独特的转录特性,探讨了 NK细胞的发育生物学的分子机制,并针对CD19-CAR-NK细胞技术的临床应用研究进行了再设计与评估。本项研究的创新点在于尝试突破人工CAR细胞方法改造非特异性细胞的技术瓶颈,构建出一套创新优化的CAR-NK制备体系,为拓展人工CAR细胞治疗方案提供技术支撑;改造了 CAR胞内段细胞活化信号分子,以及验证了 CD19-CAR-NK细胞的成药性、有效性以及安全性;这将有利于CAR相关技术在免疫治疗过程中发挥更重要的作用,并为进一步的临床应用研究提供新方法和新思路。主要结果:1.构建了基于CAR-T技术的靶向CD19的CAR-CIK细胞、CAR-NK-92细胞制备体系。2.构建了基于脐血来源的NK细胞靶向CD19的新型CAR-NK细胞技术体系。3.体外实验验证了 CD19-CAR-NK具有显着的靶向细胞杀伤功能,并呈现剂量依赖性特点,特异性杀伤效果明显。4.探索了 CAR-NK细胞最佳NK细胞转导方法,可使用慢病毒载体或逆转录病毒载体对NK细胞进行转导。通过优化的培养体系培养的NK细胞可以获得更好的转导效率。5.利用单细胞测序技术,探讨了脐血NK细胞分别在CAR转导前后以及增殖过程中基因表达谱变化,以CX3CR1为代表的功能成熟NK细胞基因高表达转录特性。6.B淋巴细胞白血病小鼠模型研究结果表明,CD19-CAR-NK细胞在回输后第7天抑瘤率为61%,远高于对照组抑瘤率12%。未产生相关毒性以及致瘤致畸等不良情况,验证了 CD19-CAR-NK细胞具有良好的生物安全性及有效性。
薛明[9]（2020）在《间充质干细胞对脂多糖-低氧诱导的Treg/Th17分化失衡的调控作用及其机制研究》文中认为第一部分高脂多糖合并低氧特征的严重感染患者外周血T细胞分化相关基因表达特点目的:探讨高脂多糖合并低氧特征的严重感染患者外周血T细胞分化相关基因表达特点方法:回顾性分析东南大学附属中大医院重症医学科临床数据库中符合社区获得性严重感染诊断的病例资料,根据入院时血浆脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）水平及氧合指数（Partial Pressure of Oxygen/Fraction of inspiration O2,Pa O2/Fi O2,P/F）进行分组:LPS>10pg/ml且P/F≤200mm Hg为高LPS合并低氧组,LPS≤10pg/ml且P/F>200mm Hg为对照组,记录基本资料、感染部位及可能的致病菌、入组时合并的器官功能障碍、器官支持技术及支持条件（如是否存在急性肾损伤、是否需要肾脏替代治疗及条件等）,病情严重程度评分如:序贯器官衰竭评估评分、急性生理和慢性健康评估Ⅱ评分,入院后24小时内免疫炎症指标（白细胞计数、淋巴细胞计数、降钙素原、超敏C反应蛋白、白介素-6）,采用Human Lnc RNA Microarray V4.0芯片检测全血m RNA表达,利用NCBI、GO、STRING数据库对T细胞相关基因进行差异性表达分析及生物学功能富集及。结果:（1）一般情况:高LPS合并低氧组纳入9例,对照组纳入6例。高LPS合并低氧组患者血浆LPS水平显着高于对照组（66.25[16.05,97.48]vs.5.00[5.00,6.38]pg/ml,P=0.003）,高LPS合并低氧组患者P/F显着低于对照组（129±62 vs.346±55 mm Hg,P<0.001）;（2）疾病严重程度与器官功能损伤:高LPS合并低氧组患者肌酐水平（164[79,332]vs.60[55,105]umol/L,P=0.017）、乳酸水平（2.2[1.5,3.4]vs.1.2[0.8,2.0]mmol/L,P=0.039）显着高于对照组组,其SOFA评分更高（11±4 vs.7±1,P=0.046）,提示高LPS合并低氧特征患者病情严重程度更重;（3）免疫炎症指标:与对照组组比较,高LPS合并低氧组患者外周血淋巴细胞水平显着降低（0.4[0.3,0.6]vs.0.8[0.5,1.2]/μL,P=0.020）,中性粒细胞与淋巴细胞计数比值显着上升（17.9[7.1,23.4]vs.6.8[2.9,12.3],P=0.050）,全身性炎症指标（体温、心率、呼吸频率、白细胞计数）、外周血降钙素原、超敏C反应蛋白、白介素-6水平无明显差异;（4）低氧信号通路:外周血芯片检测提示差异性基因在低氧信号通路存在富集,高LPS合并低氧组患者外周血细胞低氧反应相关基因表达显着上调（P<0.05）;（5）T细胞分化相关基因表达分析:与对照组比较,高LPS合并低氧组Th17正向转录调控基因STAT3（P=0.006）及BATF（P=0.014）,受体活化基因TLR2及细胞因子及其受体相关基因FABP5（P=0.016）及IL6ST（P=0.046）表达显着上调,Th17负向信号转导基因STAT5A（P=0.045）及PPARG（P=0.049）表达显着下调,提示分化为Th17表型的细胞增加;Treg功能相关基因TET3（P=0.004）表达显着下调,提示分化为Treg表型的细胞减少。结论:高LPS合并低氧的严重感染患者疾病严重程度与器官功能损伤更重,外周血淋巴细胞降低更明显。其外周血细胞中Treg分化相关基因表达受抑,提示分化为Treg表型的细胞减少;Th17型分化相关基因表达增强,提示分化为Th17表型的细胞增加,导致Treg/Th17分化失衡。第二部分间充质干细胞处理对脂多糖-低氧诱导Treg/Th17分化失衡的影响目的:建立LPS-低氧诱导的Treg/Th17分化失衡体外细胞模型,探讨间充质干细胞（Mesenchymal stem cell,MSC）处理对Treg/Th17分化平衡的影响方法:分离C57BL/6小鼠脾脏获得单细胞悬液,以磁珠纯化获得CD4+T细胞,予生理条件anti-CD3（5ug/ml）及anti-CD28（2ug/ml）活化刺激过夜,加入或不加入RAW264.7巨噬细胞（抗原提呈）进行单独或共培养。根据不同刺激条件分组:无刺激对照组,LPS（终浓度0、10、100、1000ng/ml）刺激组,低氧（5%氧浓度）刺激组,LPS（不同浓度）-低氧共同刺激组。在LPS（100ng/ml）+低氧刺激条件下,通过transwell小室设置与MSC（鼠源性,Cyagen Biosciences,Inc.）直接共培养、间接共培养48小时,实施:（1）细胞样本Annexin V染色,流式细胞法检测T细胞存活率;（2）流式细胞法检测细胞样本中Treg、Th17亚群分化情况,以核染色CD25+Foxp3+鉴定Treg,以核内染色CD8-IL-17a+鉴定Th17细胞。结果:（1）单纯LPS刺激对CD4+T细胞的影响:与无刺激对照组相比,LPS刺激浓度10ng/ml组与100ng/ml组的CD4+T细胞存活比例、Treg分化比例均显着下降（均P<0.05）,Th17分化比例均显着升高（均P<0.05）,LPS刺激浓度100ng/ml与1000ng/ml两组间CD4+T细胞存活比例、Treg分化比例、Th17分化比例均无差异;LPS刺激各组（10、100、1000ng/ml）中Treg/Th17比值均显着高于无刺激组（均P<0.001）;（2）单纯低氧刺激对CD4+T细胞的影响:与无刺激组相比,低氧刺激组CD4+T细胞存活无显着影响,Treg分化比例显着降低（P<0.05）,Th17显着升高（P<0.05）;（3）LPS-低氧刺激对CD4+T细胞的影响:与无刺激组相比,在低氧基础上予各浓度LPS刺激,CD4+T细胞存活、Treg分化比例均显着下降（均P<0.05）,Th17分化比例均显着升高（均P<0.05）,但低于各浓度LPS刺激组;与无刺激组相比,各浓度LPS合并低氧刺激时Treg/Th17比例均显着降低（均P<0.001）;LPS浓度为10ng/ml时,LPS-低氧刺激组Treg/Th17比值较单纯LPS刺激者（即LPS刺激浓度10ng/ml组）显着降低,其余浓度LPS刺激组与LPS-低氧刺激组的Treg/Th17比值未见差异。（4）MSC处理对LPS-低氧刺激下CD4+T细胞的影响:与LPS-低氧刺激组相比,MSC处理显着改善LPS-低氧刺激所致的Treg分化比例下降与Th17分化比例增加,使Treg/Th17比值升高（P<0.05）,MSC直接处理或间接处理时Treg/Th17比值未见差异。结论:LPS-低氧可诱导Treg/Th17分化失衡;MSC处理可改善LPS-低氧刺激所致的Treg/Th17分化失衡,该作用不依赖细胞直接接触机制。第三部分间充质干细胞调控脂多糖-低氧诱导Treg/Th17分化平衡的机制研究目的:探讨MSC调控LPS-低氧刺激下Treg/Th17分化平衡的分子机制方法:在transwell小室下层种植小鼠脾源性CD4+T细胞,上层加入MSC（鼠源性,Cyagen Biosciences,Inc.）进行间接共培养,培养液中加入LPS（终浓度100ng/ml）,置于5%O2低氧条件培养,以抗TGF-β1（10ug/ml）中和抗体明确MSC分泌的TGF-β1对Treg/Th17分化的影响;微小RNA（micro RNA,mi R）-155 mimic或mimic control转染CD4+T细胞4小时后移至tranwell小室,在LPS（100ng/ml）、5%O2低氧条件下与MSC间接共培养,48小时后实施:（1）酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测培养液上清中促炎型细胞因子IL-17A、INF-γ、IL-21与抗炎型细胞因子TGF-β1、IL-10水平;（2）RT-PCR法检测mi R-155、Tgfb1、Rorc、Foxp3及Ptpn2 m RNA表达状况;（3）流式细胞法检测细胞样本中Treg、Th17亚群分化情况,以核染色CD25+Foxp3+鉴定Treg,以核内染色CD8-IL-17a+鉴定Th17细胞;（4）细胞样本进行Annexin V/PI染色,流式细胞法检测CD4+T细胞存活率;（5）细胞样本进行CTV染色,72小时后流式细胞法检测mi R-155mimic/inhibitor转染后对CD4+T细胞增殖能力。结果:（1）MSC处理对LPS-低氧刺激下培养液上清中细胞因子分泌的影响:与无MSC处理相比,MSC处理培养液中TGF-β1、IL-17、IL-10分泌水平均显着升高（均P<0.05）;（2）抗TGF-β1阻断LPS-低氧刺激下MSC间接共培养对Treg/Th17分化平衡的影响:与MSC处理相比,抗TGF-β1抗体可明显抑制LPS-低氧刺激环境下MSC对Treg/Th17失衡的调控作用（P<0.05）,即MSC增加Treg、降低Th17的作用消失;（3）MSC分泌TGF-β1对LPS-低氧刺激下CD4+T细胞mi R-155表达的影响:LPS-低氧刺激可显着提高CD4+T细胞mi R-155表达（P<0.05）,与MSC未处理相比,MSC间接共培养处理可抑制CD4+T细胞mi R-155表达,而抗TGF-β1可明显阻断MSC间接共培养对CD4+T细胞mi R-155表达的抑制作用（P<0.05）;（4）mi R-155转染对LPS-低氧刺激下MSC间接处理CD4+T细胞调控Treg/Th17分化平衡的影响:CD4+T过表达mi R-155时,MSC间接处理对LPS-低氧诱导的Treg/Th17失衡的调控作用受到抑制,同时Treg型转录因子Foxp3、Ptpn2 m RNA表达明显降低（P<0.05）、Th17型转录因子Rorc m RNA表达增加（P<0.05）;（5）mi R-155过表达转染对LPS-低氧刺激下MSC间接处理体系中CD4+T细胞增殖与凋亡的影响:与对照组相比,mi R-155过表达转染对LPS-低氧刺激下MSC处理后的CD4+T细胞存活、增殖无明显影响（P>0.05）。结论:TGF-β1是MSC通过旁分泌作用调控LPS-低氧诱导Treg/Th17分化失衡的因子或因子之一,通过抑制LPS-低氧诱导的CD4+T细胞mi R-155表达、加强Treg细胞型相关转录因子Ptpn2与Foxp3 m RNA表达,抑制Th17型相关转录因子Rorc m RNA表达,促进Treg/Th17分化平衡。
陈红梅[10]（2020）在《通过瘤内递送CCL25募集CCR9+T细胞增强三阴性乳腺癌免疫治疗作用的研究》文中研究指明研究背景与目的:胸腺表达的趋化因子（TECK,CCL25）,是一种由小肠上皮细胞、胸腺上皮细胞及髓质树突状细胞表达和分泌的趋化因子,通过与其唯一的受体CCR9结合,对胸腺细胞、淋巴细胞、树突状细胞和活化的巨噬细胞发挥趋化作用。最初,CCR9在调节胸腺细胞定位并促进其发育、成熟以及促进细胞向肠道归巢方面的功能得到了全面的研究。最近的研究表明,正常小肠和肠系膜淋巴结中的CCR9+T细胞高表达CD69,而且血液循环中的CCR9+T细胞活化程度高于CCR9-细胞。另外,从外周血和小肠中分离出的CCR9+T细胞主要表达产生IFNγ的Th1细胞因子谱。Hepatic等先前发现,原发性硬化性胆管炎患者肝脏中有激活的功能性CCR9+T细胞浸润,这与病变部位（肠外和胸腺外）CCL25的异常高表达有关。CCL25/CCR9还具有授权效应性/记忆性T细胞到达组织的强大功能。CCR9与CCL25的结合还可以抑制CD4+T细胞向调节性T细胞（Treg）分化。在自身免疫中,CCR9+辅助性T细胞通过分泌IL-21促进CD8+T细胞的增殖和存活进而诱导糖尿病。重要的是,患者外周循环血中的CD8+CCR9+的初始T细胞与黑色素瘤患者的良好预后和肺转移灶减少有关。在小鼠CCL25转基因肉瘤模型中,给予小鼠CCL25抗体清除体内CCL25可加速肿瘤的生长。因此,我们假设将CCL25递送到肿瘤并释放到细胞间隙,是一种可以增强免疫调节剂抗肿瘤作用的有效策略。多种不同实体瘤（包括三阴性乳腺癌）通过过度表达CD47分子向吞噬细胞传递“不要吃我”的信号,帮助它们逃避免疫系统的监视。用抗体阻断CD47分子可增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬功能,还可促进树突状细胞启动T细胞依赖的抗肿瘤免疫反应。然而,由于CD47分子也在红细胞、血小板等造血系统来源的细胞和其他正常细胞表面表达,CD47抗体全身给药后会影响正常细胞功能,并导致贫血、中性粒细胞减低等副作用的发生。利用纳米载体递送靶向CD47的小干扰RNA（siCD47）被证明可以有效抑制黑色素瘤的原位生长和肺转移并降低副作用。然而,向肿瘤靶向递送基于RNA的癌症治疗药物仍然是一个挑战。两种不同机制的治疗方法相结合已被证明能够协同作用阻止癌症的发展,为肿瘤治疗提供了一种有希望的策略。以纳米技术为基础的递送系统可以利用物理作用包载不同种类的抗肿瘤药物,通过高通透性和滞留效应（EPR）改善了药物的药代动力学和生物分布特征,从而潜在地提高抗癌效果。然而,应注意的是,趋化因子CCL25和CD47 si RNA的物理性质是非常不同的,到达肿瘤组织后它们应分别被释放在细胞外和细胞内。为了获得令人满意的疗效,一个理想的基于纳米技术的全身给药系统应具有许多特性,主要包括:（1）促进药物在肿瘤中的富集;（2）趋化因子快速而充分地释放在细胞外;（3）si RNA的释放和细胞内化。因此,我们迫切需要设计一种新型的药物传递系统,该系统应满足上述所有特性,以增强TNBC的免疫治疗效果。研究方法:1.建立小鼠的原位三阴性乳腺癌（4T1）模型,利用免疫组化和流式的方法检测人和小鼠三阴性乳腺癌中是否表达CCL25和CCR9。2.合成包载siCD47和CCL25的肿瘤酸敏感的纳米颗粒NP-siCD47/CCL25。3.通过流式细胞术（FC）、激光共聚焦荧光显微镜（LSCM）呈像和实时定量PCR（q PCR）、蛋白质印迹（WB）等方法检测在体外中性和弱酸性条件下细胞对siCD47和CCL25的摄取,以及siCD47的沉默效率。4.利用小动物呈像、LSCM呈像和免疫组化方法检测siCD47和CCL25的体内及瘤内分布。5.通过流式细胞术和免疫组化等方法进一步检测在体内CCL25对肿瘤免疫微环境的影响和肿瘤细胞CD47的表达。6.观察静脉注射NP-siCD47/CCL25对4T1肿瘤原位生长和远处转移的影响并利用流式细胞术检测了抗肿瘤的免疫反应机制。观察NP-siCD47/CCL25对PD-1/PD-L1抗体治疗效果的影响。研究结果:1.TNBC和健康人外周血单个核细胞中CCR9+T细胞的比例较低且无明显差异。人TNBC组织和小鼠4T1肿瘤组织不表达CCL25。人TNBC组织不表达CCR9,小鼠4T1的TILs中CCR9+细胞比例较低。CCR9+T细胞中活化细胞的比例明显高于CCR9-T细胞。2.在体外中性条件下,标记siCD47和CCL25的荧光信号共定位。酸性条件下,两者分离。4T1细胞对siCD47的吞噬在弱酸性条件下强于中性条件。酸性条件下siCD47的沉默效率高于中性条件。3.在体内,颗粒将CCL25释放在肿瘤间质细胞外,并募集CCR9+CD8+T细胞进入肿瘤组织。而siCD47进入肿瘤细胞,降低了肿瘤细胞表面CD47的表达。4.NP-siCD47/CCL25能延缓原位4T1肿瘤形成并抑制已形成的肿瘤组织生长。全身给药后,颗粒能够抑制4T1肿瘤细胞的肺转移。而NP-siCD47或NPsi NC/CCL25单药没有作用。5.NP-siCD47/CCL25抗肿瘤作用依赖于T细胞的作用,颗粒能够减少肿瘤组织中骨髓来源的抑制细胞（MDSCs）,增加CD8+T细胞浸润。6.NP-siCD47/CCL25能逆转PD-1/PD-L1抗体耐药,而PD-1/PD-L1抗体能增强NP-siCD47/CCL25的抗肿瘤作用。NP-si NC/CCL25单药即可以逆转PD-L1抗体耐药。研究结论:1.CCR9+CD8+T细胞表现为活化的细胞表型,但在三阴性乳腺癌组织中浸润的数量有限。人和小鼠的4T1三阴性乳腺癌组织不表达CCR9的配体CCL25。2.肿瘤酸敏感的纳米颗粒NP-siCD47/CCL25在体内可以募集CCR9+CD8+T细胞浸润到肿瘤组织,同时降低肿瘤细胞CD47表达。3.NP-siCD47/CCL25抑制4T1肿瘤形成、生长和远处转移的作用依赖于CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫反应。4.NP-si NC/CCL25可以逆转PD-L1单抗耐药,NP-siCD47/CCL25和PD-1/PD-L1单抗协同作用,显着增强了4T1肿瘤的免疫治疗作用。
二、DESIGN OF ANTI-CD3 ScFv-B7.1 FUSION MOLECULE AND PREDICTION OF ITS BIOLOGICAL CHARACTERISTICS（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、DESIGN OF ANTI-CD3 ScFv-B7.1 FUSION MOLECULE AND PREDICTION OF ITS BIOLOGICAL CHARACTERISTICS（论文提纲范文）
（1）泛实体瘤相关抗原图谱的构建及其在抗体偶联药物和嵌合抗原受体T细胞上的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 抗体偶联药物的知识现状 |
| 引言 |
| 1.1.1 ADC发展简史 |
| 1.1.2 获得监管批准的上市ADC |
| 1.1.3 临床试验中的在研ADC及其靶标图谱 |
| 1.1.4 抗体骨架和靶标的选择 |
| 1.1.5 连接子类型和偶联技术 |
| 1.1.6 有效载荷 |
| 1.1.7 ADC在体内的工作原理 |
| 1.1.8 ADC对难治性癌症的治疗 |
| 1.1.9 ADC的毒性问题 |
| 1.1.10 ADC耐药机制 |
| 1.1.11 未来展望 |
| 1.2 嵌合抗原受体T细胞的知识现状 |
| 引言 |
| 1.2.1 CAR-T发展简史 |
| 1.2.2 CAR-T细胞的工作原理 |
| 1.2.3 CAR和T细胞受体的结构 |
| 1.2.4 获得监管批准的CAR-T |
| 1.2.5 CAR-T细胞疗法的毒性 |
| 1.2.6 未来挑战、机会和应用 |
| 1.3 本课题的研究目标 |
| 第二章 基于多组学构建泛实体瘤相关抗原图谱 |
| 引言 |
| 2.1 数据采集与分析方法 |
| 2.1.1 正常组织转录组和蛋白组的数据采集 |
| 2.1.2 蛋白质亚细胞定位数据的采集与编译 |
| 2.1.3 人体组织器官的重排与映射 |
| 2.1.4 正常组织的表达及其分级 |
| 2.1.5 基因在肿瘤及其癌旁组织之间的差异表达分析 |
| 2.1.6 基因在肿瘤与其他正常组织之间的差异表达分析 |
| 2.1.7 肿瘤组织转录组、基因组和表型数据的编译 |
| 2.1.8 功能相关突变的注释 |
| 2.1.9 预测肿瘤相关抗原的蛋白过表达率 |
| 2.1.10 肿瘤相关抗原与癌细胞功能状态的相关性分析 |
| 2.1.11 基因集富集得分分析 |
| 2.1.12 临床试验的检索策略 |
| 2.1.13 统计分析 |
| 2.2 分析结果 |
| 2.2.1 组装综合数据集并通过算法识别肿瘤相关抗原 |
| 2.2.2 肿瘤相关抗原的表达谱与差异表达谱 |
| 2.2.3 肿瘤相关抗原的异质表达谱 |
| 2.2.4 预测肿瘤相关抗原的蛋白过表达率 |
| 2.2.5 癌症驱动基因变异全景 |
| 2.2.6 候选肿瘤相关抗原的组合评估 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 靶向CDH17 的新型ADC的制备及抗结直肠癌活性研究 |
| 引言 |
| 3.1 实验动物 |
| 3.2 实验仪器及试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 TCGA与 GTEx中 CDH17的m RNA数据的获取与分析 |
| 3.3.2 免疫原的设计与制备 |
| 3.3.3 制备靶向CDH17 的单克隆抗体的免疫方案 |
| 3.3.4 抗体可变区基因测序 |
| 3.3.5 鼠-人嵌合抗体的构建与表达纯化 |
| 3.3.6 抗体结合亲和力的测定 |
| 3.3.7 CDH17 靶向抗体偶联vc MMAE |
| 3.3.8 细胞内吞实验 |
| 3.3.9 细胞膜蛋白的提取 |
| 3.3.10 免疫沉淀 |
| 3.3.11 免疫沉淀产物的银染 |
| 3.3.12 蛋白免疫印迹 |
| 3.3.13 免疫组化 |
| 3.3.14 免疫荧光 |
| 3.3.15 流式细胞实验 |
| 3.3.16 体外细胞毒性实验 |
| 3.3.17 体内抑瘤活性实验 |
| 3.3.18 统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 CDH17 在消化道肿瘤和正常组织中的表达 |
| 3.4.2 CDH17 靶向抗体的多重表征 |
| 3.4.3 CDH17 靶向ADC的制备与表征 |
| 3.4.4 CDH17 靶向ADC在体外的抗肿瘤活性 |
| 3.4.5 CDH17 靶向ADC在 KM12SM结肠癌异种移植模型中的抗肿瘤活性 |
| 3.4.6 CDH17 靶向ADC在 COLO205 结肠癌异种移植模型中的抗肿瘤活性 |
| 3.4.7 荷瘤小鼠对CDH17 靶向ADC的耐受性 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 靶向LYPD3的CAR-T细胞的抗肺腺癌活性研究 |
| 引言 |
| 4.1 实验动物 |
| 4.2 试剂耗材及设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 TCGA与 GTEx中 LYPD3 m RNA数据的获取与分析 |
| 4.3.2 抗体人源化 |
| 4.3.3 慢病毒包装 |
| 4.3.4 CD3+T细胞的复苏与激活 |
| 4.3.5 CD3+T细胞慢病毒感染 |
| 4.3.6 CAR-T细胞分化与耗竭的检测 |
| 4.3.7 CAR-T体外细胞杀伤 |
| 4.3.8 CAR-T体内活性实验 |
| 4.3.9 细胞因子的检测 |
| 4.3.10 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 LYPD3 蛋白在肿瘤和正常组织中的表达 |
| 4.4.2 LYPD3 靶向的CAR-T细胞的体外抗肿瘤活性 |
| 4.4.3 LYPD3 靶向的CAR-T细胞在PC9 肺腺癌异种移植模型中抗肿瘤活性 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）人胎肝间充质干细胞与成人骨髓间充质干细胞的免疫调节功能的比较研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述:不同来源间充质干细胞在再生医学中的应用 |
| 参考文献 |
| 附录一 耗材与试剂 |
| 附录二 主要的溶液的配制 |
| 附录三 常见的英文缩写和代码 |
| 附录四 在学期间发表文章 |
| 附录五 在学期间参与课题 |
| 致谢及憧憬 |
（3）T细胞免疫检查点CD226/TIGIT在原发性胆汁性胆管炎发病机制中的作用研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1. 研究背景 |
| 1.1 原发性胆汁性胆管炎 |
| 1.2 CD226/TIGIT免疫检查点 |
| 1.3 PBC与CD226/TIGIT免疫检查点 |
| 2. 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 研究对象 |
| 2.3 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 基本资料 |
| 3.2 外周血T淋巴细胞CD226/TIGIT表型 |
| 3.3 各CD226/TIGIT表型T细胞的临床相关性分析 |
| 3.4 基于CD226/TIGIT细胞亚群的组间差异分析模型 |
| 3.5 各表型细胞功能和活化状态的分析 |
| 3.6 血清游离CD226和CD155检测 |
| 3.7 体外干预淋巴细胞CD226/TIGIT通路 |
| 3.8 肝脏组织浸润淋巴细胞CD226/TIGIT染色 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 PBC患者T细胞CD226/TIGIT通路活跃 |
| 4.2 PBC患者CD8+T细胞的CD226/TIGIT通路存在失衡现象 |
| 4.3 CD226/TIGIT失衡参与PBC发生发展的潜在路径 |
| 4.4 CD8+T细胞是CD226/TIGIT介导PBC疾病的关键点 |
| 4.5 CD226/TIGIT通路为PBC潜在标志物 |
| 4.6 CD226/TIGIT有潜在PBC治疗靶点价值 |
| 4.7 研究的不足之处 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 共抑制受体TIGIT与自身免疫病 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 致谢 |
（4）肿瘤特异性递呈抗原作为抗体类药物靶点的可行性初探（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写、符号清单、术语表 |
| 引言 |
| 第一章 融合蛋白BCR-ABL的特异性递呈片段预测及鉴定 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验材料及基本操作 |
| 1.3 实验步骤和方法 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.5 总结与讨论 |
| 第二章 以A9K-pMHC为靶点的鼠源噬菌体免疫文库的构建及特异性抗体筛选评价 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料及基本操作 |
| 2.3 实验步骤和方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 总结与讨论 |
| 第三章 靶向A9K-pMHC的抗体类药物制备及其体外活性研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料及基本操作 |
| 3.3 实验步骤和方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 总结与讨论 |
| 第四章 高特异性抗体靶向HLA-A*02:01/KRAS G12V的双特异形式制备及其抗肿瘤活性研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料及基本操作 |
| 4.3 实验步骤和方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.5 总结与讨论 |
| 论文总结 |
| 论文创新点及不足之处 |
| 参考文献 |
| 综述 类T细胞受体抗体药物的研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在读期间主要研究成果 |
（5）基于PD-L1、HER2联合靶点研究归芪白术方对胃癌细胞增殖和T细胞活性的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 缩略词表 |
| 第一章:基于分子对接虚拟筛选归芪白术方中可与胃癌治疗靶点结合的小分子成分 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验软件和数据库 |
| 1.1.2 主要试剂、仪器 |
| 1.1.3 胃癌靶向治疗靶点筛选 |
| 1.1.4 归芪白术方中药小分子结构库构建及类药性分析 |
| 1.1.5 靶蛋白活性位点 |
| 1.1.6 分子对接 |
| 1.1.7 微量热泳动实验测定虚拟筛选获得成分与靶蛋白的亲和力 |
| 1.1.8 分子动力学模拟和结合自由能计算 |
| 1.1.9 靶向成分的毒性预测 |
| 1.1.10 靶向HER2的小分子成分对HER2激酶活性的检测 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 胃癌治疗靶点筛选 |
| 1.2.2 归芪白术方小分子成分类药性分析 |
| 1.2.3 靶蛋白晶体结构确定 |
| 1.2.4 分子对接 |
| 1.2.5 MST测定虚拟筛选获得小分子成分与靶蛋白的亲和力 |
| 1.2.6 分子动力学模拟和结合自由能计算结果 |
| 1.2.7 代表性成分quercetin、daidzein、formononetin和 isorhamnetin毒性预测 |
| 1.2.8 Quercetin和daidzein对HER2激酶活性影响 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 HER2与PD-L1在胃癌表达的相关性分析 |
| 1.3.2 归芪白术方治疗胃癌的物质基础分析 |
| 1.3.3 分子对接-MST-分子动力学模拟-HER2激酶活性检测结果分析 |
| 1.4 小结 |
| 第二章:归芪白术方代表性中药小分子成分对胃癌细胞和T淋巴细胞的作用及机制 |
| 2.1 材料和试剂 |
| 2.1.1 实验细胞株 |
| 2.1.2 试剂与耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 靶向HER2的代表性成分quercetin和daidzein抗胃癌细胞增殖实验 |
| 2.2.2 胃癌细胞株的选择 |
| 2.2.3 靶向HER2的代表性成分quercetin和daidzein对胃癌细胞的干预作用 |
| 2.2.4 人外周血T淋巴细胞的分离与活化 |
| 2.2.5 抑制PD-L1的代表性成分formononetin和isorhamnetin对PD-L1干预T细胞的作用 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 靶向HER2的代表性成分quercetin和daidzein对不同胃癌细胞的抗增殖作用 |
| 2.3.2 胃癌细胞株的选择 |
| 2.3.3 靶向HER2的代表性成分quercetin和daidzein对胃癌MKN-45细胞干预作用 |
| 2.3.4 T淋巴细胞的分离与活化 |
| 2.3.5 PD-L1刺激T淋巴细胞及干预实验 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 靶向HER2的代表性成分quercettin、daidzein抑制胃癌细胞增殖结果分析 |
| 2.4.2 代表性成分Formononetin、isorhamnetin对T淋巴细胞活性的恢复作用 |
| 2.4.3 健脾扶正、化瘀祛邪治疗胃癌的中医认识 |
| 2.5 小结 |
| 第三章:归芪白术方体外有效的代表性中药小分子对胃癌细胞和T淋巴细胞共培养体系的调节作用 |
| 3.1 材料和试剂 |
| 3.1.1 细胞株 |
| 3.1.2 试剂与仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 胃癌MKN-45和T淋巴细胞共培养体系构建 |
| 3.2.2 体外有效的代表性成分quercetin和formononetin配伍干预T淋巴细胞与胃癌MKN-45 细胞共培养体系 |
| 3.2.3 体外有效的代表性成分quercetin和formononetin配伍干预共培养体系后细胞形态学观察和T淋巴细胞、胃癌MKN-45 细胞增殖情况 |
| 3.2.4 流式细胞术检测体外有效的代表性成分quercetin和 formononetin配伍干预共培养体系后T淋巴细胞和胃癌MKN-45 细胞凋亡情况 |
| 3.2.5 体外有效的代表性成分quercetin和formononetin配伍干预共培养体系后T淋巴细胞PD-1 表达情况 |
| 3.2.6 体外有效的代表性成分quercetin和formononetin配伍干预共培养体系后细胞上清液中细胞因子表达情况 |
| 3.2.7 体外有效的代表性成分quercetin和formononetin配伍干预共培养体系后T淋巴细胞和胃癌MKN-45 细胞相关蛋白表达情况 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 胃癌MKN-45细胞与T淋巴细胞共培养体系的建立 |
| 3.3.2 体外有效的代表性成分quercetin和formononetin配伍干预共培养体系 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 胃癌MKN-45 细胞与T淋巴细胞共培养体系构建结果分析 |
| 3.4.2 体外有效的代表性成分quercetin和formononetin配伍干预共培养体系结果分析 |
| 3.5 小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 论文综述 HER2、PD-L1生物学特性及在胃癌的相关性和应用研究 |
| 参考文献 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（6）SCAP外泌体通过hsa-piR-15254抑制Th17分化治疗舍格伦综合征的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 SCAP外泌体抑制Th17分化治疗舍格伦综合征的实验研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 人SCAP原代细胞分离培养与鉴定 |
| 2.2.2 SCAP-Exo的分离提取与鉴定 |
| 2.2.3 SS动物模型的建立 |
| 2.2.4 SCAP-Exo对 SS小鼠唾液流率的影响 |
| 2.2.5 外周血、脾脏及颌下腺的采集 |
| 2.2.6 SCAP-Exo对 SS小鼠外周血血清中IL-17A表达水平的影响 |
| 2.2.7 SCAP-Exo对 SS小鼠外周血中Th17 比例的影响 |
| 2.2.8 SCAP-Exo对 SS小鼠脾脏中Th17 比例的影响 |
| 2.2.9 SCAP-Exo对 SS小鼠颌下腺的组织学改变 |
| 2.2.10 SCAP-Exo对 SS小鼠颌下腺中Th17 细胞浸润的影响 |
| 2.2.11 人外周血CD4~+T细胞的分离培养与鉴定 |
| 2.2.12 构建人CD4~+T细胞向Th17 分化的诱导体系 |
| 2.2.13 SCAP-Exo对 Th17 细胞相关蛋白、基因表达水平的影响 |
| 2.2.14 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 人SCAP原代培养与鉴定 |
| 3.2 SCAP-Exo的鉴定 |
| 3.3 SS小鼠模型建立 |
| 3.4 SCAP-Exo改善SS小鼠唾液分泌量 |
| 3.5 SCAP-Exo降低SS小鼠外周血Th17/CD4~+T比例及IL-17A表达 |
| 3.6 SCAP-Exo降低SS小鼠脾脏中Th |
| 3.7 SCAP-Exo降低SS小鼠颌下腺淋巴细胞浸润水平 |
| 3.8 SCAP-Exo降低SS小鼠颌下腺Th17 细胞浸润水平 |
| 3.9 人外周血CD4~+T细胞的分选纯化 |
| 3.10 CD4~+T细胞向Th17 分化诱导体系的构建 |
| 3.11 SCAP-Exo抑制CD4~+T细胞向Th17 分化 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 SCAP外泌体中piRNA的高通量测序及生物信息学分析和验证 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 原代细胞的培养与鉴定 |
| 2.2.2 SCAP-Exo和 BMMSC-Exo的提取与鉴定 |
| 2.2.3 SCAP-Exo和 BMMSC-Exo的高通量测序 |
| 2.2.4 目标piRNA的筛选与验证 |
| 2.2.5 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 BMMSCs的鉴定 |
| 3.2 BMMSC-Exo的鉴定 |
| 3.3 SCAP-Exo和 BMMSC-Exo小 RNA文库数据质检 |
| 3.4 小RNA分类注释结果 |
| 3.5 SCAP-Exo中 piRNA表达谱分析 |
| 3.6 生物信息学分析 |
| 3.7 目标piRNA的筛选与验证 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 SCAP外泌体传递hsa-piR-15254 抑制Th17 分化的机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 人SCAP原代细胞分离培养与鉴定 |
| 2.2.2 SCAP-Exo的分离提取与鉴定 |
| 2.2.3 人外周血CD4~+T细胞的分离培养与鉴定 |
| 2.2.4 免疫荧光染色观察SCAP-Exo进入CD4~+T细胞 |
| 2.2.5 SCAP-Exo对 CD4~+T细胞hsa-piR-15254 表达水平的影响 |
| 2.2.6 双荧光素酶报告基因验证hsa-piR-15254 的靶基因为IL-6R |
| 2.2.7 检测CD4~+T细胞转染hsa-piR-15254 mimics/inhibitor有效率 |
| 2.2.8 qRT-PCR验证hsa-piR-15254对IL-6R表达的调控作用 |
| 2.2.9 hsa-piR-15254对CD4~+T细胞向Th17 分化的调控作用 |
| 2.2.10 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 SCAP-Exo能够被CD4~+T细胞胞吞并上调hsa-piR-15254 表达 |
| 3.2 双荧光素酶报告基因验证hsa-piR-15254 的靶基因为IL-6R |
| 3.3 CD4~+T细胞转染hsa-piR-15254 mimics和 inhibitor效率 |
| 3.4 hsa-piR-15254 抑制CD4~+T细胞IL-6R表达 |
| 3.5 hsa-piR-15254 抑制CD4~+T细胞向Th17 分化及IL-17A分泌 |
| 3.6 hsa-piR-15254 抑制Th17 相关基因表达水平 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 对本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 间充质干细胞外泌体通过调节免疫促进组织再生的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（7）抗CD19和FcγRIIb双特异性抗体（XmAb5871）通过调控B细胞谱系转录因子抑制IgG4相关性疾病中纯真B细胞活化的相关研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:XmAb5871以FcγRIIb依赖性方式下调B细胞信号传导通路中的磷酸化BTK的表达 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 研究材料和仪器 |
| 2.2.1 化学试剂和耗材 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 技术路线图 |
| 2.3.2 Ficoll Plaque密度梯度离心法分离单个核细胞 |
| 2.3.3 磷酸化蛋白流式检测 |
| 2.3.4 统计学方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 XmAb5871以FcγRIIb依赖性方式下调B细胞信号传导通路中的pBTK的表达 |
| 3.2 B细胞接受抗F(ab')2抗人IgG/IgM刺激后pBTK及pSYK表达均有所增高(图2) |
| 3.3 XmAb5871治疗可抑制B细胞各个亚型中BCR交联诱导的pBTK激活,但不抑制pSYK激活(图3-5) |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:XmAb5871抑制纯真B细胞中的BCR活化通过染色质可及性的改变,而非DNA甲基化改变 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 研究材料和仪器 |
| 2.2.1 化学试剂和耗材 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 技术路线图 |
| 2.3.2 Ficoll Paque密度梯度离心法分离单个核细胞 |
| 2.3.3 流式细胞分选各个B细胞亚型 |
| 2.3.4 高通量测序的染色质可及性研究(ATAC-seq) |
| 2.3.5 全基因组DNA甲基化测序(WGBS) |
| 2.3.6 核酸酶靶向切割和释放(CUT&RUN) |
| 2.4 统计学方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 XmAb5871可导致纯真B细胞染色质状态的广泛改变(图1-3) |
| 3.2 B细胞开放性染色质区域改变对应的是转录增强子的区域(图4) |
| 3.3 染色质改变与DNA甲基化改变无关(图5) |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:XmAb5871对纯真B细胞BCR信号通路,代谢和细胞骨架重组的改变与B细胞中磷酸肌醇水平的变化有关 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 研究材料和仪器 |
| 2.2.1 化学试剂和耗材 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 技术路线图 |
| 2.3.2 Ficoll Paque密度梯度离心法分离单个核细胞 |
| 2.3.3 流式细胞分选各个B细胞亚型 |
| 2.3.4 转录组测序(RNA-seq) |
| 2.3.5 数据分析 |
| 2.3.6 统计学方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 XmAb5871诱导产生的染色质可及性改变和特定转录因子的表达改变相关(图1-2) |
| 3.2 XmAb5871的治疗改善与细胞骨架生物学通路改变相关(图3-4) |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 IgG4相关性疾病中免疫细胞作用和及其靶向治疗 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（8）靶向CD19抗原的新型嵌合抗原受体NK细胞的优化构建和功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 CAR-T的抗肿瘤研究和构建策略 |
| 1.2 人工CAR的结构 |
| 1.2.1 胞外抗原结合区 |
| 1.2.2 胞内细胞信号传导区与跨膜链接区 |
| 1.2.3 CAR-T的抗肿瘤机制及进展 |
| 1.3 CAR-T技术研究和临床应用的瓶颈 |
| 1.3.1 细胞因子风暴 |
| 1.3.2 脱靶效应 |
| 1.3.3 实体瘤应用瓶颈 |
| 1.3.4 转染载体的缺陷 |
| 1.3.5 移植物抗宿主反应与免疫细胞活性维持 |
| 1.3.6 免疫抑制作用 |
| 1.3.7 CAR-T细胞来源的限制 |
| 1.4 NK细胞为代表的非特异性免疫细胞研究 |
| 1.4.1 NK细胞的生物学特性研究 |
| 1.4.2 NK细胞对肿瘤的杀伤机理 |
| 1.5 NK细胞在治疗中的研究进展 |
| 1.5.1 针对血液肿瘤的NK细胞过继性免疫治疗研究 |
| 1.5.2 针对实体瘤的NK细胞相关免疫研究 |
| 1.6 人工CAR修饰的NK细胞构建与研究进展 |
| 1.6.1 CAR-NK分子靶点 |
| 1.6.2 CAR改造NK细胞的临床应用 |
| 1.7 CAR-NK相关的细胞因子介导的内源性NK细胞活化 |
| 1.8 非特异性免疫细胞的选择 |
| 1.8.1 CIK细胞的生物学特性和抗瘤特点研究 |
| 1.8.2 NK细胞来源与筛选 |
| 1.9 特异性分子靶点的研究与选择 |
| 1.10 本研究的目的和意义 |
| 2 CIK细胞人工CAR改造研究 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 实验细胞株与质粒 |
| 2.1.2 主要仪器与设备 |
| 2.1.3 主要实验试剂及耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 外周血单个核细胞的分离和培养 |
| 2.2.2 CAR-T细胞与CAR-CIK细胞的体外制备和体外扩增培养 |
| 2.2.3 CAR表达载体的构建及转化 |
| 2.2.4 病毒转导与检测 |
| 2.2.5 CAR-T细胞体外扩增 |
| 2.2.6 CAR-CIK细胞体外扩增 |
| 2.2.7 细胞计数及细胞形态增殖情况观察 |
| 2.2.8 CAR-CIK和CAR-T细胞免疫表型的检测 |
| 2.2.9 CAR-CIK和CAR-T细胞体外抗肿瘤活性的研究 |
| 2.2.10 统计学方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 CAR-T细胞和CAR-CIK细胞体外制备和扩大培养 |
| 2.3.2 设计并构建Psb1576-CD19-CAR重组载体 |
| 2.3.3 扩增CD19片段重组质粒构建和慢病毒的制备 |
| 2.3.4 CD19抗原过表达靶细胞稳定株构建 |
| 2.3.5 CD19-CAR在T细胞中的转导效率和免疫表型 |
| 2.3.6 CD19-CAR在CIK细胞中的转导效率和免疫表型 |
| 2.3.7 杀伤后细胞因子释放能力检测 |
| 2.3.8 CIK和CAR-T细胞体外靶向细胞杀伤能力分析比较 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 NK细胞系的人工CAR改造研究 |
| 3.1 实验细胞株与材料试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 目的片段的PCR扩增和胶回收 |
| 3.2.3 表达GFP、IL-15和4-1BB基因的重组载体的构建及转化 |
| 3.2.4 病毒转导 |
| 3.2.5 流式细胞技术检测CAR阳性细胞比例以及表型分析 |
| 3.2.6 乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测CAR-NK-92细胞杀伤活性 |
| 3.2.7 细胞因子释放能力检测 |
| 3.2.8 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 CAR-NK-92重组质粒的设计 |
| 3.3.2 CAR-NK-92重组质粒的载体构建 |
| 3.3.3 CAR-NK-92重组质粒的筛选验证与载体包装和滴度测定 |
| 3.3.4 CAR-NK-92细胞的构建与免疫表型检测 |
| 3.3.5 不同浓度条件培养基对NK细胞扩增倍数的影响 |
| 3.3.6 不同浓度的条件培养基对NK细胞扩增以及活化表型的影响 |
| 3.3.7 CD19-CAR-NK-92细胞体外靶向识别杀伤能力检测 |
| 3.3.8 杀伤后细胞因子释放能力检测 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 脐血来源的NK细胞人工CAR改造研究 |
| 4.1 实验用细胞材料及试剂配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 脐血单个核细胞分离方法 |
| 4.2.2 脐血NK细胞分离方法 |
| 4.2.3 脐血NK细胞体外扩增培养 |
| 4.2.4 CAR表达载体的改造 |
| 4.2.5 针对NK细胞改良的CD19-CAR载体转导 |
| 4.2.6 CAR-NK细胞体外优化培养 |
| 4.2.7 脐血CAR-NK细胞免疫表型及重要功能性分子表达检测 |
| 4.2.8 脐血CAR-NK细胞对靶细胞的细胞毒作用检测 |
| 4.2.9 细胞因子释放能力检测 |
| 4.2.10 体内动物实验 |
| 4.2.11 过氧化物酶染色法 |
| 4.2.12 细胞总RNA提取与qRT-PCR检测基因表达水平 |
| 4.2.13 免疫印迹实验 |
| 4.2.14 细胞单基因测序与生信分析 |
| 4.2.15 临床研究试验前期方案设计 |
| 4.2.16 统计学数据处理分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 CAR-NK重组质粒的构建 |
| 4.3.2 脐血来源的NK细胞筛选与扩增培养 |
| 4.3.3 重组CD19-CAR载体的转导及转导效率检测 |
| 4.3.4 CD19-CAR-NK细胞分子表达 |
| 4.3.5 NK细胞对靶细胞杀伤作用的测定 |
| 4.3.6 杀伤后细胞因子释放能力检测 |
| 4.3.7 CD19-CAR-NK细胞的动物体内药效检测 |
| 4.3.8 CD19-CAR-NK细胞的动物体内安全性检测 |
| 4.3.9 CD19-CAR-NK细胞的动物模型中药代动力学 |
| 4.3.10 CD19-CAR-NK细胞的高通量测序分析 |
| 4.3.11 CD19-CAR-NK细胞的基因功能分类分析 |
| 4.3.12 CD19-CAR-NK细胞的细胞生物学调控 |
| 4.3.13 临床试验样本病理学分析 |
| 4.3.14 CD19-CAR-NK细胞临床预实验研究 |
| 4.3.15 CD19-CAR-NK细胞临床研究前患者样本分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 讨论 |
| 5.1 非特异性免疫细胞人工CAR的构建及细胞生物学研究 |
| 5.2 体外非特异性细胞扩增活化体系的优化 |
| 5.3 非特异性免疫细胞的选择与理论依据 |
| 5.3.1 CIK细胞方案 |
| 5.3.2 NK-92细胞方案 |
| 5.3.3 脐血NK细胞方案 |
| 5.4 CAR-NK的体内药效和基因表达谱分析 |
| 5.5 超越CAR-T的新型CAR-NK的优势与发展 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 博士学位论文修改情况确认表 |
（9）间充质干细胞对脂多糖-低氧诱导的Treg/Th17分化失衡的调控作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 本论文专用缩略词表(Abbreviations) |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分:高脂多糖合并低氧特征的严重感染患者外周血T细胞分化相关基因表达特点 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 间充质干细胞处理对脂多糖-低氧诱导Treg/Th17分化失衡的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 间充质干细胞调控脂多糖-低氧诱导 Treg/Th17分化平衡的机制研究 |
| 引言 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 文献综述 Th17/Treg在急性呼吸窘迫综合征中免疫调节作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表论文 |
| 参加学术会议情况 |
| 基金资助 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（10）通过瘤内递送CCL25募集CCR9+T细胞增强三阴性乳腺癌免疫治疗作用的研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 三阴性乳腺癌概述 |
| 1.1.1 三阴性乳腺癌的病理特征及预后 |
| 1.1.2 三阴性乳腺癌的免疫特点及免疫系统对三阴性乳腺癌预后的影响 |
| 1.1.3 三阴性乳腺癌的靶向治疗 |
| 1.2 趋化因子的生理功能及在肿瘤微环境中的作用 |
| 1.2.1 趋化因子的生理作用 |
| 1.2.2 趋化因子在肿瘤中的作用 |
| 1.2.3 CCL25 及其受体CCR9 的功能 |
| 1.3 CD47 分子在肿瘤免疫逃逸中的作用 |
| 1.3.1 CD47 分子的自我标记作用 |
| 1.3.2 靶向CD47 分子在肿瘤免疫治疗中的作用 |
| 1.4 抗PD-L1 抗体在肿瘤治疗中的应用 |
| 1.4.1 PD-1/PD-L1 抗体的抗肿瘤作用机制 |
| 1.4.2 PD-1 抗体在治疗三阴性乳腺癌中的应用 |
| 1.4.3 影响PD-1/PD-L1 抗体治疗效果的因素及通过联合治疗刺激免疫反应增强PD-1/PD-L1 抗体疗效的方法 |
| 1.5 纳米载体在肿瘤免疫治疗中的应用 |
| 1.6 小干扰RNA在肿瘤治疗中的应用 |
| 1.6.1 si RNA的基因沉默功能机制 |
| 1.6.2 纳米系统递送si RNA的优势 |
| 1.7 本课题的研究目的及内容 |
| 第2章 4T1 肿瘤中CCR9+淋巴细胞的浸润与CCL25 无关 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 细胞 |
| 2.2.2 实验动物 |
| 2.2.3 研究对象 |
| 2.2.4 主要实验仪器及耗材 |
| 2.2.5 实验试剂 |
| 2.2.6 主要溶液的配置 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 人外周血单个核细胞(PBMC)分离 |
| 2.3.2 免疫组化 |
| 2.3.3 小鼠 4T1 原位乳腺癌模型建立 |
| 2.3.4 小鼠脾细胞的获取 |
| 2.3.5 小鼠肿瘤组织中单个核细胞的获取 |
| 2.3.6 T细胞体外增殖活化 |
| 2.3.7 流式检测 |
| 2.3.8 数据分析及处理 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 健康志愿者与患者外周血T细胞CCR9 的表达差异 |
| 2.4.2 CCL25 在人和小鼠的三阴性乳腺癌中的表达 |
| 2.4.3 人结肠癌和三阴性乳腺癌中CCR9 的表达 |
| 2.4.4 CCR9 在小鼠的脾脏和 4T1 肿瘤组织中的表达 |
| 2.4.5 CCR9~+T细胞的活化表型 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 纳米颗粒的合成和体外及体内作用的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 细胞 |
| 3.2.2 实验动物 |
| 3.2.3 实验设备及耗材 |
| 3.2.4 实验试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 实验试剂的配置 |
| 3.3.2 鱼精蛋白/R10与siRNA的最适结合比例 |
| 3.3.3 NP-siCD47/CCL25颗粒合成 |
| 3.3.4 NP-siCD47/CCL25颗粒的表征 |
| 3.3.5 细胞对NP-siCD47/CCL25颗粒的摄取 |
| 3.3.6 NP-siCD47/CCL25体外沉默作用 |
| 3.3.7 mRNA提取,逆转录和实时定量PCR |
| 3.3.8 蛋白质印迹分析 |
| 3.3.9 蛋白质印迹分析NP-siCD47/CCL25的组织分布和肿瘤富集 |
| 3.3.10 纳米颗粒NP-siCD47/CCL25体内给药后,siCD47和CCL25的体内作用 |
| 3.3.11 纳米颗粒NP-siCD47/CCL25体内给药后,siCD47和CCL25的体内作用 |
| 3.3.12 免疫组化 |
| 3.3.13 免疫荧光 |
| 3.3.14 流式检测 |
| 3.3.15 数据处理 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 4T1 肿瘤细胞和肿瘤组织 CCR9、CD47 和 PD-L1 的表达 |
| 3.4.2 纳米颗粒的设计和工作原理 |
| 3.4.3 纳米颗粒的表征 |
| 3.4.4 4T1 细胞在中性和酸性条件下对颗粒的摄取 |
| 3.4.5 NP-siCD47/CCL25颗粒的体外沉默效率 |
| 3.4.6 纳米颗粒在体内重要器官及肿瘤组织、肿瘤细胞中的分布。 |
| 3.4.7 体内给药后,siCD47的作用 |
| 3.4.8 体内给药后,CCL25的作用 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 纳米颗粒NP-SICD47/CCL25的抗肿瘤作用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 细胞 |
| 4.2.2 实验动物 |
| 4.2.3 实验试剂 |
| 4.2.4 实验耗材及仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 BALB/c或BALB/c-nu小鼠4T1肿瘤形成抑制实验 |
| 4.3.2 已建立的4T1肿瘤治疗实验 |
| 4.3.3 抑制4T1肿瘤肿瘤转移实验 |
| 4.3.4 治疗后检测肿瘤免疫微环境实验 |
| 4.3.5 PD-1/PD-L1 抗体联合治疗实验 |
| 4.3.6 病理检测 |
| 4.3.7 流式检测 |
| 4.3.8 数据处理 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 纳米颗粒NP-siCD47/CCL25抑制4T1肿瘤原位生长 |
| 4.4.2 纳米颗粒NP-siCD47/CCL25抑制4T1肿瘤远处转移 |
| 4.4.3 NP-siCD47/CCL25抑制4T1肿瘤生长的作用依赖CD8~+T细胞 |
| 4.4.4 NP-siCD47/CCL25对靶向PD-1/PD-L1的免疫检查点抑制剂治疗4T1肿瘤作用的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
四、DESIGN OF ANTI-CD3 ScFv-B7.1 FUSION MOLECULE AND PREDICTION OF ITS BIOLOGICAL CHARACTERISTICS（论文参考文献）
- [1]泛实体瘤相关抗原图谱的构建及其在抗体偶联药物和嵌合抗原受体T细胞上的应用[D]. 方佳成. 西北大学, 2021(12)
- [2]人胎肝间充质干细胞与成人骨髓间充质干细胞的免疫调节功能的比较研究[D]. 余怡. 北京协和医学院, 2021(02)
- [3]T细胞免疫检查点CD226/TIGIT在原发性胆汁性胆管炎发病机制中的作用研究[D]. 邓垂文. 北京协和医学院, 2021(02)
- [4]肿瘤特异性递呈抗原作为抗体类药物靶点的可行性初探[D]. 仇驰逍. 浙江大学, 2021(01)
- [5]基于PD-L1、HER2联合靶点研究归芪白术方对胃癌细胞增殖和T细胞活性的影响[D]. 李玲. 甘肃中医药大学, 2021(01)
- [6]SCAP外泌体通过hsa-piR-15254抑制Th17分化治疗舍格伦综合征的实验研究[D]. 王傲晨. 中国医科大学, 2021(02)
- [7]抗CD19和FcγRIIb双特异性抗体（XmAb5871）通过调控B细胞谱系转录因子抑制IgG4相关性疾病中纯真B细胞活化的相关研究[D]. 刘航. 中国医科大学, 2021(02)
- [8]靶向CD19抗原的新型嵌合抗原受体NK细胞的优化构建和功能研究[D]. 曹韪凡. 东北林业大学, 2020
- [9]间充质干细胞对脂多糖-低氧诱导的Treg/Th17分化失衡的调控作用及其机制研究[D]. 薛明. 东南大学, 2020
- [10]通过瘤内递送CCL25募集CCR9+T细胞增强三阴性乳腺癌免疫治疗作用的研究[D]. 陈红梅. 吉林大学, 2020(08)