一、蜂胶对NDV的灭活作用效果观察（论文文献综述）
张赫[1]（2020）在《HP-PRRS重组NDV载体疫苗构建、免疫评价及其佐剂研究》文中提出高致病性猪繁殖与呼吸综合征（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome,HP-PRRS）,又称高致病性猪蓝耳病,被世界动物卫生组织（OIE）规定为必须报告的动物疫病,其致病因子为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV）。自2006年我国首次爆发HP-PRRS后,十多年来该病已经给我国养猪业造成了巨大的经济损失。HP-PRRS主要是以各阶段猪群的呼吸系统疾病以及妊娠母猪早产、流产、死胎等繁殖障碍为特征,并且造成较高的死亡率。近年来,随着HP-PRRS防控手段的多元化,疫病态势趋于良好,但仍存在散毒范围较广、毒株变异等问题,防控形势依然严峻。《国家高致病性猪蓝耳病防治指导意见（2017—2020年）》中指出,坚持以预防为主仍是当前的防控原则。进一步开发研制安全有效的HP-PRRS疫苗将有利于从源头控制疫病发生,有助于最终实现净化目标。病毒载体疫苗因兼备载体病毒和外源蛋白的免疫优势已成为当前HP-PRRS疫苗研发的热点,具有广阔的应用前景和价值。为此,本文开展了HP-PRRS重组新城疫病毒载体疫苗的构建与免疫原性评价及其佐剂实验研究。1. HP-PRRS重组新城疫病毒候选疫苗的构建及鉴定新城疫病毒（Newcastle virus,NDV）是一种应用范围广泛的优质疫苗载体。本研究首先通过RT-PCR扩增HP-PRRSV GD株的主要结构蛋白基因ORF3和ORF5片段。基于NDV La Sota株反向遗传平台,通过同源重组技术分别将ORF3-double、IRES、ORF5-double和ORF5-single等外源片段克隆至NDV载体中,构建两种重组NDV感染性克隆。通过磷酸钙转染法,将重组质粒连同三种辅助质粒p BS-NP、p BS-P和p BS-L共同转染BSR细胞。将收获的细胞培养液接种9日龄SPF鸡胚进行病毒拯救,通过血凝实验判定病毒拯救效率。利用IFA和Western Blot判定重组病毒外源蛋白表达情况,测定NDV MDT、ICPI和IVPI等毒力学评价指标判定重组病毒的毒力水平。质粒鉴定结果显示成功构建得到重组质粒p BRN-FL-ORF5和p BRN-FL-ORF3-IRES-ORF5;血凝实验结果显示成功拯救出两株重组病毒r La Sota-GP5和r La Sota-GP3-GP5,且重组病毒在接种鸡胚后72 h时均可达到滴度峰值(8.7 log EID50/m L);RT-PCR结果显示外源片段均成功插入到NDV载体基因组内,且具有良好的鸡胚遗传稳定性;IFA和Western blot结果显示两株重组病毒均有效表达外源蛋白。根据OIE对NDV毒力的评价标准,两株重组病毒均属弱毒株,同母本毒一致。本实验结果表明成功构建并拯救得到两株重组病毒r La Sota-GP5和r La Sota-GP3-GP5,其可作为候选疫苗进行后续动物免疫原性及安全性评价实验研究。2. 重组NDV候选疫苗小鼠致病性及免疫效果评价本实验以小鼠作为动物模型评价两种重组候选疫苗r La Sota-GP5和r La Sota-GP3-GP5在小鼠体内的致病性和免疫效果。分别将两种重组候选疫苗以肌肉注射和颅内注射的方式接种小鼠,连续两周测定体重变化。在接种后第14天采集各组小鼠主要器官组织,利用RT-PCR方法检测病毒残留。以肌肉注射的方式免疫小鼠,分别在体液和细胞水平评价免疫效果。致病性实验结果显示重组病毒以肌肉和颅内注射方式接种小鼠后,小鼠体重变化趋势均与PBS对照组相近;RT-PCR结果显示小鼠各主要器官组织内均未检测到病毒残留。免疫原性评价结果显示与r La Sota-GP5（滴度:9.10±1.91）相比,重组候选疫苗r La Sota-GP3-GP5可刺激小鼠产生更高水平的特异性中和抗体（滴度:12.64±4.15）,可显着刺激小鼠脾脏淋巴细胞增殖。本实验结果表明两株重组病毒接种小鼠均未显着引起体重异常变化且无组织病毒残留,重组候选疫苗r La Sota-GP3-GP5可刺激小鼠产生更高水平的体液和细胞免疫反应。3. 重组NDV候选疫苗猪体内安全性评价本实验分别从基因水平、蛋白水平、病毒外排和临床状态等四个方面对所构建的两种重组NDV候选疫苗r La Sota-GP5与r La Sota-GP3-GP5进行猪体内免疫安全性评价。采集猪主要器官组织、血液、排泄物等样品,利用q RT-PCR检测重组疫苗在猪体内复制周期和病毒排出情况;通过免疫组化检测主要器官组织中的蛋白表达情况;观察免疫猪的生长活动状态,通过主要组织病理切片判定是否导致病变。结果显示重组候选疫苗免疫猪只后生长活动状况和饮食饮水状态均未出现异常情况,组织器官病理切片均未观察到明显的病变特征;q RT-PCR实验结果显示重组候选疫苗在猪体内复制能力有限,不超过10天,且不存在病毒外排的风险;免疫组化结果显示各主要器官组织NDV蛋白表达均为阴性。本实验结果表明两种重组候选疫苗免疫猪只后均具有良好的安全性。4. 重组NDV候选疫苗猪体免疫效果评价本实验分别从体液免疫水平（特异性中和抗体）、细胞免疫水平（细胞因子、淋巴细胞增殖、细胞亚群检测）和攻毒保护实验（体温监测、病毒残留检测）三个方面进行重组候选疫苗猪体免疫效果评价。结果显示重组候选疫苗r La Sota-GP3-GP5免疫原性较好,在加强免疫后第14天可刺激猪产生较高水平的特异性中和抗体（25.49±2.65）,诱导产生高浓度的IFN-γ（999.42 pg/m L）,总体明显优于r La Sota-GP5。与商品化疫苗相比（特异性中和抗体滴度:16.93±2.89;IFN-γ:450.49 pg/m L）,重组候选疫苗r La Sota-GP3-GP5的体液和细胞免疫应答水平更为突出。攻毒保护实验结果显示,重组候选疫苗r La Sota-GP3-GP5可显着降低攻毒后猪只血液和部分器官组织中的病毒载量。本实验结果表明重组候选疫苗r La Sota-GP3-GP5具有较突出的免疫原性优势,可作为HP-PRRS防控的技术储备。5. 候选佐剂的制备、筛选及其免疫增强效果评价研究表明NDV抗原提呈水平呈现出负调控,而佐剂被认为具备相应的抗原提呈调节作用。为了进一步提升重组候选疫苗的免疫效果,本研究制备并筛选在NDV抗原提呈和小鼠免疫增强效果两方面均具有明显优势的配伍佐剂,并在猪体内评价配伍佐剂与重组候选疫苗的联合免疫增强效果。通过比较C57BL/6和BALB/c小鼠源DC的生长状态和抗原摄取提呈能力,筛选出适用于后续佐剂实验的DC来源。将四种中药配伍成分（TCM 1-4）均设置高、中、低三个剂量组别,分别基于商品佐剂（ISA 206）和中药佐剂（TCM-Main）制备两类配伍佐剂。评价商品配伍佐剂的均一稳定性和中药配伍佐剂的抗原摄取提呈水平,分别在小鼠体内检测两类配伍佐剂的免疫效果,筛选出优势佐剂,并在猪体内进行免疫增强效果验证。结果显示BALB/c小鼠源DC与同期的C57BL/6小鼠源DC具有相似的分化形态、NDV抗原摄取和提呈能力。商品配伍佐剂均具有良好的稳定性,粒径较为均一;B-4号中药配伍佐剂高剂量组可显着增强DC对NDV抗原的摄取和提呈能力。两类佐剂小鼠免疫评价结果显示,B-4号中药配伍佐剂高剂量组免疫小鼠后可刺激产生更高水平的特异性抗体和IFN-γ。猪体免疫评价结果显示,辅以高剂量B-4号佐剂的重组候选疫苗免疫增强效果更为突出,在攻毒后可降低猪器官组织中的病毒载量。本实验结果表明B-4号中药配伍佐剂可增强重组候选疫苗在猪体内的免疫效果,为今后猪体免疫中药佐剂的进一步研发优化奠定了基础。
陈曦[2]（2020）在《中国蜂胶对人胰腺癌Panc-1细胞的抑制作用及其机制研究》文中认为胰腺癌是一种严重威胁人类生存的恶性肿瘤。其五年生存率不足1 0%,在全球癌症造成的死亡人数中位列前十。根据CLOBOCAN的数据显示,2018年全球胰腺癌新增病例458,918例,死亡病例432,242例。目前胰腺癌最有效的治疗方式为外科手术治疗,但由于胰腺癌起病隐匿及早期无特异性症状等原因,许多患者确诊时已发展为晚期阶段,无法进行手术治疗。化疗是目前胰腺癌治疗的常用手段,但因化疗药物的副作用及胰腺癌的耐药性,往往导致疗效一般、患者预后差等情况。因此,探索治疗胰腺癌的新型有效药物具有重大意义。蜂胶是由工蜂采集树脂并混入其自身分泌物加工而成的一种天然产物。既往研究表明蜂胶具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎症、免疫调节等生物活性功能。国外学者的研究发现,蜂胶可以缓解胰腺癌患者的部分症状,且蜂胶中的活性物质可以对胰腺癌细胞产生抑制作用。然而目前关于中国蜂胶对胰腺癌作用的相关研究还比较少。Hippo-YAP是一条具有控制器官大小、细胞增殖与肿瘤发生等功能的通路。YAP是它下游最重要的效应因子,当Hippo通路失活时,过表达的YAP会进入细胞核内参与相关目的基因的转录,从而起到促癌的作用。目前的研究显示,Hippo-YAP通路与胰腺癌的发生与发展密切相关。在本研究中,我们观察了中国蜂胶对胰腺癌Panc-1的作用,初步探索了相关机制,并对中国蜂胶的主要活性成分进了筛选。主要研究结果如下:1.制备中国蜂胶乙醇提取物,并通过高效液相色谱技术对其主要成分进行鉴定。结果表明,白杨素、高良姜素、松属素、3-O-乙酰基短叶松素、短叶松素和咖啡酸苯乙酯（CAPE）是实验所用中国蜂胶含量最高的6种成分。使用中国蜂胶处理人胰腺癌Panc-1细胞,检测其细胞活力、细胞凋亡、细胞周期及细胞迁移能力的变化。结果发现,蜂胶能显着抑制胰腺癌细胞的增殖,且呈浓度依赖性;通过激活caspase级联反应诱导细胞凋亡;能将细胞周期阻滞在G2/M期;通过EMT途径抑制细胞迁移能力。2.通过激光共聚焦检测,发现经蜂胶处理后,人胰腺癌Panc-1细胞中YAP的入核活动明显减少;另外,Western blot的结果显示,经蜂胶处理后,Hippo-YAP通路上游的主要蛋白LATS1和MST1以及下游磷酸化的效应蛋白p-YAP表达量增多,YAP表达量下降。3.采用CCK-8法和划痕实验,探索中国蜂胶6种主要成分对胰腺癌Panc-1的作用。结果显示,CAPE和高良姜素可明显抑制Panc-1细胞的增殖及迁移能力。综上,蜂胶能通过调控Hippo-YAP通路有效抑制人胰腺癌Panc-1细胞的增殖。同时,CAPE和高良姜素是实验所用中国蜂胶中对胰腺癌Panc-1抑制效果最好的2种单体物质。
欧爱群[3]（2020）在《蜂胶对细菌脂多糖诱导乳腺炎保护作用的研究》文中研究说明蜂胶是西方蜜蜂（Apis mellifera L.）的工蜂通过采集某一或多种植物树脂并和上颚腺、蜡腺等分泌物混合而成的粘性物质。蜂胶的成分复杂多样,到目前为止,蜂胶中已有20多类、600多种化学成分被鉴定出。研究报道蜂胶因其具有的抗炎、抑菌、抗氧化、增强免疫力、保护肝脏等多种生物活性而被广泛应用。乳腺炎是一种由多种因素引起的重要疾病,严重影响了乳品行业的发展,至今尚未有彻底解决的办法。LPS是大肠杆菌细胞壁的主要成分,进入机体后可引起免疫刺激的级联反应和机体的毒性病理生理活动,激活NF-κB、MAPK等信号通路,进而释放炎症因子诱导炎症产生。研究表明蜂胶对乳腺炎致病菌有较好的杀灭作用,此外作为佐剂可以增强疫苗的免疫作用,并且一些研究将蜂胶用于制作乳腺擦剂和乳头保护膜来抵御乳腺炎。本文的主要目的在于通过体内、外实验探究蜂胶对由LPS诱导的乳腺炎作用,研究主要内容及结果如下:（1）中国蜂胶乙醇提取物（EECP）成分分析:采用福林酚法和硝酸铝法分别对EECP进行总酚酸总黄酮含量测定。结果显示,总酚酸的含量为106.35 mg没食子酸当量（GAE）/g、总黄酮的含量为320.85 mg芦丁当量（RE）/g;采用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱联用仪（UHPLC-QQQ-LC/MC）对EECP中主要的17种酚酸黄酮类化合物精确含量,其中含量最高的化合物分别为:松属素（8.56±0.27μg/mg）、短叶松素（8.52±0.25μg/mg）、高良姜素（12.88±0.57μg/mg）和短叶松素三乙酸酯（12.93±0.59μg/mg）。（2）EECP对MAC-T细胞安全浓度筛选和对LPS刺激下细胞活力的影响:选用0μg/m L、2.5μg/m L、5μg/m L、10μg/m L、15μg/m L、20μg/m L的EECP处理细胞24 h后,利用CCK-8细胞活力测定试剂盒评估得出EECP对MAC-T细胞安全浓度范围为0-15μg/m L。在加入0-15μg/m L的EECP预处理细胞2 h后,经1μg/m L的LPS刺激24 h后测定细胞活力。与对照组相比,LPS模型组显着降低了MAC-T细胞的活力（P<0.05）,而0-15μg/m L的EECP能够有效提高MAC-T细胞的细胞活力。结果表明,EECP对LPS刺激下MAC-T细胞损伤具有保护作用。（3）EECP对LPS诱导的MAC-T细胞炎症模型转录组数据分析:利用RNA-seq技术,对LPS组和EECP+LPS组细胞进行转录组比较分析,从转录水平评估EECP对LPS诱导的MAC-T细胞炎症的作用。基因表达谱显示,同LPS组相比,有2490个基因在EECP处理组中显着差异表达,其中1130个基因上调表达、1360个基因下调表达。DEGs中与炎症和免疫相关的基因检测到有79个,上调基因有31个,下调基因有48个。此外,DEGs富集在细胞过程、生物调控、细胞组分、结合活性等GO term上的基因最多;KEGG通路分析显示DEGs主要富集在细胞应激反应丝裂原活化蛋激酶信号通路、炎症相关IL-17信号通路、细胞生长相关Fox O信号通路和细胞凋亡相关p53信号通路。（4）EECP对LPS诱导MAC-T细胞炎症模型的抗炎作用研究:基于转录组分析结果,我们进一步利用RT-q PCR技术对炎症相关因子以及紧密连接基因表达水平进行检测。结果表明EECP能够抑制LPS诱导的IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-a等因子m RNA的转录水平,提高紧密连接蛋白基因（occludin、ZO-1）m RNA的转录水平。细胞免疫荧光和免疫印迹结果均表明,EECP可增强细胞膜上紧密连接蛋白（occludin、ZO-1）的分布和表达。此外,免疫印迹结果还显示,EECP能降低p-P65、p-Ikbα、p-JNK的表达量,抑制NF-κB和MAPK信号通路的激活。（5）EECP对LPS诱导小鼠乳腺炎性损伤的作用研究:采用乳头管灌注LPS诱导小鼠乳腺炎模型,评估EECP的体内抗乳腺炎活性。试验分别分为空白对照组、模型组（LPS,1 mg/kg）、EECP试验组（100 mg/kg）和阳性对照组（DEX,5 mg/kg）。母鼠分娩后,连续灌胃EECP或阳性对照七天后,经第四、五对乳头管注射1 mg/kg的LPS,24 h后处死,诱导小鼠急性乳腺炎模型。将采集的样本经HE染色,ELISA法检测炎症因子,RT-q PCR检测紧密连接蛋白基因的m RNA转录水平,并对乳腺组织进行免疫组织化学分析。结果表明,一周规律灌胃EECP能够减少LPS刺激下炎性细胞的浸润、缓解乳腺腺泡结构损伤,抑制小鼠乳腺组织中IL-1β、IL-6、IL-10等细胞炎症因子的过量表达,提高紧密连接蛋白occludin、cluadin-1、ZO-1m RNA的转录水平,并提升紧密连接蛋白occludin、ZO-1在乳腺组织细胞膜上的表达。综上所述,EECP对细菌脂多糖诱导的乳腺炎具有良好的保护作用,这为利用中国蜂胶预防乳腺炎疾病的临床应用提供了试验基础。
董炳梅[4]（2019）在《鸡新城疫病毒增殖培养细胞系的筛选与稳定表达唾液酸转移酶（ST6Gal）细胞株的构建及其应用》文中提出鸡新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）可在多种原代或传代细胞系上复制增殖,但不同毒株或亚型对宿主细胞均存在偏嗜性。为了筛选适于鸡新城疫（Newcastle disease,ND）疫苗生产的传代细胞系,本研究将我国ND疫苗株NDVⅠ系与Lasota株分别接种BHK-21、Vero、Hela、鸡肝癌细胞（LMH细胞）与DF-1细胞,通过对细胞病变的观察,结合对细胞培养物细胞半数感染量(Median cell culture infective dose,TCID50)和HA效价的测定,对比确定适于NDVⅠ系与Lasota株生长的传代细胞系。结果显示,NDVⅠ系与Lasota株在Vero、BHK-21、DF-1、Hela与LMH细胞上均可增殖,并引起典型的细胞病变,但不同毒株适应细胞的能力不同。较适于NDVⅠ系增殖的细胞系依次为Hela、BHK-21与DF-1细胞;较适于NDV Lasota株增殖的细胞系依次为Hela、LMH与BHK-21细胞。本研究证明了NDVⅠ系与Lasota株均可在LMH细胞上增殖,并产生典型的细胞病变,且LMH细胞更适于NDVⅠ系的增殖培养。NDV侵染细胞的第一步是病毒与细胞膜表面的唾液酸受体结合,NDV的唾液酸受体主要包括Neu5Ac-α-2,3Gal-β-1,4Glc（SAα2,3Gal）和Neu5Ac-2-S-α-2,6Gal10Me（SAα2,6Gal）,两种受体在宿主组织器官中的分布及表达丰度的不同对病毒的宿主范围和毒力等方面具有重要影响。为了在分子水平解释NDVⅠ系与Lasota株对不同细胞系的偏嗜性,本研究首先应用激光共聚焦显微镜对2种唾液酸受体在BHK-21等5种细胞上的分布进行了观察,结果显示,BHK-21、LMH、DF-1、Hela与Vero细胞内均存在TSA-R SAα2,6Gal与SAα2,3Gal,且主要分布于细胞膜与细胞质中;在细胞核部分,BHK-21细胞核有SAα2,3Gal受体分布,而DF-1细胞核中两种受体均有分布。其次,本研究应用流式细胞仪对5种细胞膜表面的两种唾液酸受体进行了定量分析,结果显示5种细胞表面SAα2,3Gal受体的含量显着高于SAα2,6Gal受体,提示5种细胞主要以SAα2,3Gal受体为主;按由多到少排列,SAα2,3Gal在5种细胞膜上的含量依次为Hela、BHK-21、DF-1、LMH与Vero细胞;SAα2,6Gal在5种细胞膜上的含量依次为Hela、LMH、BHK-21、Vero与DF-1细胞。结合NDVⅠ系与Lasota株在不同细胞上的增殖特性的比较,可判断NDVⅠ系更易与SAα2,3Gal受体结合,NDV Lasota株更易与SAα2,6Gal受体结合。NDV虽然可在多种细胞上增殖培养,但效价普遍较低,不能达到生产要求。NDV的两种唾液酸受体分别为SAα2,3Gal和SAα2,6Gal,而介导两种唾液酸受体形成的酶类分别是ST3Gal转移酶和ST6Gal转移酶,因此唾液酸转移酶对唾液酸受体在细胞表面的表达具有重要作用,而细胞表面受体表达丰度的高低对病毒入侵与增殖具有决定性作用。因此,为了提高NDV细胞培养效价及进一步确定不同唾液酸受体对NDV细胞培养的影响,本研究以PCI-neo为载体,在成功构建唾液酸转移酶PCI-neo-ST3与PCI-neo-ST6质粒的基础上,应用脂质体转染的方法将其分别转染BHK-21细胞,共获得22株BHK-ST3细胞与17株BHK-ST6细胞;进而将NDV Lasota株分别接种以上细胞,通过HA效价及TCID50的测定,分别获得了较适于NDV Lasota株增殖的BHK-ST3-22细胞与BHK-ST6-15细胞克隆株。流式细胞仪检测发现,BHK-ST3-22细胞与BHK-ST6-15细胞表面相应的唾液酸受体表达丰度均有显着提高,且BHK-ST6-15细胞较BHK-ST3-22细胞更适合于NDV Lasota株的增殖。为了提高NDV在BHK-ST6-15细胞株的增殖效价,本研究在对应用BHK-ST6-15贴壁细胞增殖培养NDV Lasota株的条件进行优化的基础上,一方面将BHK-ST6-15细胞进行低血清悬浮培养的驯化;另一方面对NDV Lasota株在悬浮培养的BHK-ST6-15细胞上增殖条件进行了优化。结果显示,成功实现了BHK-ST6-15细胞的低血清悬浮培养,应用该细胞增殖培养NDV Lasota株,其细胞培养液效价可达108.375 TCID50/0.1 mL,显着高于BHK-ST6-15贴壁细胞,从而为实现NDV Lasota株细胞悬浮培养产业化生产奠定了良好基础。我国家禽活疫苗的生产主要依靠接种SPF鸡胚制备而成,该工艺主要存在批次间稳定性差、家禽外源病毒污染的风险和鸡胚废弃物无害化处理等问题,因此,影响着家禽活疫苗的生产。为替代传统鸡胚生产工艺、提升产品质量与效益,本研究应用全悬浮细胞培养技术生产NDV Lasota株活疫苗,并根据《中华人民共和国兽药典》2015年版三部的要求对其进行检测。结果显示,NDV Lasota株活疫苗各项指标均符合要求,可完全替代传统鸡胚生产工艺。同时,该技术具有技术成熟、自动化程度高、安全性强、产品质量稳定等优点,且显着降低了生产成本、提高了经济效益,从而为全悬浮细胞培养技术生产NDV Lasota株活疫苗奠定了良好基础。
韩紫轩[5]（2018）在《β-葡聚糖对鸡新城疫灭活疫苗免疫效应的影响》文中进行了进一步梳理现阶段我国养鸡业以暴发性为特征的典型新城疫（ND）较少见,而非典型ND呈上升趋势,目前由于养殖规模和水平差异较大,在ND防疫上出现免疫混乱,频繁免疫、超剂量免疫比较普遍,机体抗体被疫苗反复中和后,呈波浪式或锯齿形升降,难以达到或维持保护性水平,甚至形成免疫依赖或免疫麻痹。在众多的防治办法中,灭活疫苗和弱毒疫苗在ND免疫预防中最为常用。特别是灭活疫苗的免疫效果比较稳定。具有安全性良好、免疫应激小及免疫持续时间长等优点。有研究发现,接种油乳剂灭活疫苗的鸡HI抗体效价上升幅度大,抗体水平能够长时间保持一个较高的水平,适用于平时的预防接种。但是ND灭活疫苗的免疫效果是由注射剂量以及抗原的含量决定,且需要佐剂的辅助。所以免疫佐剂对于获得良好的疫病防控效果起到了关键作用。广泛地分布于真菌、细菌和植物体内的β-葡聚糖,是构成细胞壁的成分,具有多种生物学活性,包括提高动物体免疫应答、抗肿瘤和辐射。然而,将β-葡聚糖作为免疫佐剂,对新城疫灭活疫苗免疫效果的影响未见报道。本研究以β-1,3/1,6葡聚糖作为免疫佐剂,评价了其对SPF鸡免疫功能及生产性能的影响,检测了其对新城疫灭活疫苗免疫效应的影响。结果表明:（1）β-1,3/1,6葡聚糖能够显着提高14 d,SPF鸡的增重率、免疫器官指数和CD4+T细胞增殖。即β-1,3/1,6葡聚糖具有免疫增强效应。（2）0.5%或2%β-1,3/1,6葡聚糖与ND灭活疫苗混合后免疫SPF鸡,比较免疫后SPF鸡血清中不同天数NDV特异性抗体滴度变化,表明β-1,3/1,6葡聚糖能够提高体液免疫水平。通过流式细胞术的方法,检测并分析了免疫14 d,CD4+T和CD8+T细胞增殖情况,表明2%β-1,3/1,6葡聚糖能够提高细胞免疫水平。（3）通过Real time-PCR方法,检测0.5%或2%β-1,3/1,6葡聚糖与ND灭活疫苗混合后免疫14 d,各组SPF鸡脾脏中ChIL2、ChIL6和ChILFN-r的转录水平,结果显示2%混合处理组中的ChILIFN-r、ChIL2和ChIL6转录水平明显提高。结果表明2%葡聚糖混合组能够显着提高细胞因子的转录水平。攻毒实验结果显示2%葡聚糖混合组保护率为100%,0.5%葡聚糖混合组和ND灭活疫苗对照组均有2例发病,表明2%β-1,3/1,6葡聚糖与ND灭活疫苗混合能够显着增加疫苗保护率。综上所述,β-1,3/1,6葡聚糖能够显着提高NDV特异性抗体滴度和T细胞免疫水平,提高NDV灭活疫苗的保护效果,有望成为一种候选新型兽用疫苗佐剂。
周长明[6]（2018）在《浒苔多糖协同蜂胶对H9N2亚型禽流感灭活病毒黏膜免疫效果的影响》文中研究指明H9N2亚型禽流感病毒对养禽业危害很大,且对公共卫生安全也构成了严重威胁。目前,单纯使用灭活疫苗进行注射免疫对各毒株间交叉保护力较弱,尚不能完全防控H9N2禽流感疫情。研究发现,多糖和蜂胶均能有效提高疫苗的免疫效果。本文首先提取纯化了浒苔多糖（PEP）,并对其理化性质和结构特征进行了研究,然后探讨了PEP和蜂胶合剂对灭活的H9N2亚型禽流感病毒（AIV）诱导的系统和黏膜免疫反应的影响,为开发新型黏膜免疫佐剂提供理论依据,其主要研究内容如下:1.PEP的分离纯化及结构鉴定采用水提醇沉法提取PEP,并采用DEAE-纤维素柱层析和凝胶过滤层析,分离纯化得到均一的PEP。然后采用苯酚-硫酸法、考马斯亮蓝法、硫酸-咔唑法和氧瓶燃烧法分别测定PEP的总糖、蛋白、糖醛酸和硫酸基的含量。采用紫外光谱法（UVS）、红外光谱法（FT-IR）、高效液相色谱（HPLC）、分子排阻色谱法（SEC）、扫瞄式电子显微镜（SEM）和核磁共振波谱法（NMR）等方法分析PEP的结构特征。采用示差扫描量热分析（DSC）和热重量分析（TGA）方法检测了PEP的热力学性能。结果显示,PEP提取率为1.926%,PEP的糖含量为90.21%,蛋白和硫酸基含量均低于1%;红外光谱图显示,PEP具有多糖的典型特征吸收峰;分子量分布显示,PEP有两个不同的保留时间且对应两个对称的窄峰,表明PEP的纯度和分子量均一性均较高,其相对分子量为6.3×1031.17×105Da;单糖组成分析发现,PEP主要由葡萄糖（58.23%）、半乳糖醛酸（11.04%）、阿拉伯糖（9.34%）和木糖（8.01%）组成;1H-NMR和13C-NMR图谱显示,PEP的主链可能主要是以β-D-1,3-Glcp连接形式为主,并有少量α-L-1,6-Arap存在;DSC发现PEP的固态主体结构突变发生在84.61℃左右,而TGA发现PEP第2部分质量丢失的温度为T0=268.37℃,Tp=318.82℃,最后残留量为18.1%;SEM图显示,PEP表面呈质地较脆的片状结构。2.PEP与蜂胶口服合剂（PPO）对灭活的H9N2亚型AIV免疫反应的影响:280羽雏鸡随机分为7组,除空白对照组外,均于14日龄口服免疫灭活的H9N2亚型AIV,0.3ml/羽,28日龄二免。每次免疫的同时,13组分别按4mg/只、2mg/只、1mg/只的剂量灌服PPO;4、5组按2mg/只分别灌服PEP和蜂胶;6、7组灌服相应剂量的生理盐水;每天1次,连续灌服3d。（1）血清中免疫指标的检测结果:测定免疫后7d、14d、21d、28d和35d血清HI抗体效价、特异性IgG和Ig A抗体、血清IL-4和IFN-γ含量的变化。结果显示,PPO中、高剂量组在全部检测点的HI抗体效价、在1435d的4个时检测点的IFN-γ和IL-4含量均显着高于病毒对照组（P<0.05）;在721d与病毒对照组相比PPO的3个剂量组中的特异性IgG和IgA抗体水平均显着提高。结果表明,PPO配合灭活的AIV口服免疫能显着提高鸡群的系统免疫应答反应,且在中、高剂量时的效果较好。（2）肠道黏膜免疫相应指标的检测结果:分别于免疫后7d、21d、35d,每组随机抽取6只鸡,测定小肠洗液中sIgA和IL-17含量,检测小肠IEL、肥大细胞和IgA+细胞的数量。结果显示,在免疫后所有时间点,PPO中、高剂量组小肠洗液s IgA及IL-17的含量、小肠黏膜IEL、肥大细胞以及IgA+细胞的数量均显着高于病毒对照组,且在部分检测点显着高于PEP和PF组。结果表明,PPO配合灭活AIV口服免疫能显着增强鸡体肠道的黏膜免疫反应,且在中高剂量时的效果较好。
安亚娟[7]（2018）在《融合三肽囊素作为ALV先天感染鸡群生长及免疫调节剂应用初探》文中进行了进一步梳理禽白血病（Avian Leukosis,AL）是禽白血病病毒（Avian Leukosis virus,ALV）引起的严重影响养禽业发展的肿瘤性疾病,造成鸡群生长缓慢、蛋鸡产蛋率下降和免疫抑制,引起巨大经济损失和不良社会影响。ALV亚群较多,诱发的肿瘤表型复杂,一旦发生就难以控制和彻底根除。除了进行种鸡群的AL净化工作,应研发生物制剂降低或缓解ALV引发的不良影响。为此,本实验通过鸡胚卵黄囊接种重组ALV-FJ15HT0建立ALV先天感染鸡群模型,在进行疫苗接种时注射原核表达的融合三肽囊素（Bursin,BS）,探究BS对ALV引发的生长抑制和免疫抑制作用的影响,为融合BS的临床应用提供科学的依据。方法:于SPF鸡胚7日龄（d）时卵黄囊接种3000 TCID50的ALV自然重组毒FJ15HT0以建立ALV先天性感染的动物模型,感染鸡群随机分为BS处理组与感染对照组,同时设立空白对照组、空白BS处理组。全部雏鸡出壳1 d和14 d时均以点眼滴鼻的方式接种鸡新城疫病毒（NDV）弱毒苗和以颈部皮下的方式免疫禽流感病毒（AIV）H5亚型灭活苗,免疫同时,两组BS处理组的雏鸡肌肉注射纯化浓缩后的BS 50 μg,两组对照组的全部雏鸡肌肉注射BL21菌液的超声上清纯化液。分别于雏鸡21 d、28 d、35 d和42 d时,采血分离血清检测各项指标,并统计分析BS处理对于先天性感染鸡群和非感染鸡群动物的体重、各组织器官指数、NDV和AIV-H5抗体滴度、血清细胞因子（IL-2、IL-4、IFN-γ）和抗体亚型（IgG1、IgG2）以及实验动物组织ALV gp85和CNTFRα表达量的分析;并对注射融合BS前1 d、注射后1 d、3 d和7 d的SPF鸡法氏囊进行转录组学分析。结果:（1）在鸡群1 d和14 d疫苗接种时,同时接种融合BS,可导致在各次接种BS后的14 d内,即7-28 d期间,垂直BS组鸡群体重与空白菌液组、空白BS组差异不显着（P>0.05）,而在此期间,垂直菌液组实验动物体重与空白菌液组、空白BS组相比差异显着（P<0.05）,证实BS可在一定的时效内缓解由ALV垂直感染导致的生长抑制,同时BS对于健康鸡群未表现出显着的促生长作用。（2）垂直BS组与垂直菌液组实验动物肝脏指数之间存在极显着差异（P<0.01）,说明BS可缓解由ALV感染引发的肝脏肿大。（3）42 d时,垂直BS组NDV抗体滴度极显着高于垂直菌液组实验动物NDV抗体滴度（P<0.01）,证实融合BS对ALV感染鸡群的NDV抗体有一定的维持作用。（4）35d和42 d时,融合BS接种可导致健康鸡群血清中AIV-H5抗体滴度显着升高（P<0.05）,表明融合BS对健康鸡群AIV-H5抗体有维持作用。（5）融合BS对空白组鸡只血清中IL-2、IFN-γ的影响极显着（P<0.01）,对先天感染ALV组鸡只血清中IL-2、IL-4和IFN-γ的影响不显着（P>0.05）。（6）42d时,空白BS组、垂直菌液组与空白菌液组鸡只血清中IgG1/IgG2之间均存在极显着差异（P<0.01）。（7）转录组分析发现,融合BS涉及了 PPAR、MAPK等信号通路,其中会引起MAPK通路中MAPK11基因的极显着下调（P<0.01）。（8）BS接种可显着降低感染动物胸腺、肾脏及法氏囊组织中gp85表达量（P<0.05）,极显着降低法氏囊组织中gp85表达量（P<0.01）;在肝脏组织中,空白菌液组CNTFRα表达量是空白BS组CNTFRα表达量的3.7倍;在胸腺组织中,垂直菌液组CNTFRα表达量是垂直BS组CNTFRα表达量的2.58倍。结论:融合BS可时效性提高ALV感染动物的增重效率,提高健康动物针对灭活苗的抗体滴度,增加ALV感染动物针对弱毒苗的抗体峰值维持时间,可抑制多种组织中ALV复制,因此其具备成为饲料添加剂和免疫调节剂的价值。
李阳[8]（2017）在《我国地方品系鸡群中ALV的流行病学调查及ALV-K生物学特性的研究》文中提出禽白血病病毒（Avian leukosis viruses,ALV）属于反转录病毒科（Retroviridae）α反转录病毒属（Alpharetrovirus）的一类病毒。ALV感染不仅诱发多种肿瘤性疾病,还可引起大多数感染鸡的亚临床症状,如产蛋下降、免疫抑制或生长迟缓。根据病毒中和试验和gp85的特性,迄今为止将ALV分为A-J十个亚群,以及新鉴定的K亚群。自20世纪90年代以来,禽白血病特别是J亚群禽白血病病毒（ALV-J）给我国的养鸡业造成了重大的经济损失,严重危害我国白羽肉鸡、蛋用型鸡、黄羽肉鸡和固有的地方品种鸡等各种类型鸡的健康发展。先天垂直感染是ALV的重要传播方式。由于宿主对ALV难以产生有效免疫应答反应,加之ALV基因组变异频率较快,至今为止,尚未有商品化的疫苗可用。由于ALV亚群的多样性,感染和传播的复杂性,给我国的养鸡业造成了重大的经济损失,本研究对我国不同鸡群进行了ALV的流行病学调查,并对公鸡精液在ALV传播中作用进行了系统的研究;通过研究不同佐剂及免疫增强剂对ALV-J gp85重组蛋白诱导抗体的产生,从而加速和辅助我国ALV的净化;对新分离到的ALV-K全基因组做了系统的分析,并研究了ALV-K的原型株JS11C1对SPF鸡的致病性;本研究利用反向遗传操作技术,构建JS11C1株的感染性克隆,并在此基础上首次构建了env（J）-LTR（K）和env（K）-LTR（J）的嵌合感染性克隆,借以探究env基因在ALV-K的致病性中所发挥的作用。1.我国不同鸡群中ALV的流行病学调查及其准种分析本研究对我国12个不同地方品系鸡群中ALV进行了分离鉴定,共分离鉴定到14株ALV,对这些分离毒株gp85基因进行了克隆测序和亚型鉴定,结果显示有2株ALV-A,1株ALV-B,8株ALV-J和3株ALV-K。其中,2012年从山东某地方品系鸡群发生疑似为血管瘤的肿瘤病例中分离到5株J亚型ALV-J,定名为SDLY1201-SDLY1205。分别扩增五株ALV-J的gp85基因,并对五个毒株准种多样性进行分析和比较。结果显示:五个毒株其gp85核苷酸长度分别为921bp、921bp、924bp、918bp、912bp,其不同克隆之间的氨基酸同源性分比为99.3%-100%、99.3%-100%、99.4%-100%、98.4%-100%、99.0%-100%,其中序列完全相同的克隆比例分别为13/20、17/20、17/20、9/18、16/19,代表了五个毒株中优势准种的比例,对五个毒珠优势准种的gp85比较显示其氨基酸同源性为89.2%-92.5%。本研究证实即使在同一时期同一鸡群感染的不同个体中,ALV-J野毒株准种也存在巨大的差异,特别是其中优势准种发生了改变。2.公鸡精液在ALV传播中的作用长期以来,对ALV感染鸡群过程中公鸡的作用特别是对后代的传播作用一直没有得到明确的阐述。本研究通过鸡胚静脉接种J亚群禽白血病病毒（ALV-J）,获得持续病毒血症的公鸡,并将这些公鸡的精液人工授精给产蛋期的母鸡,1周后收集种蛋并孵化出雏鸡。结果显示,两只受精的母鸡在4-5w时产生ALV-J的抗体,在6只母鸡的泄殖腔中检测到p27抗原,母鸡产的26个鸡蛋中检测到3个蛋清P27为阳性。此外,对12只母鸡进行病毒分离时发现,在授精后6w均没有检测到病毒血症的存在。然而,1周龄时从34只后代的雏鸡中的1只雏鸡中分离到ALV-J,其与从公鸡精液样品中分离到的ALV-J的gp85基因的序列同源性为98.4%-99.2%。我们的研究表明,ALV-J可以通过公鸡的精液的人工授精感染母鸡并且垂直传播给子代的雏鸡。这一发现对于改进和完善种鸡场ALV净化程序有重要的指导作用。3.不同佐剂及免疫增强剂对ALV-J gp85重组蛋白诱导抗体产生的研究原核表达的ALV-J gp85囊膜蛋白能够诱导SPF鸡产生抗体,但抗体阳性率和抗体水平均较低,本研究观察了免疫增强剂松花粉多糖（TPPPS）联合不同佐剂（CPG、YF01）对增强ALV-J gp85囊膜蛋白免疫后抗体水平的影响。结果显示,单一gp85重组蛋白只能诱导少数鸡产生抗体,且产生的抗体效价较低、维持时间较短;而YF01或Cp G佐剂分别联合重组蛋白能够使大部分免疫鸡产生抗体,且效价较高,当两种佐剂再联合使用免疫增强剂泰山松花粉多糖后能够使产生的高效价抗体维持时间更长。对ALV-J抗体水平较高的4组收集种蛋进行孵化检测母源抗体,人工攻毒后观察母源抗体对雏鸡的保护效果。结果发现发现添加免疫增强剂TPPPS组产生的母源抗体水平较没有添加组高,且对雏鸡具有较高的保护效力,与对母体的使用效果一致。通过本研究我们可以发现泰山松花粉多糖联合使用YF01和CPG佐剂可以增强gp85重组蛋白的免疫原性,产生较好的免疫保护作用,这将为开发更加有效的ALV-J亚单位疫苗提供有力实验依据,高效亚单位疫苗的研制也将为J亚群禽白血病的净化提供更大的帮助。4.K亚群ALV的全基因组分析及其致病性研究本研究从我国地方品系鸡群中分离鉴定到了3株ALV-K,并对其做了全基因组分析,结果表明,这3株ALV-K与之前已发表的ALV-K毒株位于一个单独的分支,与鸡群中其他已知亚群的ALV均不在同一分支中。其中,与SDAUAK-11、SDAUAK-12和SDAUAK-13的全基因序列同源性最高的分别为中国广东分离株GD14LZ,GDFX0601,江苏分离株JS11C1,与其它ALV-K毒株的同源性分别为90.8%-97.7%,90.8%-97.7%,91.2%-97.3%。为研究ALV-K的致病性,将2011年分离自中国某地方品系鸡的ALV-K原型株JS11C1株分别采用卵黄囊接种、鸡胚静脉接种和1日龄腹腔接种三种方式感染SPF鸡,系统记录分析了感染鸡群的病毒血症和抗体产生动态、对感染鸡群体重增重的抑制以及感染鸡群对疫苗免疫应答的影响等方面,以对JS11C1的致病性进行全面评估。结果表明,当通过卵黄囊接种和鸡胚静脉接种时,JS11C1可以诱发感染鸡的持续病毒血症,抑制感染鸡群的体重增重和对疫苗的免疫应答,并可诱发一定比例的淋巴细胞肿瘤。相对于其他亚群ALV,JS11C1的传播效率和致病性相对较弱。本研究系统研究了JS11C1株对SPF鸡的致病性,为下一步研究其致病机制和科学防控奠定了基础。5.env基因在ALV-K致病作用中的研究在所有亚群ALV中,ALV-J致病性最强,而ALV-K与ALV-A、B等类似。为了阐明env基因和LTR片段在ALV-J与ALV-K致病性差异的作用,本研究构建和比较了ALV-J野毒株SDAU1005和ALV-K野毒株JS11C1及其重组嵌合病毒renv（J）-LTR（K）和renv（K）-LTR（J）的感染性克隆的生物学特性。在这4个感染性克隆病毒中,r SDAU1005（ALV-J）在DF-1细胞上的复制能力最强,r JS11C1最弱,而2个重组病毒介于二者之间,其强度次序r SDAU1005>renv（K）-LTR（J）>renv（J）-LTR（K）>r JS11C1。此外,在与致病性相关的对增重、对法氏囊和胸腺发育及疫苗免疫后抗体反应的抑制作用上,这一比较结果表明,env基因和LTR片段在影响ALV-J与ALV-K之间致病性差异中起着重要作用,其中env基因的作用似乎大于LTR片段。本研究发现ALV-K在细胞上的复制水平显着低于ALV-J及其他亚群,这也为改进净化程序中的检测方法和判定标准提供了新的科学数据。
星东[9]（2017）在《ND-IBD二联灭活苗对商品蛋雏鸡免疫效果及机制研究》文中研究表明传染性法氏囊病（Infectious bursal disease,IBD）与新城疫（Newcastle disease,ND）的防控仍然是国内家禽养殖业面临的两大难题。IBD和ND疫苗在蛋鸡的应用已经取得一定的成效,但是在生产中其免疫效果仍达不到预期效果,而且经常由于苗毒毒力过强造成免疫器官损伤。而ND-IBD二联灭活苗经生产工艺改进,提高了抗原含量,且可以减少免疫次数,能够有效的避免活苗的缺陷。ND-IBD二联灭活苗在商品蛋雏鸡的免疫效果及机体对该疫苗的免疫反应仍然有待进一步的研究。因此,本试验比较了 ND-IBD二联灭活疫苗对1、7日龄商品蛋鸡的免疫效果,并比较了 ND-IBD二联灭活疫苗与IBD活苗对7日龄商品蛋鸡的免疫效果,同时结合实时荧光定量PCR分析了 ND-IBD二联灭活疫苗免疫后免疫因子mRNA表达量的变化情况。研究结果为ND-IBD二联灭活疫苗在蛋鸡生产上的应用提供了重要依据。具体内容如下:方法:1、ND-IBD二联灭活苗对1、7日龄商品蛋雏鸡免疫效果研究。选取体重、日龄相近的健康的1日龄商品蛋雏鸡360只,随机分成A、B和C三个处理组。A组为空白对照组,接种生理盐水;B组为1日龄疫苗免疫组,雏鸡1日龄时颈部皮下注射0.3mlND-IBD二联灭活疫苗;C组为7日龄疫苗免疫组,于雏鸡7日龄时颈部皮下注射0.3mlND-IBD二联灭活疫苗。试验期56d,免疫后每7d采血分离血清,采用血凝抑制试验检测ND抗体水平;并采用中和试验检测IBD抗体水平;同时采集法氏囊和脾脏,采用TRIzol法提取总RNA,反转录出cDNA,用实时荧光定量PCR检测CD4+、CD8+、IL-6、IFN-β的mRNA表达量。然后每7d对各组鸡进行IBDV攻毒保护试验,攻毒剂量0.2ml/羽,并于攻毒后72h剖检,观察法氏囊病变情况,并计算攻毒保护率。2、ND-IBD二联灭活疫苗与IBD活苗对商品蛋鸡免疫效果比较研究。选取体重、日龄相近的健康的1日龄商品蛋雏鸡240只分成3个处理组。A组为空白对照组,接种生理盐水;B组为IBD活苗免疫组,雏鸡7日龄时颈部皮下注射0.3mlIBD活疫苗;C组为ND-IBD二联灭活疫苗免疫组,于雏鸡7日龄时颈部皮下注射0.3mlND-IBD二联灭活疫苗。试验期42d,免疫后每7d采血分离血清,采用中和试验检测IBD抗体水平;同时采集法氏囊和脾脏,采用TRIzol法提取总RNA,反转录出cDNA用实时荧光定量PCR法检测CD4+、CD8+、IL-6、IFN-β的mRNA表达量。然后每7d对各组鸡进行IBDV攻毒保护试验,攻毒剂量0.2ml/羽。攻毒后72h剖检,观察法氏囊病变情况,并计算攻毒保护率。结果:1、ND-IBD二联灭活苗对1、7日龄商品蛋雏鸡免疫效果研究。抗体检测结果表明:在28～56日龄,C组的IBD和ND抗体水平显着高于A组与B组（P<0.05）;35日龄前,C组攻毒保护率显着优于A组,且相差10%。实时荧光定量PCR法检测结果表明:在法氏囊与脾脏中,28～56日龄时,C组基因CD4+、CD8+、IL-6、IFN-β的mRNA表达量,相比A组与B组显着升高（P<0.05）。2、ND-IBD二联灭活疫苗与IBD活苗对7日龄商品蛋鸡的免疫效果比较研究。抗体检测结果表明:28～42日龄,C组IBD体水平显着高于B组与A组（P<0.05）;35日龄前,C组攻毒保护效果高于B组与A组。实时荧光定量PCR结果表明:21～42日龄时,法氏囊与脾脏中基因CD4+、CD8+、IL-6、IFN-β的mRNA表达量,C组显着高于B组与A组（P<0.05）。结论:1.ND-IBD二联灭活苗免疫7日龄商品蛋雏鸡可显着提高IBD与ND抗体水平和免疫器官中细胞因子的mRNA表达量,增强机体免疫功能。2.ND-IBD二联灭活苗免疫7日龄商品蛋雏鸡,免疫效果优于IBD弱毒苗。
潘梦梦[10]（2016）在《不同佐剂对鸡新城疫病毒（La sota株）和禽流感病毒（X-19株）联合免疫的影响》文中指出禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）和新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）可以感染多种家禽及鸟类,给我国乃至世界养禽业的发展造成了严重的经济损失。其中H9亚型禽流感是危害我国养禽业的主要AIV亚型,且易与NDV发生混合感染,不仅造成经济损失,而且会给防疫工作带来困难,因此,进行禽流感与新城疫病毒的联合免疫,可以在防止混合感染的同时提高免疫效率,减少鸡群因AIV、NDV感染而造成的损失。本研究在优化生产工艺的基础上,运用两种新型佐剂（ISA71VG和ISA71 RVG）和白油制备了3种鸡新城疫、禽流感（H9亚型）二联免疫制剂,对3种免疫制剂的物理性状、安全性、免疫效果、免疫期等进行比较研究,为选择最优佐剂,研制商品化的鸡新城疫、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗奠定基础。本研究主要包括以下几个方面:1.采用新城疫病毒La Sota株、H9亚型禽流感病毒X-19株分别接种9日龄SPF鸡胚,得到病毒含量分别是108.5EID50/0.1mL和107.5EID50/0.1mL的两种病毒液。两病毒液均使用甲醛溶液灭活后,采用超滤膜浓缩3-4倍,两种病毒液血凝价均达到1:1024。使用不同佐剂分别制备了3种新城疫、禽流感二联免疫制剂,对所研制免疫制剂的质量进行了初步评价,其物理性状及安全性检验均符合相应规定。2.每种免疫制剂分别通过胸部肌肉注射1周龄SPF鸡30只,每只注射0.6mL,持续观察8周,全部存活,未出现因疫苗引起的局部和全身不良反应,定期眼观和镜检不同佐剂在局部的吸收情况及局部组织学病理变化,每组免疫鸡注射部位在疫苗免疫后均出现局部病变和不吸收现象,恢复较快的是ISA71VG组和ISA71RVG组,杭州白油组吸收稍差。3.每种免疫制剂分别通过胸部肌肉注射免疫1周龄SPF鸡30只,接种后定期采血,分离血清,检测不同佐剂组鸡抗新城疫病毒和抗禽流感病毒（H9）HI抗体的变化规律。试验鸡用新城疫强毒北京株F48E9肌肉注射攻毒,观察14日,免疫组鸡100%保护,对照组全部死亡;用禽流感X-19株病毒液静脉注射攻毒,观察5日,免疫组鸡病毒分离100%阴性,对照组鸡病毒分离阳性率为80%。结果表明,对照鸡血清抗体检测为阴性,免疫21天后,免疫组鸡的新城疫、禽流感H9亚型抗体效价均高于1:64,免后20周,抗体仍处于保护水平。其中ISA71VG组在免后5d即可产生抗体,该免疫制剂诱导产生的特异性抗体速度快,抗体达到理想水平所需的时间较短,产生的抗体持续期较长。4.采用可特异性检测CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞的荧光标记单抗,分别对免疫组和对照组鸡的外周血T淋巴细胞及其亚群进行监测。结果表明,试验鸡的外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞百分含量在7日龄时最低。7日龄免疫后,免疫组较对照组相比,CD4+、CD8+T淋巴细胞水平均有所提高,其中ISA71VG免疫组的外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞均显着高于对照组,表明该免疫制剂在一定程度上可以激发体液免疫和细胞免疫。
二、蜂胶对NDV的灭活作用效果观察（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、蜂胶对NDV的灭活作用效果观察（论文提纲范文）
（1）HP-PRRS重组NDV载体疫苗构建、免疫评价及其佐剂研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 HP-PRRS重组新城疫病毒候选疫苗的构建及鉴定 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试剂、细胞和毒株 |
| 1.1.2 仪器设备 |
| 1.1.3 溶液配制 |
| 1.1.4 实验动物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 实验设计 |
| 1.2.2 引物设计及合成 |
| 1.2.3 19T-ORF3-ORF5 质粒的构建与鉴定 |
| 1.2.4 重组候选疫苗的构建与鉴定 |
| 1.2.5 质粒转染与病毒拯救 |
| 1.2.6 重组病毒分子生物学实验鉴定 |
| 1.2.7 重组病毒生物学特性评价 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 19T-ORF3-ORF5 质粒鉴定结果 |
| 1.3.2 同源重组目的片段的获取 |
| 1.3.3 重组NDV质粒鉴定结果 |
| 1.3.4 重组病毒拯救结果 |
| 1.3.5 重组病毒外源蛋白表达鉴定结果 |
| 1.3.6 重组病毒生物学特性评价结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 重组NDV候选疫苗小鼠致病性及免疫效果评价 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒与细胞 |
| 2.1.2 主要试剂耗材 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.1.4 溶液配制 |
| 2.1.5 实验动物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 免疫原的制备 |
| 2.2.2 引物设计与合成 |
| 2.2.3 小鼠致病性实验分组与方案 |
| 2.2.4 小鼠免疫原性评价实验分组与方案 |
| 2.2.5 免疫后小鼠血清特异性抗体水平检测 |
| 2.2.6 免疫后小鼠血清中和抗体水平检测 |
| 2.2.7 小鼠脾脏淋巴细胞分离 |
| 2.2.8 淋巴细胞增殖实验 |
| 2.2.9 淋巴细胞亚群数量检测分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 小鼠肌肉注射安全性评价实验结果 |
| 2.3.2 小鼠颅内注射安全性评价实验结果 |
| 2.3.3 免疫小鼠血清特异性抗体检测结果 |
| 2.3.4 免疫小鼠血清中和性抗体检测结果 |
| 2.3.5 小鼠脾脏淋巴细胞增殖检测结果 |
| 2.3.6 小鼠脾脏淋巴细胞流式亚群检测结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 重组NDV候选疫苗猪体内免疫安全性评价 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 仪器设备 |
| 3.1.3 实验动物 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 实验分组与免疫计划 |
| 3.2.2 引物设计及合成 |
| 3.2.3 猪体免疫后生长状况评定 |
| 3.2.4 标准质粒的构建及标准曲线的建立 |
| 3.2.5 重组候选疫苗猪体内复制水平检测 |
| 3.2.6 猪主要器官组织免疫组化检测 |
| 3.2.7 免疫后病毒外排检测 |
| 3.2.8 病理切片观察 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 标准质粒的鉴定结果 |
| 3.3.2 标准曲线的建立及评价 |
| 3.3.3 免疫后猪生长状况评定结果 |
| 3.3.4 重组病毒猪体内复制周期检测结果 |
| 3.3.5 免疫组化检测结果 |
| 3.3.6 重组病毒外排风险鉴定 |
| 3.3.7 免疫后器官组织病理切片观察结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 重组NDV候选疫苗猪体免疫效果评价 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 病毒与细胞 |
| 4.1.2 主要试剂耗材 |
| 4.1.3 仪器设备 |
| 4.1.4 溶液配制 |
| 4.1.5 实验动物 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 免疫原的制备 |
| 4.2.2 引物设计与标准质粒的构建 |
| 4.2.3 猪免疫原性评价实验分组与方案 |
| 4.2.4 红细胞凝集抑制实验检测 |
| 4.2.5 免疫后猪血清特异性抗体水平检测 |
| 4.2.6 免疫后猪血清中和抗体水平检测 |
| 4.2.7 免疫后猪血清细胞因子水平检测 |
| 4.2.8 猪外周血淋巴细胞分离 |
| 4.2.9 淋巴细胞增殖分析与细胞亚群数量检测 |
| 4.2.10 攻毒后生长状况及体温变化监测 |
| 4.2.11 主要组织器官病毒残留检测 |
| 4.2.12 组织病理切片观察 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 标准质粒鉴定结果 |
| 4.3.2 免疫猪血清特异性抗体检测结果 |
| 4.3.3 免疫猪血清中和性抗体检测结果 |
| 4.3.4 免疫猪血清细胞因子检测结果 |
| 4.3.5 猪外周血淋巴细胞增殖检测结果 |
| 4.3.6 猪外周血淋巴细胞流式亚群检测结果 |
| 4.3.7 攻毒后体温变化监测结果 |
| 4.3.8 主要器官组织病毒载量检测结果 |
| 4.3.9 病理切片观察结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 候选佐剂的制备、筛选及其免疫增强效果评价 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 病毒与细胞 |
| 5.1.2 主要试剂耗材 |
| 5.1.3 仪器设备 |
| 5.1.4 实验动物 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 小鼠骨髓源树突状细胞的分离与鉴定 |
| 5.2.2 重组NDV抗原提呈作用分析 |
| 5.2.3 重组候选疫苗配伍佐剂的制备与性能测定 |
| 5.2.4 中药配伍佐剂抗原摄取及提呈能力比较分析 |
| 5.2.5 小鼠体内佐剂免疫增强效果评价实验分组 |
| 5.2.6 联合免疫小鼠体内免疫增强效果评价 |
| 5.2.7 猪体内重组候选疫苗与佐剂联合免疫实验分组 |
| 5.2.8 联合免疫猪体内免疫增强效果评价 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 BALB/c和 C57BL/6 小鼠源DC分化生长状态比较评价 |
| 5.3.2 BALB/c和 C57BL/6 小鼠源DC表面分子表达检测 |
| 5.3.3 BALB/c和 C57BL/6 小鼠源DC抗原摄取能力比较分析 |
| 5.3.4 BALB/c和 C57BL/6 小鼠源DC抗原提呈能力比较分析 |
| 5.3.5 辅以商品配伍佐剂的重组候选疫苗乳化物性能评价结果 |
| 5.3.6 辅以商品配伍佐剂的重组候选疫苗小鼠免疫水平检测结果 |
| 5.3.7 中药配伍佐剂抗原摄取及提呈水平检测结果 |
| 5.3.8 辅以中药配伍佐剂的重组候选疫苗小鼠免疫水平检测结果 |
| 5.3.9 辅以佐剂的重组候选疫苗猪体免疫增强效果评价结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（2）中国蜂胶对人胰腺癌Panc-1细胞的抑制作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略表 |
| 第一章 文献综述与研究目的 |
| 1 胰腺癌的研究进展 |
| 1.1 胰腺癌发病因素 |
| 1.2 胰腺癌诊断及治疗现状 |
| 2 蜂胶研究进展 |
| 2.1 蜂胶的植物来源 |
| 2.2 蜂胶的化学成分 |
| 2.3 蜂胶生物学活性研究进展 |
| 2.4 蜂胶与胰腺癌 |
| 3 Hippo-YAP信号通路 |
| 3.1 Hippo-YAP通路概述 |
| 3.2 Hippo-YAP信号通路与肿瘤 |
| 3.3 Hippo信号通路与胰腺癌 |
| 4 本研究的意义和主要内容 |
| 4.1 研究的意义 |
| 4.2 研究的主要内容 |
| 4.3 研究的技术路线 |
| 第二章 中国蜂胶抑制人胰腺癌Panc-1细胞增殖、迁移作用 |
| 1 材料与试剂 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 中国蜂胶样品制备 |
| 2.2 中国蜂胶高效液相色谱分析 |
| 2.3 细胞培养 |
| 2.4 细胞活力检测 |
| 2.5 细胞凋亡检测 |
| 2.6 细胞周期检测 |
| 2.7 细胞划痕实验 |
| 2.8 细胞总蛋白提取及蛋白印迹分析 |
| 2.9 数据分析 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 中国蜂胶对人胰腺癌Panc-1细胞增殖的影响 |
| 3.2 中国蜂胶对人胰腺癌Panc-1细胞凋亡的影响 |
| 3.3 中国蜂胶对人胰腺癌Panc-1细胞周期的影响 |
| 3.5 中国蜂胶对人胰腺癌Panc-1细胞迁移的影响 |
| 4 小结 |
| 第三章 中国蜂胶通过Hippo-YAP通路产生抗胰腺癌效用的研究 |
| 1 材料与试剂 |
| 1.1 抗体 |
| 1.2 其他试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 中国蜂胶样品制备 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 免疫荧光检测 |
| 2.4 蛋白印迹分析 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 经中国蜂胶处理后YAP在人胰腺癌Panc-1细胞的变化情况 |
| 3.2 经中国蜂胶处理后Hippo-YAP通路相关蛋白在人胰腺癌Panc-1细胞中的表达情况 |
| 4 小结 |
| 第四章 中国蜂胶抑制胰腺癌的主要活性成分筛选 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 细胞活力检测 |
| 2.3 细胞划痕实验 |
| 2.4 数据分析 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 中国蜂胶化学成分分析 |
| 3.2 中国蜂胶主要活性成分对人胰腺癌Panc-1细胞增殖的影响 |
| 3.3 中国蜂胶主要活性成分对人胰腺癌Panc-1细胞迁移的影响 |
| 4 小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 1 研究总结 |
| 2 创新点 |
| 3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（3）蜂胶对细菌脂多糖诱导乳腺炎保护作用的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩写词表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 奶牛乳腺炎的研究进展 |
| 1.1.1 病因 |
| 1.1.2 临床症状 |
| 1.1.3 发病过程 |
| 1.1.4 治疗措施 |
| 1.2 紧密连接研究进展 |
| 1.2.1 紧密连接的功能 |
| 1.2.2 紧密连接蛋白 |
| 1.2.3 紧密连接和乳腺屏障功能 |
| 1.3 蜂胶生物学活性研究进展 |
| 1.3.1 蜂胶的抗炎活性 |
| 1.3.2 蜂胶的抗氧化活性 |
| 1.3.3 蜂胶的抗菌活性 |
| 1.3.4 其他生物学活性 |
| 1.4 蜂胶防治乳腺炎的研究进展 |
| 1.4.1 蜂胶抑制或杀灭奶牛乳腺炎病原 |
| 1.4.2 蜂胶缓解奶牛乳腺炎症反应 |
| 1.4.3 蜂胶作为疫苗佐剂增强免疫功能 |
| 1.4.4 蜂胶活性单体治疗奶牛乳腺炎 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 1.6 研究技术路线 |
| 第二章 EECP中总酚酸黄酮含量测定以及成分分析 |
| 2.1 材料、试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 样品提取及前处理 |
| 2.2.2 总酚酸黄酮含量测定 |
| 2.2.3 UHPLC-QQQ-MS分析EECP中组成成分 |
| 2.2.4 数据分析 |
| 2.3 结果和分析 |
| 2.3.1 EECP中总酚酸黄酮含量 |
| 2.3.2 EECP中主要的化学成分组成 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 EECP对LPS诱发MAC-T细胞炎症作用的RNA-seq分析 |
| 3.1 材料、试剂与仪器 |
| 3.1.1 主要材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 EECP对细胞毒性测定 |
| 3.2.3 EECP对细胞活性测定 |
| 3.2.4 MAC-T细胞处理方法 |
| 3.2.5 文库建立与质检 |
| 3.2.6 原始数据质控 |
| 3.2.7 mRNA差异表达分析 |
| 3.2.8 统计分析 |
| 3.3 结果和分析 |
| 3.3.1 EECP对MAC-T细胞活力的影响 |
| 3.3.2 EECP对LPS刺激下细胞活力的影响 |
| 3.3.3 RNA样本质量评估 |
| 3.3.4 基因表达水平分析 |
| 3.3.5 显着DEGs分析 |
| 3.3.6 差异基因GO功能富集分析 |
| 3.3.7 差异基因KEGG通路富集分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 EECP对LPS诱导MAC-T细胞炎症的作用机制 |
| 4.1 材料、试剂和仪器 |
| 4.1.1 主要材料 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 细胞培养 |
| 4.2.2 RT-qPCR检测炎症因子和紧密连接蛋白基因的表达 |
| 4.2.3 免疫荧光分析 |
| 4.2.4 免疫印迹分析 |
| 4.2.5 数据分析 |
| 4.3 结果和分析 |
| 4.3.1 EECP对LPS刺激下炎症因子mRNA转录水平的影响 |
| 4.3.2 EECP对紧密连接蛋白基因mRNA转录水平的影响 |
| 4.3.3 EECP对LPS刺激下紧密连接蛋白表达的影响 |
| 4.3.4 EECP对LPS刺激下NF-κB信号通路的影响 |
| 4.3.5 EECP对LPS刺激下MAPK信号通路的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 EECP对LPS诱导小鼠乳腺炎的作用 |
| 5.1 材料、试剂与仪器 |
| 5.1.1 实验动物与饲养条件 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器设备 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 小鼠乳腺炎模型建立 |
| 5.2.2 试验分组 |
| 5.2.3 乳腺病理切片制作及观察 |
| 5.2.4 乳腺组织中炎症因子的检测 |
| 5.2.5 RT-qPCR检测紧密连接蛋白基因mRNA转录水平 |
| 5.2.6 乳腺组织紧密连接蛋白表达量测定 |
| 5.2.7 统计分析 |
| 5.3 结果和分析 |
| 5.3.1 EECP对LPS刺激下乳腺组织病理变化的影响 |
| 5.3.2 EECP对LPS刺激下乳腺组织中炎症因子表达的影响 |
| 5.3.3 EECP对乳腺组织紧密连接蛋白mRNA转录水平的影响 |
| 5.3.4 EECP对乳腺组织紧密连接蛋白表达的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 主要研究结果总结 |
| 6.2 主要创新之处 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（4）鸡新城疫病毒增殖培养细胞系的筛选与稳定表达唾液酸转移酶（ST6Gal）细胞株的构建及其应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 鸡新城疫病毒研究进展 |
| 1.1 副黏病毒概述 |
| 1.2 NDV的病原学概述 |
| 1.3 NDV分子生物学特性 |
| 1.4 NDV在宿主细胞内的复制增殖 |
| 第二章 新城疫病毒受体研究进展 |
| 2.1 病毒受体特性 |
| 2.2 NDV的唾液酸受体 |
| 2.3 与唾液酸受体相关的酶类 |
| 2.4 影响NDV与受体结合的因素 |
| 2.5 NDV唾液酸受体的分布 |
| 2.6 NDV培养特性 |
| 第三章 新城疫疫苗研究概况 |
| 3.1 常规疫苗 |
| 3.2 新型疫苗--基因工程疫苗 |
| 第二篇 实验研究部分 |
| 第一章 不同细胞系培养NDV特性的研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 唾液酸受体SAα2,3Gal和 SAα2,6Gal在不同细胞系表达的比较 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 表达唾液酸转移酶细胞株的建立与筛选 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 NDV Lasota株在BHK-ST6-15 细胞上培养条件的优化 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 基于BHK-ST6-15 全悬浮细胞培养的NDV Lasota株活疫苗的试验研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 发表的学术论文 |
| 致谢 |
（5）β-葡聚糖对鸡新城疫灭活疫苗免疫效应的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 β-1,3/1,6葡聚糖概述 |
| 1.1.1 β-1,3/1,6葡聚糖 |
| 1.1.2 β-1,3/1,6葡聚糖对动物免疫功能的影响 |
| 1.1.3 β-1,3/1,6葡聚糖抗感染、抗炎和抗过敏作用 |
| 1.2 新城疫(ND)的研究进展 |
| 1.2.1 ND概述 |
| 1.2.2 ND的流行病学 |
| 1.2.3 新城疫病毒(NDV) |
| 1.2.4 ND的临床诊断 |
| 1.2.5 ND的防治措施 |
| 1.3 ND疫苗研究进展 |
| 1.3.1 灭活疫苗 |
| 1.3.2 活疫苗 |
| 1.3.3 基因工程疫苗 |
| 1.3.4 联苗 |
| 1.4 佐剂的概述 |
| 1.4.1 佐剂的类别 |
| 1.5 本研究的目的意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 NDV毒株 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 试验试剂 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 β-1,3/1,6葡聚糖对SPF鸡免疫功能的检测 |
| 2.2.2 β-1,3/1,6葡聚糖增加NDV灭活疫苗免疫效果的检测 |
| 2.2.3 鸡胚半数感染量(EID50)的测定 |
| 2.2.4 新城疫抗体水平的检测 |
| 2.2.5 新城疫血凝抑制实验 |
| 2.2.6 鸡外周血细胞提取及流式细胞仪检测 |
| 2.2.7 脾组织RNA的提取 |
| 2.2.8 Realtime-PCR检测 |
| 2.2.9 数据处理与统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 β-1,3/1,6葡聚糖对体重增重的影响结果 |
| 3.2 β-1,3/1,6葡聚糖对免疫器官指数的影响结果 |
| 3.3 β-1,3/1,6对CD4+T细胞增殖的影响结果 |
| 3.4 β-1,3/1,6葡聚糖增加NDV灭活疫苗免疫效果评价结果 |
| 3.4.1 NDV抗体含量的检测结果 |
| 3.4.2 14dNDV抗体效价检测(HI)结果 |
| 3.4.3 14d细胞免疫水平的检测结果 |
| 3.4.4 14d相关细胞因子转录水平测定结果 |
| 3.5 β-1,3/1,6葡聚糖对鸡ND疫苗免疫效力的影响结果 |
| 3.6 鸡NDV攻毒后病死鸡剖检变化 |
| 3.7 β-1,3/1,6葡聚糖对鸡胚半数感染量(EID50)的影响结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 β-葡聚糖对鸡生长性能的影响 |
| 4.2 β-葡聚糖对鸡细胞免疫功能的影响 |
| 4.3 β-葡聚糖疫苗佐剂对ND疫苗抗体消长的影响 |
| 4.4 β-葡聚糖疫苗佐剂对ND灭活疫苗免疫效力的影响 |
| 4.5 β-葡聚糖疫苗佐剂促进ND灭活疫苗免疫效应的机制 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（6）浒苔多糖协同蜂胶对H9N2亚型禽流感灭活病毒黏膜免疫效果的影响（论文提纲范文）
| 符号说明 中文摘要 Abstract 1 前言 |
| 1.1 H9N2亚型禽流感的研究进展 |
| 1.1.1 禽流感的病原学 |
| 1.1.2 禽流感的致病性 |
| 1.1.3 禽流感的流行现状 |
| 1.1.4 禽流感对公共卫生的影响 |
| 1.1.5 禽流感的预防和控制 |
| 1.2 黏膜免疫 |
| 1.2.1 黏膜免疫的特点 |
| 1.2.2 黏膜免疫在抵抗AIV感染中的作用 |
| 1.2.3 黏膜免疫与疫苗 |
| 1.3 天然多糖和蜂胶的免疫调节作用 |
| 1.3.1 天然多糖的免疫调节作用 |
| 1.3.2 蜂胶的免疫调节作用 |
| 1.4 浒苔多糖的研究进展 |
| 1.5 本研究的目的及意义 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 疫苗与病毒 |
| 2.1.2 试验动物 |
| 2.1.3 主要试剂及溶液 |
| 2.1.4 主要试验仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 PEP的纯化、分离及鉴定 |
| 2.2.2 PEP基本理化性质分析 |
| 2.2.3 浒苔多糖－蜂胶口服合剂(PPO)的制备 |
| 2.2.4 动物分组与处理 |
| 2.2.5 血清中HI抗体效价检测 |
| 2.2.6 特异性IgG和IgA抗体水平的测定 |
| 2.2.7 血清IL-4和IFN-γ含量的测定 |
| 2.2.8 肠洗液中sIgA和IL-17含量测定 |
| 2.2.9 十二指肠黏膜上皮淋巴细胞数量的测定 |
| 2.2.10 空肠黏膜IgA~+细胞数量的测定 |
| 2.2.11 小肠肥大细胞数量的测定 |
| 2.3 数据统计与分析 3 结果与分析 |
| 3.1 多糖的纯化及结构鉴定 |
| 3.1.1 多糖的提取与纯化 |
| 3.1.2 基本理化性质 |
| 3.1.3 单糖组成分析 |
| 3.1.4 相对分子量测定 |
| 3.1.5 紫外和红外光谱分析 |
| 3.1.6 核磁共振波谱 |
| 3.1.7 多糖热性能分析 |
| 3.1.8 扫描电子显微镜检测结果 |
| 3.2 PPO对血清免疫指标的影响 |
| 3.2.1 血清禽流感HI抗体效价 |
| 3.2.2 血清特异性抗体IgA和IgG的变化 |
| 3.2.3 血清IL-4含量 |
| 3.2.4 血清IFN-γ含量 |
| 3.3 PPO对肠道黏膜相关免疫指标的影响 |
| 3.3.1 十二指肠洗液中sIgA抗体水平 |
| 3.3.2 十二指肠洗液中IL-17的含量 |
| 3.3.3 十二指肠黏膜上皮内淋巴细胞数量 |
| 3.3.4 空肠黏膜IgA+细胞数量 |
| 3.3.5 十二指肠黏膜肥大细胞的面积 |
| 3.3.6 空肠黏膜肥大细胞的面积 4 讨论 |
| 4.1 PEP的提取、纯化及结构鉴定 |
| 4.2 PPO对系统免疫的增强作用 |
| 4.3 PPO对肠道黏膜免疫功能的增强作用 5 结论 6 参考文献 7 致谢 8 攻读学位期间发表论文情况 |
（7）融合三肽囊素作为ALV先天感染鸡群生长及免疫调节剂应用初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 一 文献综述 |
| 1 法氏囊素的概述 |
| 1.1 发现 |
| 1.2 结构 |
| 1.3 组织分布 |
| 1.4 功能 |
| 2 禽白血病的基本概述 |
| 2.1 ALV流行状况 |
| 2.2 ALV传播途径与方式 |
| 2.3 ALV引起的免疫抑制 |
| 2.4 诊断 |
| 2.5 预防和控制 |
| 3 本研究的目的和意义 |
| 二 试验材料与方法 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验试剂及疫苗 |
| 1.2 主要试验仪器 |
| 1.3 试验动物 |
| 1.4 融合三肽囊素的制备 |
| 2 方法 |
| 2.1 ALV的培养及病毒感染力(TCID_(50))的滴定 |
| 2.2 动物试验设计 |
| 2.3 试验指标检测 |
| 2.4 数据处理 |
| 三 结果与分析 |
| 1 融合BS对生长性能的影响 |
| 2 融合BS对各脏器指数的影响 |
| 3 融合BS对NDV活苗免疫效果的影响 |
| 4 融合BS对AIV-H_5灭活苗免疫效果的影响 |
| 5 融合BS对血清中细胞因子的影响 |
| 5.1 对血清中IL-2浓度的影响 |
| 5.2 对血清中IL-4浓度的影响 |
| 5.3 对血清中IFN-浓度的影响 |
| 6 融合BS对抗体亚型(IgG_1/IgG_2)的影响 |
| 7 RNA-seq分析结果 |
| 8 融合BS对ALV鸡群组织中gp85和CNTFRα妄达的影响 |
| 8.1 各器官组织中gp85的表达量 |
| 8.2 肝脏、胸腺中CNTFRα的表达量 |
| 四 讨论 |
| 1 融合BS对生长性能的影响 |
| 2 融合BS对各脏器指数的影响 |
| 3 融合BS对NDV和AIV-H5疫苗免疫效果的影响 |
| 4 融合BS对血清中细胞因子的影响 |
| 5 融合BS对抗体亚型(IgG_1/IgG_2)的影响 |
| 6 转录组学 |
| 7 融合BS对ALV鸡群组织中gp85和CNTFRα表达的影响 |
| 7.1 对gp85表达的影响 |
| 7.2 对CNTFRα表达的影响 |
| 五 全文小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（8）我国地方品系鸡群中ALV的流行病学调查及ALV-K生物学特性的研究（论文提纲范文）
| 符号说明 中文摘要 Abstract 1 前言 |
| 1.1 禽白血病病毒（ALV）的研究进展 |
| 1.1.1 ALV的形态和理化特性 |
| 1.1.2 ALV的病毒基因组结构和蛋白组成 |
| 1.1.3 不同亚群的分类 |
| 1.1.4 内源性ALV和外源性ALV |
| 1.1.5 ALV的致病性 |
| 1.1.6 ALV-K的研究进展 |
| 1.2 ALV的流行病学和病毒传播方式 |
| 1.2.1 禽白血病在我国鸡群中的流行特点 |
| 1.2.2 禽白血病病毒的宿主范围 |
| 1.2.3 传播方式 |
| 1.2.4 ALV的遗传变异和重组 |
| 1.2.5 ALV血清抗体检测方法 |
| 1.2.6 ALV病原学检测方法 |
| 1.2.7 ALV的预防和控制 |
| 1.3 病毒准种的研究现状 |
| 1.3.1 病毒的准种概念与基本特性 |
| 1.3.2 测序技术与病毒准种的研究 |
| 1.3.3 动物病毒准种的研究进展 |
| 1.4 亚单位疫苗及免疫佐剂的概述 |
| 1.4.1 亚单位疫苗的研究进展 |
| 1.4.2 免疫佐剂的研究概况 |
| 1.4.3 CpG DNA的研究进展 |
| 1.4.4 松花粉多糖的研究进展 |
| 1.5 本研究的目的和意义 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 毒株和细胞 |
| 2.1.2 试验动物 |
| 2.1.3 主要分子生物学试剂及试剂盒 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要试剂的配制 |
| 2.1.6 菌种和载体 |
| 2.2 常规试验操作方法 |
| 2.2.1 鸡胚成纤维细胞（CEF）的制备 |
| 2.2.2 间接免疫荧光（IFA）试验 |
| 2.2.3 ELISA试剂盒检测ALV抗原 |
| 2.2.4 ELISA试剂盒检测ALV抗体 |
| 2.2.5 细胞DNA的提取 |
| 2.2.6 病毒RNA的提取 |
| 2.2.7 PCR扩增 |
| 2.2.8 RT-PCR扩增 |
| 2.2.9 扩增产物的回收及纯化 |
| 2.2.10 PCR产物与T载体连接 |
| 2.2.11 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.12 连接产物的转化 |
| 2.2.13 重组克隆细菌的筛选 |
| 2.2.14 质粒的提取 |
| 2.2.15 质粒的酶切鉴定 |
| 2.2.16 阳性克隆的测序与序列分析 |
| 2.2.17 SDS-PAGE蛋白质电泳 |
| 2.3 我国不同鸡群中禽白血病病毒的流行病学调查及其准种分析 |
| 2.3.1 病毒分离与鉴定 |
| 2.3.2 病毒RNA的提取 |
| 2.3.3 引物的设计与合成 |
| 2.3.4 RT-PCR扩增、克隆测序与序列分析 |
| 2.3.5 同一地方品系鸡群不同个体中ALV-J的准种多样性比较 |
| 2.4 公鸡精液对ALV传播作用的试验设计 |
| 2.4.1 病毒的扩增及定量 |
| 2.4.2 公鸡感染ALV-J实验设计 |
| 2.4.3 公鸡精液中ALV-J的分离及鉴定 |
| 2.4.4 授精母鸡ALV-J感染的测定 |
| 2.4.5 后代雏鸡ALV-J感染的测定 |
| 2.4.6 病毒RNA的提取，gp85基因扩增及其序列分析 |
| 2.5 不同佐剂及免疫增强剂对ALV-J gp85重组蛋白诱导抗体产生的研究 |
| 2.5.1 ALV-J gp85重组蛋白的表达，纯化 |
| 2.5.2 鸡群的免疫试验 |
| 2.5.3 母源抗体对雏鸡保护试验 |
| 2.5.4 雏鸡的病毒分离 |
| 2.6 K亚群ALV的生物学特性及其致病性研究 |
| 2.6.1 K亚群ALV的基因组分析 |
| 2.6.2 K亚群ALV的体外复制能力比较 |
| 2.6.3 K亚群ALV的致病性研究 |
| 2.7 env基因在ALV-K致病作用中的研究 |
| 2.7.1 K亚群禽白血病病毒感染性克隆的构建和病毒拯救 |
| 2.7.2 env(J)-LTR(K) 和 env(K)-LTR(J)的嵌合感染性克隆的构建和病毒拯救（4 个） |
| 2.7.3 拯救病毒的体外复制动力学 |
| 2.7.4 拯救病毒的体内致病性实验设计 3 结果与分析 |
| 3.1 我国不同鸡群中禽白血病病毒的流行病学调查及其准种分析 |
| 3.1.1 我国不同鸡群中ALV的流行病学调查结果 |
| 3.1.2 同一地方品系鸡群不同个体中ALV-J的准种多样性比较 |
| 3.2 公鸡精液对ALV传播作用 |
| 3.2.1 公鸡精液中ALV-J的分离及鉴定结果 |
| 3.2.2 授精母鸡病毒血症、抗体反应及泄殖腔p27检测结果 |
| 3.2.3 授精母鸡产出种蛋中蛋清P27检测结果 |
| 3.2.4 后代雏鸡病毒血症及泄殖腔棉拭子 p27 检测结果 |
| 3.2.5 不同样品中ALV-J gp85基因的序列分析 |
| 3.3 不同佐剂及免疫增强剂对ALV-J gp85重组蛋白诱导抗体产生的研究 |
| 3.3.1 重组蛋白的表达和纯化 |
| 3.3.2 不同的佐剂和免疫增强剂对gp85重组蛋白诱导鸡体产生抗体的作用 |
| 3.3.3 种蛋中ALV-J卵黄抗体的检测 |
| 3.3.4 1日龄雏鸡母源抗体的检测 |
| 3.3.5 母源抗体对ALV-J的攻毒保护结果 |
| 3.4 K亚群ALV的全基因组分析及其致病性研究 |
| 3.4.1 K亚群ALV的全基因组分析 |
| 3.4.2 K亚群ALV的体外复制动态比较结果 |
| 3.4.3 K亚群ALV的致病性研究 |
| 3.5 env基因在ALV-K致病作用中的研究 |
| 3.5.1 K亚群禽白血病病毒感染性克隆的构建和病毒拯救 |
| 3.5.2 env(J)-LTR(K) 和env(K)-LTR(J)的嵌合感染性克隆的拯救与鉴定 |
| 3.5.3 拯救病毒的体外复制动力学 |
| 3.5.4 拯救病毒的体内致病性研究 4 讨论 |
| 4.1 我国不同鸡群中 ALV 的流行病学调查及其准种分析 |
| 4.2 公鸡精液在 ALV 传播中的作用 |
| 4.3 不同佐剂及免疫增强剂对ALV-J gp85重组蛋白诱导抗体产生的研究 |
| 4.4 K亚群ALV的生物学特性及其对SPF鸡的致病性研究 |
| 4.5 env基因在ALV-K致病作用中的研究 5 结论 6 参考文献 7 致谢 8 攻读学位期间发表论文情况 |
（9）ND-IBD二联灭活苗对商品蛋雏鸡免疫效果及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩词列表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 ND与IBD研究进展 |
| 2 ND和IBD疫苗的研究进展 |
| 2.1 ND与IBD活苗的研究进展 |
| 2.2 ND与IBD灭活苗的研究进展 |
| 2.3 疫苗佐剂 |
| 2.4 ND与IBD的疫苗免疫研究进展及注意事项 |
| 3 ND-IBD二联灭活苗研究进展 |
| 4 疫苗对免疫因子的影响 |
| 5 本课题研究的目的与意义 |
| 第二章 ND-IBD二联灭活疫苗免疫1、7日龄商品蛋鸡的免疫效果研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 毒株 |
| 1.3 试验用疫苗 |
| 1.4 试剂及试剂盒 |
| 1.5 主要试验仪器 |
| 1.6 试验用饲料 |
| 1.7 试验基地 |
| 1.8 试验数据分析相关软件 |
| 2 试验设计 |
| 2.1 动物分组 |
| 2.2 抗体检测 |
| 2.3 攻毒保护试验 |
| 2.4 引物的设计与合成 |
| 2.5 组织RNA抽提 |
| 2.6 cDNA的合成 |
| 2.7 实时荧光定量PCR |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 商品蛋鸡血清IBD抗体水平检测 |
| 3.2 ND-IBD二联灭活疫苗对商品蛋鸡IBD抗体的影响 |
| 3.3 ND-IBD二联灭活疫苗对商品蛋鸡ND抗体的影响 |
| 3.4 攻毒保护试验结果 |
| 3.5 ND-IBD二联灭活疫苗对商品蛋鸡法氏囊中CD4~+、CD8~+、IL-6、IFN-βmRNA表达量的影响 |
| 3.6 ND-IBD二联灭活疫苗对商品蛋鸡脾脏中CD4~+、CD8~+、IL-6、IFN-βmRNA表达量的影响 |
| 4 讨论 |
| 第三章 ND-IBD二联灭活疫苗与IBD活疫苗免疫7日龄商品蛋雏鸡的效果比较研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 毒株 |
| 1.3 试验用疫苗 |
| 1.4 试剂及试剂盒 |
| 1.5 主要试验仪器 |
| 1.6 试验用饲料 |
| 1.7 试验基地 |
| 1.8 试验数据分析相关软件 |
| 2 试验设计 |
| 2.1 动物分组 |
| 2.2 抗体检测 |
| 2.3 攻毒保护试验 |
| 2.4 引物设计与合成 |
| 2.5 组织RNA抽提 |
| 2.6 cDNA的合成 |
| 2.7 实时荧光定量PCR |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 ND-IBD二联灭活疫苗与弱毒活苗对商品蛋鸡IBD抗体的影响 |
| 3.2 攻毒保护试验结果 |
| 3.3 ND-IBD二联灭活疫苗与弱毒活苗对商品蛋鸡法氏囊中CD4~+、CD8~+、IL-6、IFN-βmRNA表达量的影响 |
| 3.4 ND-IBD二联灭活疫苗与弱毒活苗对商品蛋鸡脾脏中CD4~+、CD8~+、IL-6、IFN-βmRNA表达量的影响 |
| 4 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（10）不同佐剂对鸡新城疫病毒（La sota株）和禽流感病毒（X-19株）联合免疫的影响（论文提纲范文）
| 致谢 摘要 缩略词表 文献综述 |
| 1. 禽流感、新城疫病原学概述 |
| 1.1 禽流感病毒的病原学概述 |
| 1.2 新城疫病毒的病原学概述 |
| 2. 禽流感、新城疫流行病学 |
| 2.1 禽流感世界流行情况 |
| 2.2 禽流感国内流行情况 |
| 2.3 新城疫世界流行情况 |
| 2.4 新城疫国内流行情况 |
| 3. 禽流感、新城疫疫苗与佐剂研究进展 |
| 3.1 禽流感疫苗与佐剂研究现状 |
| 3.1.1 全病毒灭活疫苗 |
| 3.1.2 重组活载体疫苗 |
| 3.1.3 基因工程亚单位疫苗 |
| 3.1.4 DNA疫苗 |
| 3.2 新城疫疫苗与佐剂研究现状 |
| 3.2.1 弱毒疫苗 |
| 3.2.2 灭活疫苗 |
| 3.2.3 基因工程疫苗 |
| 4. 新流联合免疫研究现状 |
| 5. 结语 引言 试验一 不同佐剂制备鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联免疫制剂及其安全性研究 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒 |
| 1.1.2 佐剂 |
| 1.1.3 实验动物 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.1.5 主要试剂及配制 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 制苗病毒抗原的制备 |
| 1.2.2 病毒液的检验 |
| 1.2.3 病毒液的浓缩 |
| 1.2.4 灭活 |
| 1.2.5 半成品检验 |
| 1.2.6 疫苗制备 |
| 1.2.7 安全性试验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 种毒检测结果 |
| 2.1.1 新城疫La Sota毒鸡胚最小致死量的平均死亡时间（MDT） |
| 2.1.2 禽流感病毒X-19 株静脉接种指数（IVPI） |
| 2.1.3 禽流感病毒X-19 株1日龄鸡脑内接种致病指数（ICPI） |
| 2.2 病毒液的检验结果 |
| 2.2.1 病毒含量检测结果 |
| 2.2.2 无菌检验结果 |
| 2.2.3 HA效价检测结果 |
| 2.3 抗原浓缩结果 |
| 2.4 安全性试验结果 |
| 2.4.1 不同佐剂制备的免疫制剂对试验鸡损伤的剖检 |
| 2.4.2 不同佐剂制备的免疫制剂对试验鸡的组织水平观察 |
| 3 结论与讨论 实验二 鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活苗免疫效力试验 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒株 |
| 1.1.2 疫苗 |
| 1.1.3 实验动物 |
| 1.1.4 主要试剂及配制 |
| 1.1.5 主要仪器设备 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 血清学效力试验 |
| 1.2.2 血清抗体检测 |
| 1.2.3 免疫攻毒试验 |
| 1.2.4 攻毒后排毒检测 |
| 1.2.5 淋巴细胞免疫表型分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 血清学效力试验结果 |
| 2.2 免疫攻毒保护结果 |
| 2.2.1 实验组与对照组实验动物攻毒后临床症状 |
| 2.2.2 攻毒保护结果 |
| 2.3 淋巴细胞免疫表型分析结果 |
| 3 结论与讨论 全文总结 参考文献 ABSTRACT |
四、蜂胶对NDV的灭活作用效果观察（论文参考文献）
- [1]HP-PRRS重组NDV载体疫苗构建、免疫评价及其佐剂研究[D]. 张赫. 军事科学院, 2020(02)
- [2]中国蜂胶对人胰腺癌Panc-1细胞的抑制作用及其机制研究[D]. 陈曦. 浙江大学, 2020(01)
- [3]蜂胶对细菌脂多糖诱导乳腺炎保护作用的研究[D]. 欧爱群. 福建农林大学, 2020(02)
- [4]鸡新城疫病毒增殖培养细胞系的筛选与稳定表达唾液酸转移酶（ST6Gal）细胞株的构建及其应用[D]. 董炳梅. 吉林大学, 2019
- [5]β-葡聚糖对鸡新城疫灭活疫苗免疫效应的影响[D]. 韩紫轩. 东北农业大学, 2018(02)
- [6]浒苔多糖协同蜂胶对H9N2亚型禽流感灭活病毒黏膜免疫效果的影响[D]. 周长明. 山东农业大学, 2018(09)
- [7]融合三肽囊素作为ALV先天感染鸡群生长及免疫调节剂应用初探[D]. 安亚娟. 福建农林大学, 2018(02)
- [8]我国地方品系鸡群中ALV的流行病学调查及ALV-K生物学特性的研究[D]. 李阳. 山东农业大学, 2017(01)
- [9]ND-IBD二联灭活苗对商品蛋雏鸡免疫效果及机制研究[D]. 星东. 福建农林大学, 2017(01)
- [10]不同佐剂对鸡新城疫病毒（La sota株）和禽流感病毒（X-19株）联合免疫的影响[D]. 潘梦梦. 河南农业大学, 2016(05)