一、小鼠小肠隐窝素基因的表达及大黄对其表达的影响（论文文献综述）
高瑞娟[1]（2021）在《蒙药“巴布-7”对大肠杆菌性腹泻小鼠肠黏膜屏障保护机制的相关研究》文中研究指明大肠杆菌性腹泻是致死率较高的一种传染病,造成严重畜牧业经济损失。蒙药巴布-7（Babu seven compound,BBS）对腹泻有较强的临床疗效。但BBS对大肠杆菌性腹泻肠道屏障功能的研究较少。为研究BBS对大肠杆菌性腹泻肠道屏障功能的影响。本研究开展如下实验:实验1:为建立大肠杆菌性腹泻模型,将90只小鼠分为空白对照组（VG,口腔灌服生理盐水,n=10）,模型Ⅰ组（MGⅠ,腹腔注射1.0×109CFU/m L E.coli O1,n=20）,模型Ⅱ组,（MGⅡ,口腔灌服1.0×109CFU/m L E.coli O1,n=20）,模型Ⅲ组,（MGⅢ,单次口腔灌服2%Na HCO3和1.0×109CFU/m L E.coli O1,n=20）,模型Ⅳ组,（MGⅣ连续1次/3 d口腔灌服2%Na HCO3和1.0×109CFU/m L E.coli O1,n=20）,攻毒后连续观察7 d,观察小鼠腹泻率、死亡率、DAI评分、肠道病变并检测炎性因子。结果表明,MGⅠ小鼠出现腹泻症状,死亡率达75%。MGⅡ小鼠未见异常;MGⅢ小鼠腹泻率达60%,死亡率达15%,腹泻症状于攻毒24 h后自愈。MGⅣ小鼠腹泻率达65%,死亡率达15%,存活小鼠腹泻、精神萎靡、厌食等症状可以持续72 h以上,且肠道病理变化和炎性因子均显着高于正常对照组。结果显示,连续3 d（1次/d）灌服2%碳酸氢钠溶液和1.0×109CFU/m L的致病性E.coli O1可以成功建立小鼠腹泻模型。实验2:为研究蒙药BB对大肠杆菌性腹泻小鼠肠黏膜生物屏障的影响。采用16S rDNA测序技术对小鼠盲肠微生物进行测序。通过α多样性和β多样性来综合分析BBS对大肠杆菌性腹泻小鼠肠黏膜屏障的影响。结果显示,E.coli O1入侵会降低Chao1、Ace、Shannon指数（P<0.05）,升高Simpson指数（P<0.05）,而BBS和EM治疗会升高Chao1、Ace、Shannon指数,降低Simpson指数（P<0.05）。E.coli O1的入侵会降低肠道菌群的多样性和丰富度及拟杆菌门、拟杆菌目、拟杆菌属、疣微菌门、疣微菌目、乳杆菌目、乳杆菌属的相对丰度（P<0.05）;升高拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、梭菌属、梭菌目、肠杆菌目、肠球菌属的相对丰度（P<0.05）。而BBS-H和Em-H治疗可以可以恢复菌群结构并增加有益菌丰度,降低有害菌丰度。说明,蒙药BBS-H和Em-H可以修复致病性E.coli O1造成的肠生物屏障损伤。实验3:为研究BBS对大肠杆菌性腹泻小鼠肠黏膜机械屏障影响。将125只小鼠分为9组,分别为正常对照组（VG,n=10）、模型组（MG,n=10）、阳性对照组（CG,n=15）、蒙药巴布-7高、中、低剂量组（BBS-H,BBS-M,BBS-L,n=15）、大黄素高、中、低剂量组（Em-H,Em-M,Em-L,n=15）。灌胃治疗7 d,于第8 d杀死小鼠,采集样本。光镜观察小鼠肠道病理损伤并计算绒腺比（Villus height/Crypt depth,V/C）;透射电镜观察小鼠肠道超微结构;RT-PCR、免疫组化、Western blot检测Claudin-1、Occludin、ZO-1、MLCK、JAMA的基因及蛋白表达量;ELISA法检测小鼠血清中DAO、D-LA、ET含量。结果显示:MG各肠段肠绒毛断裂,炎性细胞浸润、V/C比值降低（P<0.05）,紧密连接相关蛋白Claudin-1、Occludin、ZO-1、MLCK、JAMA表达下降（P<0.05）,血清中DAO、D-LA、ET含量显着升高（P<0.05）。而蒙药BBS-H组和Em-H组可以缓解肠道损伤（P<0.05）,提高V/C值及紧密连接相关蛋白表达量（P<0.05）,降低血清中DAO、D-LA、ET含量。表明,蒙药BBS-H和Em-H可以通过提高紧密连接相关蛋白的表达来降低肠黏膜通透性,从而来修复致病性E.coli O1造成的肠道机械屏障损伤（P<0.05）。实验4:为研究BBS对大肠杆菌性腹泻小鼠肠黏膜免疫屏障影响。流式细胞术检测CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD19+B细胞和TH1、TH2细胞百分含量并计算CD4+/CD8+比值;ELISA法检测小鼠十二指肠中免疫相关细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ、TGF-β、IL-17、IL-23、SIg A含量,血清中免疫球蛋白Ig M、Ig G、lg A含量。结果显示,MG中CD3+T、CD4+T、CD19+B的百分比及CD4+/CD8+比值显着降低（P<0.05）,IL-1β、IL-6、IL-8、NO、TNF-α、IL-17、IL-23显着升高（P<0.05）,IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ、TGF-β、SIg A、Ig M、Ig G、lg A显着降低（P<0.05）。蒙药BBS-H和Em-H治疗可提高CD3+T、CD4+T、CD19+B的百分比及CD4+/CD8+的比值（P<0.05）,降低IL-1β、IL-6、IL-8、NO、TNF-α、IL-17、IL-23含量（P<0.05）,提高IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ、TGF-β、SIg A、Ig M、Ig G、lg A含量（P<0.05）。表明,蒙药BBS-H和Em-H可以修复大肠杆菌造成的免疫屏障损伤。实验5:为研究BBS对大肠杆菌性腹泻小鼠肠黏膜化学屏障影响。PAS染色观察肠上皮杯状细胞;免疫荧光法检测小鼠十二指肠中MUC-2含量;ELISA法检测小鼠十二指肠中肠三叶因子、溶菌酶、二糖酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶活力。结果显示,致病性E.coli O1降低杯状细胞数量及MUC-2、TFF3含量,减弱溶菌酶、二糖酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶活力（P<0.05）,蒙药BBS-H和Em-H治疗可以显着提高杯状细胞数量及MUC-2、TFF3含量,提高溶菌酶、二糖酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶活力（P<0.05）。表明,蒙药BBS-H和Em-H可以修复致病性E.coli O1造成的肠化学屏障损伤。
赵梦雅[2]（2020）在《苦荞D-手性肌醇与多酚类化合物协同降糖作用机制研究》文中研究表明糖尿病已成为继心脑血管和恶性肿瘤之后的第三大疾病,严重影响人类健康,II型糖尿病占90%。持续高血糖是糖尿病的重要发病因素之一,因此控制血糖是缓解II型糖尿病的关键。本研究从药食同源和普通食品中获取降糖因子,对其进行跟踪调查及分离鉴定,研究其体外协同降糖作用和体内降糖活性,揭示肝脏糖代谢机制,对辅助治疗II型糖尿病具有实际意义。首先,本文采用体外实验筛选降糖因子,苦荞D-手性肌醇（DCI）、绿茶EGCG和山楂提取物通过促进细胞消耗葡萄糖或抑制α-葡萄糖苷酶活性来降糖。其次,采用单因素、爬坡及响应面实验优化苦荞DCI提取方案,柱层析技术分级纯化及高效液相分析,对山楂有效成分进行活性跟踪及LC-MSMS鉴定。再次,建立ChouTalalay模型,采用体外实验探究苦荞D-手性肌醇与多酚类化合物体外协同降糖作用。最后,STZ诱导糖尿病动物模型,探究体内糖代谢作用,并用Western blot研究肝脏PI3K/AKT/FOXO1和GSK3相关信号通路调节机制。体外实验筛选降糖因子,最终确定苦荞DCI、绿茶EGCG和山楂提取物为增加细胞葡萄糖消耗和α-葡萄糖苷酶抑制剂成分。苦荞DCI最佳提取方案:50%乙醇,p H 3,料液比1:25,50℃,400 W超声30 min,得率为2.83%;经大孔树脂H103、DEAE-纤维素柱后高效液相测其纯度高达63.98%。山楂提取物经D101大孔树脂、硅胶和Sephadex LH-20凝胶确定抑制α-葡萄糖苷酶活性成分为HP。苦荞DCI与多酚类化合物（绿茶EGCG,山楂HP）协同抑制α-葡萄糖苷酶活性（CI=0.89）,促进细胞消耗葡萄糖,抑制糖异生,促进糖原合成。体内实验发现苦荞DCI与多酚类化合物（DEH）可降低STZ诱导糖尿病小鼠口服葡萄糖耐量和胰岛素水平,缓解胰岛素抵抗;降低TC、TG、FFA和LDL-C,提高HDL-C改善脂代谢紊乱;降低IL-6和TNF-α减少炎症反应;降低糖化血红蛋白和瘦素,升高胰高血糖素样肽-1和脂联素,调节胰岛素分泌;抑制谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性保护肝脏细胞;抑制小肠α-葡萄糖苷酶活性减少碳水化合物水解;小鼠肝/肾脏、胰腺病理学切片可见,DEH恢复糖尿病小鼠组织损伤,且PAS染色糖原含量升高,葡萄糖储存增加。western blot分析DEH激活了PI3K/AKT信号通路,促进FOXO1磷酸化失活,降低PEPCK和G6Pase酶活性,减少非糖物质转化,同时促进GSK3磷酸化失活,抑制GS磷酸化失活,增加肝脏葡萄糖储存。综上,苦荞DCI与多酚类化合物显示协同降糖作用,本研究为新型复合降糖保健食品和药物的研发提供理论依据。
王安[3]（2020）在《基于“脾为之卫”探讨益气解毒方对急性放射损伤小鼠的防护研究》文中研究说明背景:随着核能的广泛应用,放射诊疗手段的普及,人类暴露于辐射环境的可能性大大增加。当机体一次或短时间（数日）内受到>1 Gy的均匀或比较均匀的全身照射,即可引起急性放射损伤,这极大地威胁到人们的生命健康,因此对于辐射防护剂的研究一直是电离辐射相关研究的重点。然而,现有辐射防护剂存在着诸如毒副作用大、价格昂贵、效果不稳定或治疗窗小等问题,一定程度上限制了其在临床的普及推广。近年来,中医学界对放射损伤进行了一系列探索,在病因学、治疗学方面都取得了一定进展,中草药以其安全、方便口服、吸收迅速、价格低廉等特点,被认为是辐射防护剂研究的新热点。但目前,相关研究多集中在单味药或中药单体上,中药复方研究较少,难以凸显中药多系统、多靶点、整体防护的作用优势。同时,中医药防治放射损伤的理论体系尚未构建,“理法”阐释不够透彻、全面,“方药”选择亦缺少系统的理论支持,且围绕药效及机制的实验研究与中医理论间的关联性不强,这些问题一定程度上限制了中医药在辐射防护领域的应用与发展。基于上述问题,课题组展开了一系列探索,在理论研究上将急性放射损伤的中医学病因命名为“电离毒”,并明确了中医“脾”在电离辐射致病过程及防治方法中均具有重要地位。中医“脾”的功能定位涵盖了现代解剖学的脾脏及肠道,这两者均是重要的免疫器官,在免疫防御中发挥作用,从而保护机体。对于“脾”的这种护卫机体的功能,中医有“脾为之卫”之说,认为“脾”在疾病发生、传变、防治方面均具有重要地位。生理情况下,“脾”旺则不受邪,这与现代医学认为脾脏、肠道发挥免疫功能、护卫机体的作用不谋而合;病理情况下,“脾”伤则百病由生,这与现代医学认为射线易致脾脏和肠道免疫损伤,进而引发机体防御功能下降,引发并发症的病理过程相似。因此,本研究首次将中医“脾为之卫”理论引入急性放射损伤的研究中,并以此为切入点,对急性放射损伤的中医病机、治则治法、组方用药进行探讨,以期进一步补充、完善放射损伤的中医理论体系。并在此基础上自拟益气解毒中药复方,利用急性放射损伤小鼠模型,总结照射后脾脏及肠道免疫的损伤特点,探究益气解毒方对急性放射损伤小鼠脾脏及肠道免疫的防护效应和机制,为从“脾失之卫”论治放射损伤的中医病机,以及“补脾实卫,益气解毒”的防治方法,提供现代科学依据。目的:在理论上明确“脾为之卫”的源流与内涵,并从“脾失之卫”探讨急性放射损伤的中医学病机,为“补脾实卫,益气解毒”的防治方法提供理论依据;在实验研究中,首先总结电离辐射对小鼠脾脏及肠道免疫的损伤特点,然后探究益气解毒方对小鼠脾脏及肠道免疫的防护效应,为从“脾失之卫”论治放射损伤的中医病机,以及“补脾实卫,益气解毒”的防治方法,提供现代科学依据。最后,围绕“铁死亡”这一近些年发现的新型细胞死亡方式,通过分子生物学实验技术,探讨益气解毒方预防急性放射损伤的潜在药理学机制,为其今后的临床应用和推广提供科学支持。方法:理论研究:（1）查阅、分析古代文献记载,阐述“脾为之卫”理论的源流与内涵;（2）分析急性放射损伤的临床表现,结合中医理论,从“脾失之卫”探讨急性放射损伤的各阶段病机;（3）根据分析得出的中医病机,从“补脾实卫,益气解毒”论证急性放射损伤各阶段的防治方法,为益气解毒方的组方提供依据。实验研究:（1）2.0 Gy 60Coγ射线一次性全身照射,照后1、3、7、14、21 d观察脾脏及肠道免疫损伤特点,为中药防护效应研究提供基础。（2）预防性给药10 d,2.0 Gy 60Co γ射线一次性全身照射,照后1、3、7天,观察益气解毒方对脾脏及肠道免疫的防护效应。（3）根据中药的防护特点,围绕“铁死亡”这一近些年发现的新型细胞死亡方式,通过分子生物学实验技术,探讨益气解毒方防护急性放射损伤的潜在药理学机制。结果:理论研究:（1）“脾为之卫”理论肇起于《黄帝内经》,经过历代医家的诠释与补充,得以不断完善与发展。通过文献研究,我们认为其内涵包括:脾主运化水谷精微,长养肌肉,抵御外邪;脾为五脏六腑之源,灌溉四傍,脏安难伤;脾为气血化生之源,化生卫气,防御外邪。（2）通过分析急性放射损伤各个阶段的临床表现,我们从“脾失之卫”角度对其阶段病机进行论述。我们认为:在急性放射损伤发病之初,其中医病机为“毒邪致病,伤于脾卫”;在疾病发展、变化阶段,中医病机为“脾失之卫,百病由生”;在疾病转归、预后阶段,中医病机为“脾卫渐复,抗邪外出”。（3）我们根据急性放射损伤的中医病机,提出“补脾实卫,益气解毒”的基本防治原则,并根据损伤不同阶段的侧重,提出分阶段的防治方法。我们认为,在损伤发生之前,以“未病先防,补脾实卫”为原则;感病之后以“既病防变,益气解毒”为原则;恢复阶段以“瘥后防复,益气扶正”为原则。在此基础上,我们对益气解毒方进行了组方分析,我们认为该方,配伍精当,用药以补脾、益气、实卫为主,清热解毒、养阴生津为辅,具有“补脾益气,清热解毒”之功,符合照射前“未病先防,重补脾实卫”的治疗原则。且复方中多味药物为药食两用之品,药性平和,作为预防性给药不会造成机体阴阳偏颇。实验研究:（1）①根据急性放射损伤的定义,以及课题组前期研究基础,本研究采用2.0 Gy 60Coγ射线一次性全身照射,成功复制急性放射损伤小鼠模型。②从整体情况及脾脏、肠道免疫的变化规律来看,对Balb/c小鼠行2.0 Gy 60Co γ射线一次性全身照射,照后1d即可观察到显着损伤,其中整体情况及脾脏免疫在照后3d损伤最为严重,照后7 d出现好转,肠道免疫在照后1 d损伤最为严重,3 d可观察到好转。提示照后7 d之内为损伤发生、发展、变化的关键期,亦是观察防护效果的重要时期,故下一步将选取照后1、3、7d进行中药的防护效应研究。③上述小鼠照射后整体情况与脾脏、肠道免疫的变化特点表明,急性放射损伤小鼠存在“脾失之卫”这一病理表现,且“脾卫”功能的损伤及恢复情况在很大程度上影响着整体的病情变化,为从“脾失之卫”探讨急性放射损伤的中医病机提供了科学支持。（2）益气解毒方对2.0 Gy 60Co γ射线一次性全身照射后引发的整体及脾脏、肠道免疫损伤有一定的防护效应,具体表现为:促进整体情况的恢复;抑制照后脾脏及肠道免疫细胞的减少,促进免疫细胞数量恢复,改善脾脏、肠道组织结构;改善照后脾脏及肠道免疫细胞亚群分布,调控照后相关细胞因子的分泌,进而促进机体免疫平衡的恢复;减轻电离辐射引发的脾脏、肠道氧化损伤。（3）益气解毒方通过减轻照后氧化应激水平、抑制铁过载、调控LPCAT3/LOX途径,来抑制照后细胞铁死亡,进而发挥辐射防护作用。现代药理学研究表明,复方中的一些药物或其活性成分,具有明确的抗氧化、调控铁代谢、防辐射作用,这些成分或成为益气解毒方抑制铁死亡、发挥辐射防护作用的潜在物质学基础。结论:理论研究表明,“脾失之卫”为急性放射损伤的重要病机,益气解毒方以“补脾实卫,益气解毒”为治则组方,符合其基本病机。动物实验表明2.0 Gy60Co γ射线一次性全身照射,可致小鼠脾脏及肠道免疫损伤,益气解毒方对急性放射损伤小鼠脾脏及肠道免疫具有一定防护效果,为从“脾失之卫”论治急性放射损伤的中医病机,以及“补脾实卫,益气解毒”的防治方法,提供现代科学依据。进一步的机制研究表明,益气解毒方可能通过抑制照后细胞铁死亡,进而发挥辐射防护作用。
高启霞[4]（2020）在《辣木叶对慢性便秘的治疗作用及蛋白质组学研究》文中研究指明目的:辣木叶为辣木科辣木属植物辣木的叶子,属于域外药材,具有治疗便秘的传统应用。便秘是一种常见的消化道疾病,患病率随着年龄的增长而增加,严重影响患者生活质量。目前,关于辣木叶治疗便秘的研究较少。本实验利用正常小鼠、洛哌丁胺诱导的慢性便秘小鼠、低膳食纤维饮食诱导的慢性便秘大鼠,观察辣木叶促排便作用,利用无标记定量蛋白质组学技术研究辣木叶改善便秘的作用机制。方法:1.辣木叶水提物对正常小鼠的促排便作用:观察辣木叶给药1次和7次对正常小鼠排便数量、含水量的影响;观察给药7次后,对小鼠小肠炭末推进率及肝、肾、结肠组织形态的影响。2.辣木叶水提物对洛哌丁胺所致便秘小鼠的促排便作用:正常小鼠灌服15mg/kg盐酸洛哌丁胺3天,建立慢性便秘小鼠模型,以粪便数量评价模型成功与否。观察辣木叶水提物低（1.75g/kg）、中（3.5g/kg）、高（7 g/kg）剂量给药1次和7次对便秘小鼠排便数量、含水量的影响;给药7次后,进行小肠炭末推进率实验。3.辣木叶水提物对低膳食纤维饮食诱导的便秘大鼠的影响:饲喂低膳食纤维饲料建立便秘大鼠模型。辣木叶水提物低（0.625g/kg）、中（1.25 g/kg）、高剂量（2.5 g/kg）给药第7天收集大鼠粪便,记录大鼠体重、摄食量及粪便重量、数量和含水量;给药结束后取大鼠结肠及胃窦组织,HE染色和阿尔新蓝染色观察辣木叶对大鼠结肠组织的影响;ELISA检测胃窦中Gas、MTL含量及结肠中VIP、SP、NPY的含量。4.Lable-free蛋白质组学研究:大鼠结肠组织经裂解制备受试样本,采用LC-MS/MS联用技术进行分析检测。在Proteome Discovery version2.2.0.388蛋白质组学处理平台,使用Mascot搜索引擎在UniProt大鼠蛋白质数据库上搜索碎片,对蛋白质进行鉴定;通过峰面积法对蛋白进行定量。将定量后的蛋白质数据利用SPSS软件进行数据处理,P<0.05为差异表达蛋白。利用Gene Ontology数据库对差异表达蛋白进行生物学过程、细胞成分、分子功能注释和信号通路富集分析。Uniprot及String数据库用于解释差异蛋白的功能和相互作用关系。5.Western blot验证候选差异蛋白的表达:对“5-HT1型受体介导的信号传导途径”和“毒蕈碱乙酰胆碱受体-2和-4信号传导途径”中的Vamp2、Gnai3、Prkacb蛋白进行验证。结果:1.给药1次后,辣木叶高、中、低剂量组小鼠所排黑色粪便数及粪便含水量显着高于正常对照组（P<0.05）;低剂量显着增加小鼠排便总数（P<0.05）。给药7次后,辣木叶高、中、低剂量组小鼠所排黑色粪便数较正常对照组显着增加（P<0.05）;中、高剂量组小鼠的粪便含水量显着增加（P<0.05）。在小肠炭末推进率实验中,高剂量小鼠的小肠炭末推进率显着增加（P<0.05）。HE结果显示,辣木叶水提物低、中、高剂量对正常小鼠的肝、肾、结肠组织影响较小。2.正常小鼠洛哌丁胺造模3天后,粪便总数显着低于正常对照组（P<0.05）,证明便秘模型已建立。便秘小鼠灌服辣木叶水提物1次后,小鼠所排黑色粪便数及黑色粪便含水量较模型组显着增加（P<0.05）。给药7次后,辣木叶对小鼠的排便没有明显改善作用。小肠炭末推进率实验显示,与模型组比较,辣木叶高、中剂量显着增加便秘小鼠的小肠炭末推进率（P<0.05）。3.低膳食纤维饮食饲喂大鼠21天后,与正常对照组比较,大鼠粪便数量、重量、含水量均显着降低（P<0.05）。造模成功后,大鼠灌胃给予辣木叶水提物7天,与模型组相比,辣木叶水提物中、高剂量可显着增加粪便含水量（P<0.01）。HE和阿尔新蓝染色显示,辣木叶给药组大鼠结肠部位肌层厚度和黏蛋白的分泌有所增加,但不具有显着性。ELISA结果显示,与模型组比较,辣木叶的中、高剂量显着增加大鼠胃窦中的Gas、MTL和结肠中的VIP、SP的含量（P<0.01）。4.结肠部位的蛋白质鉴定和定量后,共有3575个蛋白被识别和定量化,其中1731个蛋白表达具有显着性差异（P<0.05）。Gene Ontology分析后,1731个差异表达蛋白共涉及116个生物过程、78个细胞成分、75个分子功能和15条信号通路。所鉴定的蛋白质多为胞浆蛋白,涉及细胞代谢、蛋白质合成等多种生物学过程,具有催化活性、水解酶活性、核酸结合活性等功能。在15条信号通路中,多巴胺受体介导的信号通路（P05912）、尼古丁药效学途径（P06587）、Beta2肾上腺素受体信号传导途径（P04378）、Beta1肾上腺素能受体信号通路（P04377）、泛素蛋白酶体途径（P00060）、5-HT1型受体介导的信号通路（P04373）、帕金森综合症（P00049）、毒蕈碱型乙酰胆碱受体2和4信号通路（P00043）、亨廷顿病（P00029）这9条信号通与胃肠道运动和肠液分泌相关,为辣木叶治疗便秘的相关作用信号通路。由于5-HT和Ach是肠神经系统中重要的神经递质,对便秘的发生与治疗非常重要。本研究对5-HT受体和Ach受体所介导的信号通路深入分析,发现5-HT和Ach通过GPCR-cAMP-PKA途径作用于K+与Ca2+通道,与肠液的分泌和肠道运动相关,可能为辣木叶治疗便秘的信号通路。5.Western blot法对“5-HT1型受体介导的信号通路”和“毒蕈碱型乙酰胆碱受体2和4信号通路”中的差异表达蛋白Vamp2、Gnai3、Prkacb的进行验证,结果发现Vamp2、Gnai3、Prkacb在模型组中表达均下降,在辣木叶低剂量组中均增加,与蛋白质组学检测结果基本一致。结论:1.辣木叶水提物可改善便秘引起的结肠组织变化,增加结肠肌层厚度和黏蛋白分泌;同时影响便秘大鼠胃窦及结肠组织内胃肠激素的含量,通过促进结肠运动与分泌,发挥促排便作用。2.蛋白质组学结果表明,辣木叶可通过5-HT1型受体介导的信号通路、毒蕈碱型乙酰胆碱受体2和4信号通路、多巴胺受体介导的信号通路、尼古丁药效学途径、肾上腺素受体信号传导途径、泛素蛋白酶体途径、帕金森综合症途径和亨廷顿病途径发挥治疗作用。Western blot进一步验证5-HT和乙酰胆碱受体所介导的GPCR-cAMP-PKA途径中的差异表达蛋白Vamp2、Gnai3、Prkacb,验证结果与蛋白质组学实验结果一致,表明辣木叶可通过这两条信号通路发挥治疗便秘的作用。
赵高梅[5]（2019）在《HD5衍生抗生素的设计、制备及其对小鼠辐射后细菌感染的救治作用》文中研究表明人体受大剂量射线照射后免疫力降低,容易被病原微生物感染,加重放射损伤的病情。辐照后服用正确的抗生素可以有效缓解感染。但近年来,由于抗生素滥用致使耐药菌感染的病例频发,越来越多“超级细菌”的出现对本身免疫力降低的受辐照患者来说非常不利。抗菌肽是一类可以杀灭细菌、原生动物、真菌和病毒的小分子多肽,广泛存在于微生物、植物、动物体内,是机体天然免疫的重要组成成分。人防御素5（human defensin5,HD5）是小肠隐窝基底部潘氏细胞分泌的阳离子抗菌肽,是人体6种α防御素中抗菌谱最广的分子,有望被开发为新型抗生素。由于HD5在复杂的体液环境中抗菌活性受限,课题组前期通过适应性进化位点突变,成功筛选到衍生肽T7E21R-HD5。该多肽稳定性好,抗菌作用突出,且不易被耐药菌耐受,具有较好的药物开发前景。肠源性抗菌肽是理想的肠道感染抗生素替代物,如何将活性多肽递送到肠腔、实现药物在肠道中的可控释放,是将T7E21R-HD5开发为口服肠道抗生素需要解决的关键问题。为此,本研究以介孔二氧化硅纳米颗粒（mesoporous silica nanoparticle,MSN）为载体,以琥珀酰酪蛋白（succinylated casein,SCN）为外衣,成功制备出了可在肠道中可控释放的MSN@T7E21R-HD5@SCN复合纳米抗生素,并探讨了其对外源细菌性感染肠炎及放射性肠炎的救治作用。此外,基于T7E21R-HD5的结构-效应关系研究,我们利用丙氨酸和精氨酸突变,设计并筛选出在体外和体内均具有高效抗多重耐药鲍曼不动杆菌的线性多肽,探讨其对辐射后小鼠肺部感染的作用。进一步推进了T7E21R-HD5的药用开发。本研究取得的主要成果如下:1.利用溶胶凝胶法制备的MSN粒径均一、分散性好,可通过静电吸附作用负载T7E21R-HD5多肽,负载率高达70%。通过孔径和比表面积检测、醋酸尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳成像、X射线能量色散谱以及质谱检测等方法对MSN@T7E21R-HD5进行鉴定,确定多肽成功负载。2.最低抑菌浓度（MIC）检测和激光共聚焦结果显示,MSN@T7E21R-HD5致死革兰阴性大肠杆菌（ATCC 25922）、临床多重耐药大肠杆菌以及革兰阳性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA,ATCC 43300）的能力显着强于T7E21R-HD5。与之相对应,MSN@T7E21R-HD5诱导大肠杆菌菌膜去极化的作用优于游离多肽。3.MSN@T7E21R-HD5呈浓度依赖地破坏细菌内、外膜,效应明显强于等浓度T7E21R-HD5。激光共聚焦和扫描电镜观察到MSN@T7E21R-HD5以吸附-聚集-渗透-崩解步骤杀灭细菌。而且,相同多肽浓度时,相较于T7E21R-HD5,MSN@T7E21R-HD5对细菌膜的机械损伤更大。4.MSN@T7E21R-HD5表面修饰SCN后,纳米颗粒粒径增大。电位检测、醋酸尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳成像以及透射电镜证实SCN的成功包裹。SCN修饰显着降低T7E21R-HD5在强酸环境中的释放,减少了多肽在胃酸环境中损失。在胰酶的催化作用下,SCN包裹能够实现MSN@T7E21R-HD5在肠道中的可控释放。5.MSN@T7E21R-HD5@SCN溶血性和细胞毒性低,体内毒性低。口服MSN@T7E21R-HD5@SCN能够显着降低外源性多重耐药大肠杆菌在肠腔中的定殖,减少细菌侵袭引起的炎症因子释放,缓解感染症状。口服MSN@T7E21R-HD5@SCN还可以缓解肠型放射病腹泻症状,降低菌血症的发生率,减少小鼠血清内毒素的含量。6.保留T7E21R-HD5的C端活性区域,将半胱氨酸替换为丙氨酸,非疏水和非正电荷氨基酸替换为精氨酸,可以得到线性肽T7E21R-HD5-d3;该衍生肽在水溶液和脂环境中分别呈现无规则卷曲和α螺旋结构,可以通过固相化学合成法制备。7.T7E21R-HD5-d3抗多重耐药鲍曼不动杆菌（鲍曼）活性极强,MIC低至2.5μg/mL。T7E21R-HD5-d3生物安全性好,滴鼻给药可以显着提高辐照后肺部感染小鼠的存活率,降低耐药鲍曼在肺部的定殖。8.生物膜干涉、NPN摄取实验以及扫描电镜结果提示,T7E21R-HD5-d3结合鲍曼外膜蛋白A和破坏细菌外膜的能力显着强于T7E21R-HD5。此外,亚致死剂量的T7E21R-HD5-d3能够渗透进入鲍曼胞内并结合50S核糖体蛋白,干扰核糖体蛋白质合成,抑制细菌生长。
苏国旗[6]（2019）在《猪β防御素114的表达调控机制及其在缓解肠道屏障炎性损伤中的作用研究》文中研究指明防御素是哺乳动物先天免疫的重要组成部分,近些年的研究发现防御素具有抗菌活性、促炎抗炎、适应性免疫等多种生物学功能,既具有开发成抗生素替代品的潜力,又可以作为提高抗病力的药物靶点。2012年通过对猪的基因组比对分析发现了猪βdefensin 114（PBD114）,目前为止PBD114的表达调控机制,生物学功能及其机制尚未有报道。因此本研究开展五个试验,首先克隆并分析了PBD114基因序列,比较了不同品种猪PBD114基因表达的差异,探索了PBD114的表达调控机制;在此基础上,成功表达出PBD114蛋白,并以小鼠和IPEC-J2细胞为模型,研究了PBD114在缓解肠道屏障炎性损伤中的作用和机制。主要研究结果如下:试验一PBD114基因的克隆、序列分析及其在不同品种猪间的差异表达藏猪是西藏和川西地区特有的猪种之一,与外种猪相比,具有耐粗饲和抗病力强的优点。本试验分别以藏猪和DLY猪的cDNA为模板,克隆了藏猪和DLY猪PBD114基因CDS序列,用DNAMAN比对分析,且分析了猪、人、大猩猩和瘤牛的βdefensin114的氨基酸序列。结果表明:藏猪和DLY猪的PBD114基因CDS区序列完全一致,猪、人、大猩猩和瘤牛的beta defenisn 114同源性比较近;为研究PBD114在不同品种猪间的表达规律,选取6头60日龄藏猪（6.63±0.85 kg）和6头60日龄DLY三元仔猪（21.72±0.36 kg）,检测PBD114在猪的组织中表达丰度。结果表明:PBD114在DLY猪的十二指肠中表达丰度最高,在藏猪的空肠中表达丰度最高。藏猪的空肠、结肠和肺中的PBD114表达丰度显着高于DLY猪（P<0.05）,然而藏猪的肾脏中PBD114表达丰度显着低于DLY猪（P<0.05）。上述结果表明:Beta defensin 114在不同品种和物种间高度保守,藏猪各组织PBD114表达水平普遍高于DLY猪,提示PBD114可能在猪的健康与免疫调节方面发挥了重要作用,是潜在的抗病基因之一。试验二PBD114基因的表达调控机制研究为探索PBD114在免疫调节中的作用,分别以7日龄DLY仔猪和IPEC-J2为体内外模型,用E.coli K88作为病原菌进行攻毒,研究PBD114基因在免疫激活下的表达规律,结果表明:E.coli K88显着提高了猪十二指肠、空肠和回肠PBD114基因的表达量（P<0.05）以及IPEC-J2的PBD114基因的表达量（P<0.05）,说明PBD114在免疫激活下上调。由于TLRs是介导免疫激活的重要病原菌受体,为探索PBD114的表达受何种信号途径的调控,进一步采用不同的TLRs激活剂Pam3CSK4、Poly（I:C）、LPS、R837（分别为TLR2、3、4和7激活剂）处理IPEC-J2细胞。结果发现:Pam3CSK4显着降低PBD114基因的表达量（P<0.05）;Poly（I:C）、LPS和Imiquimod-R837均显着提高PBD114基因的表达量（P<0.05）。该结果表明,TLR2/3/4/7参与PBD114的表达;TLRs途径的下游是NF-κB和MAPK信号途径,而基因的表达是由转录因子调控。在此基础上,利用JASPAR在线预测发现转录因子NF-κBp65（RELA）和AP-1（FOS和JUN）能够结合PBD114上游启动子区,通过双荧光素酶报告试验证实,转录因子RELA、FOS和JUN均参与了PBD114转录激活,其调控强度为:RELA-JUN>RELA>RELA-FOS>FOS>JUN>FOS-JUN。另外IPEC-J2细胞在E.coli K88攻击下,PBD114基因表达显着提高（P<0.05）,但RELA抑制剂PDTC可显着抑制PBD114基因表达（P<0.05）,结果进一步表明PBD114基因表达受RELA的调控。上述结果表明:免疫激活（如E.coli K88攻击）可上调猪PBD114基因表达,TLR2/3/4/7信号途径均参与了PBD114基因表达的调控,其中,转录因子RELA、FOS和JUN对PBD114的基因表达起关键调节作用。试验三PBD114在大肠杆菌中的异源表达及其生物学特性研究为进一步研究PBD114的生物学特性及功能,将PBD114的成熟肽的DNA构建到表达载体pET32（a+）中,并转化到表达宿主菌Origami B（DE3）构建重组表达菌Origami B-pET32-PBD114,以获得重组PBD114蛋白。通过最优表达条件(最佳表达初始OD600值为0.6、0.8和1.0,最佳IPTG诱导浓度是0.5和1.0 mM,最佳诱导时间是4、6、8和10 h)、亲和层析纯化和蛋白质谱鉴定,成功获得纯度达到95%以上的重组PBD114（rPBD114）,且蛋白质谱结果表明rPBD114的氨基酸序列和NCBI数据库中NP001123445重合度达到100%。在线分析PBD114的蛋白结构和物理化学特性,PBD114同人的beta-defensin 2相似,具有α螺旋和β折叠组成的蛋白结构,带有+1电荷的具有双亲性的多肽。体外抑菌试验表明,rPBD114对E.coli DH5α和E.coli K88+均有较明显的抑制作用,MIC值分别为64和128μg/mL;红细胞溶血与细胞毒性试验则证实,rPBD114几乎没有溶血性和细胞毒性,表明rPBD114安全性较好,可用于后续体内外研究。试验四PBD114缓解肠上皮细胞炎性损伤的作用及其机制肠上皮细胞炎性损伤是导致肠道屏障功能受损的重要原因之一,前面的研究结果已经证实PBD114在免疫激活下表达量显着提高,但其有怎样的免疫调节功能及其调控机制如何。本试验采用双因素设计,先用rPBD114和抑制剂PDTC（抑制NF-κB）、GDC-0994（抑制ERK1/2）和T-5224（抑制FOS）预处理IPEC-J2细胞1 h,再分别用PBS和LPS处理细胞3 h,以此探究PBD114缓解肠上皮细胞炎性损伤的作用及其机制,结果表明:rPBD114和抑制剂显着提高LPS引起的IPEC-J2细胞活性的降低（P<0.05）。rPBD114和抑制剂显着提高ZO-1、claudin-1和occludin的基因表达量（P<0.05）,显着提高ZO-1和claudin-1蛋白表达（P<0.05）。rPBD114和抑制剂显着降低TNFα、IL-1β和IL-6的基因表达量（P<0.05）,显着降低细胞培养液TNFα和IL-1β蛋白浓度（P<0.05）。rPBD114和抑制剂显着降低LPS引起的IPEC-J2早期凋亡、晚期凋亡和总凋亡的提高（P<0.05）,显着增加IPEC-J2的Bcl-2的基因表达量（P<0.05）,显着提高IPEC-J2的Bcl-2/Bax（P<0.05）。显着降低IPEC-J2的Bax的基因表达量（P<0.05）,显着降低caspase 8和caspase 9的蛋白水平（P<0.05）。rPBD114和抑制剂显着降低LPS诱导的IPEC-J2细胞pIκB-α/IκB-α、pNF-κB/NF-κB和pERK1/2/ERK1/2的升高（P<0.05）。上述结果表明:rPBD114可通过降低NF-κB和ERK信号通路关键分子IκB-α、NF-κB和ERK1/2磷酸化水平,减少肠上皮细胞炎性因子表达,进而下调凋亡相关基因和蛋白表达水平,减少肠上皮细胞凋亡。试验五PBD114对LPS诱导小鼠肠道屏障炎性损伤的缓解作用为进一步验证PBD114在缓解肠道屏障炎性损伤中的作用效果,试验将72只3周龄ICR小鼠按照体重相近原则,随机分配到6个试验组:CON（生理盐水）、LOW（4 mg/kg的rPBD114）、HIGH（8 mg/kg的rPBD114）、LPS（生理盐水+10 mg/kg LPS攻毒）、LOW+LPS（4 mg/kg的rPBD114+10 mg/kg LPS攻毒）和HIGH（4 mg/kg的rPBD114+10 mg/kg LPS攻毒）。预饲一周后,按照试验设计所有试验鼠注射给与等体积的rPBD114或生理盐水,每天注射一次,连续注射6天。试验第7天早上小鼠注射完生理盐水和rPBD114后1 h,攻毒组立即注射10 mg/kg LPS,未攻毒组注射等体积的生理盐水,5 h后所有小鼠二氧化碳麻醉处死。结果表明:LOW组显着降低采食量和平均日采食量（P<0.05）,增加脾脏的脏器指数（P<0.05）;LPS攻毒显着增加血清D乳酸和二胺氧化酶的水平（P<0.05）,表明LPS攻毒模型成功导致小鼠肠道炎性损伤;LPS攻毒增加炎性因子的基因和蛋白水平,造成小鼠肝脏、肾脏和肠道屏障的损伤;而给与小鼠rPBD114,可降低血清和空肠的炎性因子（TNFα、IL-1β和IL-6）水平（P<0.05）,减少LPS对小鼠肝脏（降低血清ALT）的损伤（P<0.05）,并且通过调节空肠凋亡相关基因（增加Bcl-2和Bcl-2/Bax的基因表达,降低Bax和caspase3的基因表达）的表达（P<0.05）,提高肠道紧密连接蛋白（增加ZO-1、occludin和claudin-1的基因表达,增加ZO-1蛋白表达）表达（P<0.05）,增强机体免疫力（提高血清IgG、IgM、C3和C4）（P<0.05）,从而改善肠道形态（降低十二指肠隐窝深度和提高空肠的绒隐比）（P<0.05）。上述研究结果表明:LPS攻毒造成小鼠全身性炎症和肠道损伤。rPBD114在不影响小鼠生长性能的前提下,通过降低血清和空肠中炎症因子的产生,调节凋亡相关基因和蛋白的表达,减少肠黏膜凋亡,提高小鼠免疫力,改善肠道健康。综上所述,PBD114在不同品种猪之间高度保守,且PBD114在藏猪的组织中表达水平高于DLY猪,PBD114在免疫激活下表达上调,是一个重要的免疫应答基因,其表达受TLR2/3/4/7和转录因子RELA/FOS/JUN调控;PBD114不仅具有抑菌活性,且对免疫激活具有明显的反馈调节作用,即在免疫激活时,PBD114通过降低IκBα,NF-κB和ERK1/2磷酸化水平,抑制炎性因子表达,缓解其导致的肠上皮细胞炎性损伤。上述研究结果不仅从理论上揭示了PBD114的表达调控机制及其生物学功能,还有望为新型抗生素替代品的研发以及寻求改善动物健康的营养调控措施等提供新的思路。
吴海琴[7]（2019）在《罗伊氏乳杆菌激活Wnt/β-catenin通路刺激仔猪肠上皮细胞增殖机制的研究》文中研究指明猪肠道是猪体内最大的消化和吸收器官,近几年由于各种原因引起的肠道炎症,造成了大量猪场仔猪存活率降低、畜牧相关产品产量降低,给养殖行业带来严重的经济损失,卫生安全问题也越来越受到各界的关注。动物肠炎的发病机制尚不明了,但已有文章报道肠道黏膜免疫系统的紊乱以及菌群失调在动物肠炎的发病过程中发挥着十分重要的作用。关于肠道微生物对猪肠道干细胞增殖和再生的研究知之甚少。在本研究中,我们使用小鼠模型探究乳酸菌修复病原菌引起损伤的机制,为探究乳酸菌改善仔猪肠道炎症机制奠定基础。我们发现枸橼柠檬杆菌和沙门氏菌均可以引起小鼠的肠道炎症以及隐窝的过度增殖,罗伊氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌4356轻微地通过调控隐窝的增殖保护肠上皮屏障的完整性,避免隐窝的过度增殖。乳酸杆菌通过维持Lgr5阳性肠道干细胞的数量,合理地刺激肠上皮的增殖减少肠上皮的损伤,并且降低肠道的促炎因子的产生。由于猪的类器官模型建立尚不成熟,我们建立小鼠类器官与罗伊氏乳杆菌的共培养模型,我们发现罗伊氏乳杆菌可以通过提高R-spondins表达并且因此活化Wnt/β-catenin信号通路刺激肠上皮的增殖。在肿瘤坏死因子（TNF-α）的损伤状态下,乳酸菌仍然能够维护肠上皮的增殖以及Lgr5 阳性干细胞的数量。最后我们发现罗伊氏乳杆菌能够调控仔猪的肠道干细胞增殖和免疫功能维持肠黏膜屏障。本研究证明乳酸杆菌能够有效地维护肠上皮的再生和稳态,并且在肠道病理损伤状态下可以起到保护作用,为阐明罗伊氏乳杆菌作为一种有前景的治疗肠道炎症替代疗法奠定理论基础。本研究分为以下四个部分:1、乳酸杆菌体内调控肠道干细胞增殖维护肠道屏障为探究乳酸杆菌在体内对于肠道炎症的保护效果,我们分别选用两株乳酸菌罗伊氏乳杆菌D8和嗜酸乳杆菌4356,两株经典的小鼠肠道致病菌枸橼柠檬杆菌和鼠伤寒沙门氏菌SL1344。体外抑菌圈试验表明罗伊氏乳杆菌较嗜酸乳杆菌对枸橼柠檬杆菌的拮抗效果更好,而嗜酸乳杆菌较罗伊氏乳杆菌对SL1344的拮抗效果更为明显。因此我们在体内试验中分别探究罗伊氏乳杆菌D8对枸橼柠檬杆菌引起肠炎的修复状况,嗜酸乳杆菌4356对鼠伤寒沙门氏菌引起肠炎的修复的状况。为了证实罗伊氏乳杆菌D8在体内改善肠道炎症的保护作用,C57BL/6小鼠口服灌胃罗伊氏乳杆菌D8。首先,我们发现用免疫荧光显微镜检测罗伊氏乳杆菌在肠道中的定殖,并通过CFU计数发现其在16 h达到其峰值。此外,罗伊氏乳杆菌的定殖显着降低粪便中的枸橼柠檬杆菌的数量,以及减缓由枸橼柠檬杆菌感染引起的体重减轻和结肠长度的缩短。感染枸橼柠檬杆菌的小鼠的肠道变得透明。然而,罗伊氏乳杆菌D8能够大大减缓病理损伤,并维持正常的隐窝深度,以避免隐窝的过度增殖。枸橼柠檬杆菌感染引起小鼠肠道形态的病理改变,同时提高小鼠血清中LPS浓度和肠道中促炎细胞因子TNF-α和IL-1β分泌量。而罗伊氏乳杆菌能够通过降低LPS表达水平以及促炎因子表达水平保护肠黏膜功能。枸橼柠檬杆菌会过度上调Lgr5以及PCNA mRNA的表达水平引起隐窝的过度增殖,而活罗伊氏乳杆菌D8能够通过对干细胞以及增殖基因的调控改善过度增殖。同时我们发现沙门氏菌能够引起明显的小鼠肠道炎症,包括结肠变短、粪便中载菌量上升以及肠道组织形态的改变,嗜酸乳杆菌4356能够显着改善肠道炎症,降低沙门氏菌的定殖以及改善肠道的病理状况。嗜酸乳杆菌4356能够通过调控干细胞以及增殖基因的表达避免沙门氏菌引起的肠道隐窝过度增殖。2、罗伊氏乳杆菌通过在生理条件下激活Wnt/β-连环蛋白途径来增加肠类器官的增殖由于猪类器官的模型尚未建立成熟,我们建立罗伊氏乳杆菌与小鼠类器官共培养模型。与空白组相比,罗伊氏乳杆菌D8处理能够增加肠类器官的表面积。此外,罗伊氏乳杆菌能够刺激肠上皮细胞增殖,提了 c-Myc,cyclin和Ki67增殖基因mRNA表达量,在隐窝中使用5-乙炔基-2’-脱氧尿苷（EdU）染色,增殖细胞显着增加同样验证了这一结果。实验结果表明,罗伊氏乳杆菌D8显着增加Wnt3和Lrp5的mRNA表达水平,激活Wnt/β-catenin通路,β-catenin和活性β-catenin表达的增加进一步证实该结论。同时我们发现,罗伊氏乳杆菌D8显着诱导活性β-连环蛋白的核积累。在罗伊氏乳杆菌D8激活Wnt/β-catenin途径后,共培养的类器官中ISCs标记基因（如活性ISCs 标记物（Lgr5,Olfm4,Ascl2）和静息 ISCs 标记物（Bmi1,Msi1））的 mRNA表达水平也增加。此外,与对照组相比,在罗伊氏乳杆菌处理的类器官中检测到Lgr5蛋白水平升高和Lgr5+免疫荧光细胞增加。进一步研究我们发现,在培养基中缺失R-Spondin-1,Wnt/β-catenin途径的激活受到抑制。有趣的是,即使培养基中缺乏R-Spondin-1,罗伊氏乳杆菌D8仍然可提高加Wnt3,Lgr5和c-Myc的mRNA表达。同时我们还发现罗伊氏乳杆菌D8可以增加R-spondin-1,R-spondin-2和R-spondin-3 mRNA表达。这种现象也通过类器官中的EdU 阳性细胞的数量得到证实。此外,罗伊氏乳杆菌对隐窝刺激增殖的作用比热灭活的乳酸杆菌作用更明显。3、罗伊氏乳杆菌D8改善TNF-α诱导的肠炎仔猪在受到各种外界刺激,会激活肠道免疫系统产生各种细胞因子,这些细胞因子会损伤猪的肠上皮细胞。因此在本实验中,我们使用TNF-α造炎症损伤模型,检测类器官在病理状态下,罗伊氏乳杆菌D8是否具有修复肠上皮损伤功能。在TNF-α处理后,超过80%的类器官出现明显损伤。然而,罗伊氏乳杆菌D8能够降低损伤的类器官的百分比和TNF-α的mRNA表达。罗伊氏乳杆菌能够提高增殖基因的表达,提高EdU 阳性细胞光密度维持肠上皮细胞的增殖能力,修复损伤的肠上皮。与对照组相比,罗伊氏乳杆菌D8显着上调Wnt3和Lrp5基因的表达,该结果与β-连环蛋白的表达量增加一致。此外,罗伊氏乳杆菌显着改善干细胞标志基因Lgr5,Olfm4,Ascl2和Bmil的表达。隐窝中Lgr5蛋白量和Lgr5+细胞的数量,该结果进一步证实罗伊氏乳杆菌能够在病理状态下维持肠道干细胞的稳定。这些结果表明罗伊氏乳杆菌维持由TNF-α抑制的Wnt/β-连环蛋白途径的活化,从而刺激肠上皮细胞的增殖。通过检测隐窝中Paneth细胞的数量和溶菌酶表达,显示TNF-α处理引起了 Paneth细胞功能障碍。然而,罗伊氏乳杆菌D8可以恢复TNF-α对类器官损伤后引起的Paneth细胞的减少和溶菌酶表达的量的降低。4、罗伊氏乳杆菌调控仔猪肠道增殖和免疫功能维持增强肠黏膜屏障12头三日龄的梅花猪随机分成两组,空白组连续灌胃5天无菌PBS,每次2mL;罗伊氏乳杆菌D8组连续灌胃5天罗伊氏乳杆菌,109的乳酸菌溶于2mL无菌PBS。每日定时测量仔猪的体重,结果显示罗伊氏乳杆菌处理组在第二天和第三天与空白组相比出现显着的差异。HE染色显示,罗伊氏乳杆菌D8处理能够增加仔猪空肠的肠绒毛的高度以及隐窝深度,统计结果与HE图片显示结果一致。PCNA免疫组化结果表明,罗伊氏乳杆菌D8处理能够显着提高仔猪每个隐窝内PCNA 阳性细胞数量。同时增殖基因c-Myc在罗伊氏乳杆菌处理之后有上调趋势（P=0.056）,罗伊氏乳杆菌D8也能够显着上调Wnt-β-catenin信号通路靶基因Tcf4的表达。该结果表明罗伊氏乳杆菌D8可能是通过激活Wnt-β-catenin信号通路来促进仔猪肠上皮的增殖。我们对仔猪空肠的muc-2以及lyz-1进行检测,发现罗伊氏乳杆菌D8能够增加仔猪muc2和lyz-1的基因表达水平。HE实验统计表明,罗伊氏乳杆菌能够显着提高仔猪回肠派尔氏斑的面积。荧光定量结果显示,罗伊氏乳杆菌D8能够提高Th1细胞分泌细胞因子基因IFN-γ和TH2细胞分泌细胞因子基因IL-4。以上结果表明罗伊氏乳杆菌通过激活Wnt-β-catenin信号通路促进肠上皮增殖,增加抗菌肽的分泌以及调控黏膜免疫功能,最终维护肠道的黏膜屏障功能。
钟江斌[8]（2019）在《宽叶独行菜促胃肠动力药效成分的作用机制研究》文中研究指明宽叶独行菜（Lepidium latifolium L.）属于十字花科（Brassicaceae）独行菜属（Lepidium）,是一种多年生草本植物,本文在前期对其促胃肠动力作用研究的基础上进一步研究了宽叶独行菜促胃肠动力药效成分的作用机制,为其后续研究与开发奠定基础。本研究以宽叶独行菜水提物为受试药物,以SD大鼠为实验动物,从组织水平考察其对胃肠激素、Cx43和C-Kit的影响;同时,利用显微测微技术和CCK-8法分别观察了宽叶独行菜提取物中不同组分对大鼠胃肠平滑肌细胞收缩和增殖的影响,进而从细胞和分子水平考察其对SP、Ghrelin、VIP、Cx43 mRNA、P38MAPK mRNA、PKA mRNA、PKC mRNA和M2R mRNA的影响,并探讨其作用机制。研究结果如下:（1）宽叶独行菜水提物能显着提高胃和十二指肠SP和Ghrelin含量,但对胃和十二指肠VIP含量没有影响。（2）免疫组化实验结果表明,宽叶独行菜水提物对阳性Cx43和C-Kit的表达均不显着。（3）宽叶独行菜提取物不同组分均能不同程度地促进细胞收缩,提高细胞收缩率,但对细胞增殖无显着影响。（4）组分V和乙酸乙酯部位能提高大鼠胃平滑肌细胞培养上清液中SP和Ghrelin含量,组分V能降低VIP含量,组分II和乙酸乙酯部位能提高大鼠小肠平滑肌细胞培养上清Ghrelin含量。（5）组分V能提高大鼠胃平滑肌细胞PKA mRNA的相对表达量,乙酸乙酯部位能提高大鼠胃平滑肌细胞M2R mRNA的相对表达量;乙酸乙酯部位能提高大鼠小肠平滑肌细胞Cx43 mRNA、P38 MAPK mRNA、PKA mRNA、PKC mRNA和M2R mRNA的相对表达量;组分VII能提高大鼠结肠平滑肌细胞PKA mRNA,乙酸乙酯部位能提高大鼠结肠平滑肌细胞Cx43 mRNA、M2R mRNA的相对表达量。综上:宽叶独行菜促胃肠动力药效成分主要通过刺激胃肠平滑肌细胞的收缩发挥作用,其促胃肠动力机制与升高SP和Ghrelin含量,上调Cx43 mRNA、P38MAPK mRNA、PKA mRNA、PKC mRNA和M2R mRNA的表达有关。
常雄飞[9]（2018）在《健脾理气方通过cAMP和NF-κB通路修复十二指肠紧密连接治疗功能性消化不良的机制》文中研究表明研究背景功能性消化不良（functional dyspepsia,FD）是指主要表现为上腹部疼痛、饱胀不适、早饱、嗳气、恶心呕吐等一系列不适症状,而经胃镜等相关检查,排除可以引起上述症状的器质性疾病的一组临床综合征。FD患病率较高,但临床治疗效果有限,严重影响人们的生活质量,同时为医疗系统带来巨大的经济负担。FD发病机制目前尚不明确,多种因素可能参与了其发病,包括胃十二指肠动力异常、近端胃适应性受损、胃十二指肠敏感性增高等多种因素。近年来越来越多的研究发现FD的发生与十二指肠密切相关,尤其是十二指肠的微炎症状态,包括肥大细胞、嗜酸性粒细胞、上皮内淋巴细胞的浸润及炎症因子,如肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha,TNF-α）局部含量的增高等。而近期的研究发现,十二指肠的机械屏障功能受损,可能与十二指肠微炎症状态及FD的发病之间有重要联系。十二指肠局部炎症因子,如TNF-α/干扰素γ（interferon gama,IFN-γ）含量升高,可激活十二指肠上皮细胞中核转录因子（nuclear factor of kappa b,NF-κB）相关信号通路,进而促进细胞中下游分子,如肌球蛋白轻链激酶（myosin light chain kinase,MLCK）及诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）含量的增加,MLCK可作用于细胞骨架结构,促进细胞骨架收缩,从而连带引起连接于骨架结构上的紧密连接蛋白claudin-1及occludin含量及定位发生改变,同样,iNOS水平的升高,可促进局部NO合成增加,直接造成紧密连接蛋白损伤,进而引起十二指肠上皮细胞细胞旁通路开放,使其机械屏障功能受损;与TNF-α/IFN-γ等炎症因子相反,前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2）对胃肠道具有多种调节作用,可以保护胃黏膜、促进十二指肠HCO3-分泌,并且能够通过与PGE2相应的受体（e-series of prostaglandin receptors,EP）结合,激活cAMP-PKA相关通路,促进十二指肠紧密连接蛋白表达,起到对十二指肠机械屏障紧密连接蛋白的保护作用。现代医学对肠道机械屏障及紧密连接蛋白损伤缺少有效的治疗方法,而研究发现部分中药,主要是健脾理气类及清热类中药对肠道紧密连接蛋白的表达具有一定调控作用。健脾理气方是导师根据中医传统理论及临床实践自拟的中药复方,前期临床研究及动物实验均表明,健脾理气方对FD具有良好的治疗效果,但其对FD十二指肠紧密连接蛋白是否有影响及其分子调控机制,目前尚不清楚。因此,本研究对健脾理气方治疗FD及其对十二指肠机械屏障-紧密连接蛋白的调控作用进行研究,并探索其可能的作用机制及信号通路。研究方法实验一:健脾理气方对FD大鼠胃顺应性及敏感性的影响18只SD雄性大鼠随机分为正常组与造模组,采用夹尾刺激方法构建FD模型,造模完成后将造模组大鼠随机分为FD模型组与健脾理气方治疗组,正常组与模型组采用生理盐水灌胃,治疗组大鼠采用健脾理气方水煎剂灌胃,灌胃共7天,每天灌胃1次。灌胃结束后,对18只大鼠进行经口胃内气囊植入术,采用电子恒压器对球囊进行梯度施压:20mmHg、40mmHg、60mmHg、80mmHg,记录各个压力下大鼠胃内气囊体积,用于评价胃顺应性;同时通过其颈部电极记录其斜方肌电生理活动,用以反应内脏敏感性。实验二:健脾理气方对FD大鼠十二指肠黏膜通透性及紧密连接蛋白的影响18只SD雄性大鼠随机分为正常组与造模组,采用夹尾刺激方法构建FD模型,造模完成后将造模组大鼠随机分为FD模型组与健脾理气方治疗组,正常组与模型组采用生理盐水灌胃,治疗组大鼠采用健脾理气方水煎剂灌胃,灌胃共7天,每天灌胃1次。灌胃结束后,对18只大鼠进行2%戊巴比妥钠麻醉并取材,剪取幽门下0.5cm-幽门下3.5cm共3cm长组织。其中一部分组织用于Western blot实验,以测定紧密连接蛋白claudin-1及occludin,剩余新鲜组织用于Ussing chamber实验,通过对跨膜电阻（transepithelial electrical resistance,TEER）的测定,反应十二指肠的紧密连接屏障功能。鬼笔环肽染色技术检测十二指肠黏膜细胞骨架F-actin的表达。实验三:健脾理气方对FD大鼠十二指肠cAMP和NF-κB相关通路的影响18只SD雄性大鼠随机分为正常组与造模组,采用夹尾刺激方法构建FD模型,造模完成后将造模组大鼠随机分为FD模型组与健脾理气方治疗组,正常组与模型组采用生理盐水灌胃,治疗组大鼠采用健脾理气方水煎剂灌胃,灌胃共7天,每天灌胃1次。灌胃结束后,对18只大鼠进行2%戊巴比妥钠麻醉并取材,剪取幽门下0.5cm-幽门下3.5cm共3cm长组织。应用HE染色检测十二指肠的基本形态学改变,酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immune sorbent assay,Elisa）检测十二指肠 TNF-α、IFN-γ 及 PGE2、cAMP,Western blot方法检测十二指肠iNOS,qPCR技术检测十二指肠NF-κB、MLCK、PGE2受体EP1/EP4 mRNA表达情况。研究结果实验一:健脾理气方对FD大鼠胃顺应性及敏感性的影响在40mmHg、60mmHg、80mmHg胃内球囊压力刺激下,模型组大鼠胃顺应性指标显着低于正常对照组大鼠（40mmHg:0.18±0.01 vs.0.29±0.01,P<0.01;60mmHg:0.21±0.01 vs.0.31±0.01,P<0.01;80mmHg:0.23±0.01 vs.0.29±0.01,P<0.01）,健脾理气方治疗组大鼠胃顺应性明显高于模型组大鼠（40mmHg:0.28±0.01 vs.0.18±0.01,P<0.01;60mmHg:0.31±0.01 vs.0.21±0.01,P<0.01;80mmHg0.29±0.01 vs.0.23±0.01,P<0.01）。而在 20mmHg、40mmHg、60mmHg、80mmHg 胃内球囊压力刺激下,模型组大鼠内脏敏感性指标显着高于正常对照组大鼠（20mmHg:28.05±3.26 vs.12.07±1.58,P<0.01;40mmHg:73.97±7.94 vs.31.77±5.15,P<0.01;60mmHg:196.72±23.55 vs.117.08±14.25,P<0.01;80mmHg:239.65±35.01 vs.114.73±16.91,P<0.01）,而健脾理气方治疗组大鼠内脏敏感性较模型组大鼠显着降低（20mmHg:15.47±2.20 vs.28.05±3.26,P<0.01;40mmHg:31.67±4.37 vs.73.97±7.94,P<0.01;60mmHg:111.54±8.90 vs.196.72±23.55,P<0.01;80mmHg 135.83± 19.27 vs.239.65±35.01,P<0.01）。实验二:健脾理气方对FD大鼠十二指肠黏膜通透性及紧密连接蛋白的影响Ussing chamber结果显示,相比与正常对照组大鼠,模型组大鼠十二指肠TEER明显下降（20.21±0.88 vs.39.72±0.60,P<0.01）。Western blot 结果同样显示,模型组大鼠十二指肠紧密连接蛋白claudin-1及occludin表达量显着下调（claudin-1:0.02±0.01 vs.0.07±0.01,P<0.01;occludin:0.05±0.01 vs.0.14±0.01,P<0.01）;而健脾理气方治疗后,FD大鼠十二指肠的TEER得到恢复（37.03± 1.61 vs.20.21±0.88,P<0.01）,与模型组大鼠相比有显着性差异,并且claudin-1及occludin蛋白的表达同样得到改善（claudin-1:0.07±0.01 vs.0.02 ± 0.01,P<0.01;occludin:0.16±0.01 vs.0.05±0.01,P<0.01）。而鬼笔环肽染色显示,细胞骨架中的微丝蛋白F-actin在三组大鼠中的表达未见显着差异。实验三:健脾理气方对FD大鼠十二指肠cAMP和NF-κ B相关通路的影响Elisa结果显示,与正常组大鼠相比,FD模型组大鼠十二指肠炎性因子TNF-α/IFN-γ含量均显着升高（TNF-α:1.54±0.11 vs.0.79±0.05,P<0.01;INF-γ:0.37±0.02 vs.0.15±0.02,P<0.01）,下游信号分子 NF-κB mRNA 及 MLCK mRNA、iNOS蛋白同样显着升高（NF-κB:1.28±0.10 vs.1.01±0.05,P<0.05;MLCKmRNA:1.59±0.12 vs.1.01 ±0.07,P<0.01;iNOS:0.12±0.01 vs.0.07±0.01,P<0.01）;而十二指肠 PGE2 含量明显降低（0.74±0.08 vs.1.35±0.06,P<0.01）,同时,PGE2受体EP4 mRNA及胞内第二信使cAMP含量显着降低（EP4 mRNA:0.43±0.11 vs.1.09±0.18,P<0.05;cAMP:10.86±0.20 vs.14.38±0.35,P<0.05）;而治疗组大鼠在健脾理气方治疗后,其十二指肠炎性因子TNF-α/IFN-γ显着下降（TNF-α:0.83±0.06 vs.1.54±0.11,P<0.01;IFN-γ:0.14±0.02 vs.0.37±0.02,P<0.01）,与模型组相比差异显着,NF-κ B mRNA及MLCK mRNA、iNOS蛋白同样明显降低（NF-κB:0.98±0.07 vs.1.28±0.10,P<0.05;MLCK mRNA:0.84±0.09 vs.1.59±0.12,P<0.01;iNOS:0.07±0.01 vs.0.12±0.01,P<0.01）,而 PGE2 含量显着升高（1.26±0.04 vs.0.74±0.08,P<0.01）,EP4 mRNA 水平及 cAMP 含量明显升高（EP4 mRNA:1.11±0.19 vs.0.43±0.11,P<0.05;cAMP:14.01 ±0.30 vs.10.86±0.20,P<0.01）。而PGE2的受体EP1在三组间未见统计学差异（P>0.05）。研究结论健脾理气方对FD模型大鼠有良好的治疗作用,可改善其胃顺应性及敏感性,改善十二指肠的紧密连接屏障,恢复紧密连接蛋白的表达;其作用机制可能与下调TNF-α/IFN-γ-NF-κB信号通路、上调PGE2-cAMP信号通路有关。
田玉华[10]（2017）在《miR-31在小肠干细胞、上皮再生和肿瘤发生中的功能与机制研究》文中进行了进一步梳理肠道是哺乳动物主要的消化和营养物质吸收器官。肠道上皮具有快速自我更新的特征,而位于隐窝基部的肠道干细胞则是上皮细胞更新的动力源泉,因此肠道成为研究成体干细胞的理想模型之一。小肠干细胞通过快速的自我更新与分化保证了营养物质的正常吸收,同时在肠上皮损伤情况下也能够使损伤的上皮得到快速修复,而肠道干细胞的异常活化也是引发结直肠癌的重要因素。因此,研究肠道干细胞自我更新、增殖的分子机制对深入认识肠道上皮的稳态平衡、肠上皮损伤后修复和肠道肿瘤发生的机理具有重要的科学意义和潜在应用价值。肠道干细胞包含位于隐窝基底部的Lgr5+活跃态干细胞和位于+4位置的Hopx+静息态干细胞。肠道干细胞的自我更新及增殖受多种因素的调控,其中miRNAs（miRNAs）是一类20-24个核苷酸大小的非编码RNA,通过与靶基因的3’-UTR 区结合从而抑制靶基因的转录或翻译。MiRNA-31（miR-31）作为非编码RNA中的一员,在包括肌肉、间充质干细胞等多种成体干细胞的命运决定和状态维持以及肿瘤发生中均发挥重要调节作用,尤其在大部分肠炎及结肠癌患者中miR-31的表达异常高于正常组织。但是,目前关于miR-31与肠道干细胞的研究仍未见报道。因此,本课题旨在研究和探讨miR-31在肠道干细胞、肠上皮损伤修复和肠道肿瘤发生发展中的功能和作用机制。本研究首先利用 Lgr5-EGFP-IRES-CreERT2和HOPX-CreERT2;Rosa26mTmG转基因小鼠,通过流式分选和qRT-PCR技术发现,miR-31在Lgr5+干细胞和+4位置Hopx+静息态干细胞中的表达相对较高。与正常肠道组织相比,12 Gy电离辐照处理和葡萄糖硫酸钠（DSS）诱导均能导致miR-31的表达水平显着上调。这些结果预示miR-31可能参与肠道干细胞的维持及肠道损伤修复过程。为了进一步研究miR-31的功能,本课题利用Tet-On、Cre-loxP系统及Case9技术分别构建了 Dox（Doxycycline）可诱导的 全身过表达小鼠（TRE-miR31）、miR-31全身敲除小鼠miR-31-/-及肠道上皮特异性敲除miR-31的条件敲除小鼠Vilin-Cre;miR-31fl/fl（cKO）。过表达miR-31引起小肠隐窝高度增加,增殖细胞数量增多,Lgr5+干细胞比例上调,数量显着增多。而全身敲除和条件性敲除miR-31后的小鼠表型与之相反,表现为细胞增殖受到抑制,Lgr5+干细胞数量减少,隐窝基部凋亡的Lgr5+细胞增多,表明在稳态情况下miR-31可以促进活跃态干细胞的增殖。当小肠受到电离辐照损伤后,miR-31过表达抑制隐窝基部Lgr5+干细胞的凋亡、促进新生隐窝的再生和增殖,加快损伤上皮的修复过程,显示其具有抗辐射的功能。同样在DSS诱导的肠炎模型中,miR-31能够减缓炎症造成的小鼠体重下降和生存率降低,同时加快损伤肠道的修复过程。这些结果表明当肠道处于压力条件下,miR-31在肠道上皮的损伤修复过程中发挥重要作用。在肠道肿瘤模型相关研究中,异种移植结果显示miR-31能够促进人结肠癌细胞（HCT116）成瘤生长;AOM/DSS诱导的结肠肿瘤模型中,miR-31-/-小鼠结肠远端肿瘤数量减少,体积减小;Villin-Cre;APC+/fl的肿瘤模型中,miR-31-/-小鼠小肠肿瘤的数量和体积也明显下降,这些结果表明在肠道中,miR-31作为促癌因子能够促进肿瘤的生长,从而使其可能成为治疗肠道肿瘤的潜在靶点。在分子机制上,通过双荧光素酶活性检测和CLIP-qPCR等实验证实miR-31通过直接靶向结合Dkk1、Axin1、Gsk3β而激活Wnt信号通路,同时通过靶向结合Smad3、Bmpr1a和Smad4抑制BMP/TGFβ信号通路活性,从而促进活跃态干细胞的增殖、静息态干细胞的激活和肿瘤的发展过程。而且.,本研究还发现miR-31能够通过调控Gsk3β和p38抑制干细胞细胞的凋亡过程。在miR-31上游调控机制上,辐照和DSS诱导激活了 STAT3和NF-tκB信号通路。ChIP-qPCR结果进一步证实p-Stat3和p65能够与miR-31的启动子区直接结合从而上调miR-31的表达。综上所述,本研究主要发现包括:1)发现miR-31是内源性的小肠干细胞激活信号,通过激活Wnt和抑制BMP/TGFβ促进干细胞增殖,通过抑制Gsk3β和p38保护小肠干细胞免于凋亡。2)在小肠上皮再生过程中,miR-31首先保护小肠干细胞免于凋亡,然后通过抑制BMP/TGFβ、激活Wnt信号促进存活的小肠干细胞进行快速增殖。3)鉴定出miR-31作为促癌基因,通过Stat3-miR-31-Wnt/BMP/TGFβ信号通路促进结肠癌发生发展。4)首次阐明了某种特异miRNA在小肠干细胞中的生理功能。因此,本研究表明miR-31是小肠干细胞的一个主要调节因子,同时也是肠道上皮再生紊乱、肿瘤等多种肠道疾病治疗的潜在靶标。
二、小鼠小肠隐窝素基因的表达及大黄对其表达的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、小鼠小肠隐窝素基因的表达及大黄对其表达的影响（论文提纲范文）
（1）蒙药“巴布-7”对大肠杆菌性腹泻小鼠肠黏膜屏障保护机制的相关研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 大肠杆菌及大肠杆菌性腹泻的相关概述 |
| 1.1.1 大肠杆菌的概述 |
| 1.1.2 大肠杆菌性腹泻病的概述 |
| 1.2 蒙医药及蒙药“巴布-7”研究进展 |
| 1.2.1 蒙医药研究进展 |
| 1.2.2 蒙药“巴布-7”研究进展 |
| 1.3 大黄素研究进展 |
| 1.4 肠道屏障的概述 |
| 1.4.1 肠道屏障功能的概述 |
| 1.4.2 肠黏膜机械屏障 |
| 1.4.3 肠黏膜免疫屏障 |
| 1.4.4 肠黏膜化学屏障 |
| 1.4.5 肠黏膜生物屏障 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 2 大肠杆菌性腹泻模型的建立 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 试剂与耗材 |
| 2.1.2 实验用菌 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 受试菌培养及菌悬液制备 |
| 2.2.2 腹泻模型建立方法 |
| 2.2.3 模型评价标准 |
| 2.3 数据处理 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 小鼠临床症状 |
| 2.4.2 DAI评分、腹泻率及死亡率 |
| 2.4.3 小鼠肠道病理学观察及炎性因子的检测 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 3 蒙药BBS复方对大肠杆菌性腹泻小鼠肠黏膜生物屏障的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验用菌 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 药物制备 |
| 3.2.2 受试菌培养 |
| 3.2.3 实验分组及给药方案 |
| 3.2.4 DNA提取 |
| 3.2.5 16S rRNA基因扩增 |
| 3.2.6 文库构建和测序 |
| 3.2.7 测序数据处理 |
| 3.2.8 OTU聚类和物种注释 |
| 3.2.9 样本复杂度分析(Alpha Diversity) |
| 3.2.10 多样本比较分析(Beta Diversity) |
| 3.3 数据统计 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 物种多样性曲线及物种累积箱形图结果 |
| 3.4.2 Alpha Diversity指数分析结果 |
| 3.4.3 多样本比较分析结果(Beta Diversity) |
| 3.4.4 门水平分析结果 |
| 3.4.5 目水平分析结果 |
| 3.4.6 属水平分析结果 |
| 3.4.7 LEf Se分析 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 4 蒙药BBS复方对大肠杆菌性腹泻小鼠肠黏膜机械屏障的影响 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 试剂与耗材 |
| 4.1.2 实验菌株 |
| 4.1.3 实验动物 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 药物制备 |
| 4.2.2 受试菌培养 |
| 4.2.3 实验分组及给药方案 |
| 4.2.4 实验流程及样品采集 |
| 4.2.5 HE染色 |
| 4.2.6 透射电镜检测 |
| 4.2.7 免疫组织化学检测 |
| 4.2.8 RT-PCR |
| 4.2.9 Western bolt |
| 4.2.10 ELISA法 |
| 4.3 数据处理 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 对大肠杆菌性腹泻小鼠肠道病理损伤的影响 |
| 4.4.2 对大肠杆菌性腹泻小鼠绒毛长度、隐窝深度及其比值的影响 |
| 4.4.3 对大肠杆菌性腹泻小鼠肠道超微结构的影响 |
| 4.4.4 Occludin 免疫组化检测结果 |
| 4.4.5 Claudin-1免疫组化检测结果 |
| 4.4.6 Zo-1 蛋白及基因检测结果 |
| 4.4.7 JAMA检测结果 |
| 4.4.8 MLCK检测结果 |
| 4.4.9 DAO、D-LA、ET检测结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 对小肠形态的影响 |
| 4.5.2 对小肠超微结构的影响 |
| 4.5.3 对紧密连接相关蛋白的影响 |
| 4.5.4 对肠黏膜通透性的影响 |
| 4.6 结论 |
| 5 蒙药BBS复方对大肠杆菌性腹泻小鼠肠黏膜免疫屏障的影响 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 试剂与耗材 |
| 5.1.2 实验菌种 |
| 5.1.3 实验动物 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 蒙药BBS传统复方的制备 |
| 5.2.2 受试菌培养 |
| 5.2.3 实验分组及给药方案 |
| 5.2.4 实验流程及样品采集 |
| 5.2.5 流式细胞术 |
| 5.2.6 流式细胞术(TH1、TH2) |
| 5.2.7 ELISA |
| 5.3 数据处理 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 CD3~+T、CD19~+B细胞百分比检测结果 |
| 5.4.2 CD4~+T、CD8~+T细胞百分比检测结果 |
| 5.4.3 Th_1、Th_2细胞检测结果 |
| 5.4.4 细胞因子检测结果 |
| 5.4.5 免疫球蛋白检测结果 |
| 5.4.6 sIgA检测结果 |
| 5.5 讨论 |
| 5.5.1 对T淋巴细胞及其亚群的影响 |
| 5.5.2 对B淋巴细胞及抗体的影响 |
| 5.5.3 对炎性细胞因子的影响 |
| 5.6 小结 |
| 6 蒙药BBS复方对大肠杆菌性腹泻小鼠肠黏膜化学屏障的影响 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 试验与耗材 |
| 6.1.2 菌种 |
| 6.1.3 实验动物 |
| 6.1.4 主要仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 蒙药BBS传统复方的制备 |
| 6.2.2 受试菌培养 |
| 6.2.3 实验分组及给药方案 |
| 6.2.4 PAS染色 |
| 6.2.5 免疫荧光 |
| 6.2.6 ELISA |
| 6.3 数据处理 |
| 6.4 实验结果 |
| 6.4.1 肠组织杯状细胞检测结果 |
| 6.4.2 MUC-2 的检测结果 |
| 6.4.3 溶菌酶及ITF的检测结果 |
| 6.4.4 二糖酶活力的检测结果 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 总体讨论 |
| 总体结论 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（2）苦荞D-手性肌醇与多酚类化合物协同降糖作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题来源及研究的背景和意义 |
| 1.1.1 课题的来源 |
| 1.1.2 课题研究的背景和意义 |
| 1.2 II型糖尿病概述 |
| 1.2.1 II型糖尿病发病机制 |
| 1.2.2 天然产物对II型糖尿病的治疗靶点 |
| 1.3 天然产物协同降糖作用研究概述 |
| 1.3.1 天然产物的协同作用 |
| 1.3.2 天然产物降糖研究现状 |
| 1.3.3 天然产物协同降糖发展趋势 |
| 1.4 国内外苦荞D-手性肌醇研究概述 |
| 1.4.1 D-手性肌醇理化性质 |
| 1.4.2 苦荞D-手性肌醇制备 |
| 1.4.3 D-手性肌醇与糖尿病 |
| 1.5 国内外天然降糖因子研究概述 |
| 1.5.1 山楂降糖成分研究 |
| 1.5.2 绿茶降糖成分研究 |
| 1.5.3 荷叶降糖成分研究 |
| 1.5.4 其他 |
| 1.6 主要研究内容及研究方案 |
| 1.6.1 研究内容 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料与仪器 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 试剂和药品 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.2 天然降糖活性物质分析 |
| 2.2.1 天然产物对细胞葡萄糖消耗量分析 |
| 2.2.2 天然产物对α-葡萄糖苷酶抑制活性分析 |
| 2.3 苦荞D-手性肌醇分离鉴定 |
| 2.3.1 苦荞D-手性肌醇分离实验 |
| 2.3.2 苦荞D-手性肌醇纯化实验 |
| 2.3.3 苦荞D-手性肌醇高效液相分析 |
| 2.4 山楂提取物降糖活性成分分离鉴定 |
| 2.4.1 山楂提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性跟踪 |
| 2.4.2 山楂α-葡萄糖苷酶抑制成分LC-MSMS分析 |
| 2.5 苦荞D-手性肌醇与多酚类化合物协同作用分析 |
| 2.5.1 对α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定 |
| 2.5.2 对调节细胞葡萄糖代谢的测定 |
| 2.6 DEH对 STZ诱导糖尿病小鼠糖代谢的影响 |
| 2.6.1 糖尿病小鼠的实验设计 |
| 2.6.2 生化指标测定 |
| 2.7 DEH对糖尿病小鼠糖代谢调节机制的研究 |
| 2.8 数据分析 |
| 第3章 天然产物降糖活性比较及分离鉴定 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 天然产物降糖活性比较 |
| 3.2.1 天然产物对细胞葡萄糖消耗量分析 |
| 3.2.2 天然产物对α-葡萄糖苷酶抑制活性分析 |
| 3.3 苦荞D-手性肌醇分离鉴定 |
| 3.3.1 苦荞D-手性肌醇分离实验 |
| 3.3.2 苦荞D-手性肌醇纯化实验 |
| 3.3.3 苦荞D-手性肌醇高效液相分析 |
| 3.4 山楂提取物降糖活性成分分离鉴定 |
| 3.4.1 山楂提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性跟踪 |
| 3.4.2 山楂α-葡萄糖苷酶抑制成分LC-MSMS分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 苦荞D-手性肌醇与多酚类化合物协同降糖作用分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 对α-葡萄糖苷酶的协同作用分析 |
| 4.3 对细胞葡萄糖消耗量的协同作用分析 |
| 4.4 对胞内葡萄糖生成的协同作用分析 |
| 4.5 对糖异生关键酶PEPCK和 G6Pase的协同作用分析 |
| 4.6 对糖原合成酶GYS2和糖原含量的协同作用分析 |
| 4.7 本章小结 |
| 第5章 DEH对STZ诱导糖尿病小鼠糖代谢的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 DEH对小鼠生理指标的影响 |
| 5.3 DEH对小鼠脏器指数的影响 |
| 5.4 DEH对小鼠糖代谢的影响 |
| 5.4.1 DEH对小鼠口服葡萄糖耐量的影响 |
| 5.4.2 DEH对小鼠血清胰岛素水平的影响 |
| 5.4.3 DEH对小鼠血清糖化血红蛋白的影响 |
| 5.4.4 DEH对小鼠血清胰高血糖素样肽-1的影响 |
| 5.4.5 DEH对小鼠小肠α-葡萄糖苷酶活性的影响 |
| 5.5 DEH对小鼠脂代谢的影响 |
| 5.5.1 DEH对小鼠血清TC、TG、FFA、HDL-C和 LDL-C的影响 |
| 5.5.2 DEH对小鼠血清瘦素的影响 |
| 5.5.3 DEH对小鼠血清脂联素的影响 |
| 5.6 DEH对小鼠血清炎症因子的影响 |
| 5.7 DEH对小鼠血清ALT和 AST的影响 |
| 5.8 DEH对小鼠组织形态学影响 |
| 5.9 本章小结 |
| 第6章 DEH对 STZ诱导糖尿病小鼠糖代谢相关基因表达及调节机制 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 DEH对 PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达的影响 |
| 6.3 DEH对 FOXO1、p-FOXO1、PEPCK、G6Pase蛋白表达的影响 |
| 6.4 DEH对 GSK3、p-GSK3、GS、p-GS蛋白表达及肝糖原的影响 |
| 6.5 DEH对小鼠糖代谢的作用机制 |
| 6.6 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文及其它成果 |
| 致谢 |
（3）基于“脾为之卫”探讨益气解毒方对急性放射损伤小鼠的防护研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 中医药防治急性放射损伤的研究进展 |
| 综述二 铁死亡与放射损伤研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一章 理论研究 |
| 引言 |
| 第一节 “脾为之卫”理论的源流与内涵 |
| 1 中医学对脾的认识 |
| 2 “脾为之卫”理论的源流与内涵 |
| 3 “脾为之卫”理论与现代医学“免疫功能”的联系 |
| 4 结语 |
| 第二节 从“脾失之卫”探讨急性放射损伤的中医病机 |
| 1 “脾失之卫”的含义 |
| 2 从“脾失之卫”探讨急性放射损伤的中医病机 |
| 3 结语 |
| 第三节 从“补脾实卫,益气解毒”论治急性放射损伤的防治方法及益气解毒方的组方分析 |
| 1 从“补脾实卫,益气解毒”论治急性放射损伤的防治方法 |
| 2 益气解毒方的组方分析 |
| 3 结语 |
| 第二章 实验研究 |
| 引言 |
| 第一节 2.0 Gy ~(60)Coγ射线一次性全身照射对小鼠脾脏及肠道免疫的损伤效应研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二节 益气解毒方对2.0 Gy ~(60)Coγ射线一次性全身照射致小鼠脾脏及肠道免疫损伤的防护效应研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三节 益气解毒方对2.0 Gy ~(60)Coγ线致小鼠脾脏及肠道免疫损伤的防护机制研究 |
| 实验(一) 2.0 Gy ~(60)Coγ射线致小鼠脾脏及肠道免疫损伤与铁死亡的相关性研究 |
| 实验(二) 益气解毒方通过减轻照射后细胞铁死亡发挥辐射防护作用的研究 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（4）辣木叶对慢性便秘的治疗作用及蛋白质组学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词注释表 |
| 综述一 便秘的研究进展 |
| 1.1 便秘 |
| 1.2 便秘的发病机制 |
| 1.3 治疗便秘的方法 |
| 综述二 辣木叶的研究 |
| 2.1 辣木叶化学成分研究 |
| 2.2 辣木叶的药理作用研究 |
| 2.2.1 抗氧化 |
| 2.2.2 抗炎 |
| 2.2.3 抗糖尿病 |
| 2.2.4 降脂作用 |
| 2.2.5 抗癌作用 |
| 2.2.6 抗菌及杀虫作用 |
| 2.2.7 促排便作用 |
| 2.2.8 其他 |
| 综述三 定量蛋白质组学研究概述 |
| 3.1 标记定量技术(Labeling quantitation) |
| 3.2 无标记定量技术(Lable-free quantitation) |
| 3.2.1 无标记定量蛋白质组学的优缺点 |
| 3.2.2 无标记定量蛋白质组学的实验流程 |
| 3.2.3 无标记定量蛋白质组学的应用 |
| 第一章 辣木叶水提物促排便的药效研究 |
| 第1节 辣木叶水提物对正常小鼠排便的影响 |
| 一、实验材料与仪器 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第2节 辣木叶水提取对洛哌丁胺所致便秘小鼠排便的影响 |
| 一. 实验材料与仪器 |
| 二. 实验方法 |
| 三. 结果 |
| 四. 讨论 |
| 第3节 辣木叶水提物对低膳食纤维诱导的便秘大鼠的影响 |
| 一. 实验材料与仪器 |
| 二. 实验方法 |
| 三. 实验结果 |
| 四. 讨论 |
| 第二章 蛋白质组学研究辣木叶改善便秘的作用机制 |
| 第1节 Lable-free蛋白质组学研究 |
| 一. 实验材料与仪器 |
| 二. 实验方法 |
| 三. 实验结果 |
| 四. 讨论 |
| 第2节 Western-blot (WB)验证候选差异蛋白的表达 |
| 一. 实验材料与仪器 |
| 二. 实验方法 |
| 三. 实验结果 |
| 四. 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附件一 |
| (后记)致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（5）HD5衍生抗生素的设计、制备及其对小鼠辐射后细菌感染的救治作用（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 选题缘由 |
| 1.2 研究背景 |
| 1.3 研究目的 |
| 1.4 研究内容 |
| 1.5 研究方法 |
| 第二章 MSN@T7E21R-HD5@SCN纳米抗生素的制备、表征分析及其在肠道感染中的抗菌效应评估 |
| 2.1 MSN@T7E21R-HD5@SCN纳米抗生素的制备与表征分析 |
| 2.2 MSN@T7E21R-HD5 的体外抗菌活性研究 |
| 2.3 MSN@T7E21R-HD5@SCN对外源性MDRE.coli所致肠道感染的治疗作用 |
| 2.4 MSN@T7E21R-HD5@SCN对放射性肠炎的缓解作用 |
| 2.5 MSN@T7E21R-HD5@SCN的体内体外毒性及溶血性研究 |
| 2.6 讨论 |
| 2.7 本章小结 |
| 第三章 高效抗多重耐药鲍曼不动杆菌T7E21R-HD5 线性衍生肽的设计、筛选及其抗菌机制研究 |
| 3.1 T7E21R-HD5 高效抗多重耐药鲍曼不动杆菌线性衍生肽的设计、筛选 |
| 3.2 T7E21R-HD5-d3 对放射性小鼠肺部感染的救治作用研究 |
| 3.3 T7E21R-HD5-d3 的抗菌机制研究 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 抗菌肽抗菌活性改良研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（6）猪β防御素114的表达调控机制及其在缓解肠道屏障炎性损伤中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 本文缩略语表(Abbreviations) |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 防御素概述 |
| 1.1 防御素的种类 |
| 1.2 防御素的分布与表达 |
| 2 防御素的表达调控 |
| 2.1 营养素对猪防御素的表达调控 |
| 2.2 非营养素对猪防御素的表达调控 |
| 3 防御素的生物学功能 |
| 3.1 抗菌活性 |
| 3.2 促炎和抗炎 |
| 3.3 屏障保护作用 |
| 3.4 加强趋化作用 |
| 3.5 Defensins和 TLRs |
| 3.6 增强胞内外杀伤能力 |
| 3.7 促进细胞分化 |
| 4 Defensins的应用中遇到的问题 |
| 5 存在的问题 |
| 第二章 本研究的目的、意义、主要内容和技术路线 |
| 1 研究的目的和意义 |
| 2 研究内容 |
| 3 技术路线 |
| 第三章 试验研究 |
| 试验一 PBD114 基因的克隆、序列分析及其在不同品种猪间的差异表达 |
| 一、Beta defensin114 的序列分析 |
| 1 PBD114 克隆技术图 |
| 2 试验材料 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 总RNA提取和反转录 |
| 3.2 PBD114 基因的扩增 |
| 3.3 核酸电泳 |
| 3.4 DNA纯化 |
| 3.5 DNA加 A |
| 3.6 DNA连接 |
| 3.7 大肠杆菌感受态制备 |
| 3.8 转化与初筛 |
| 3.9 测序与分析 |
| 4 试验结果 |
| 4.1 PBD114 的克隆及其序列分析 |
| 4.2 不同物种beta defensin114 同源性 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 二、不同品种猪PBD114 基因的差异表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验设计 |
| 1.2 组织样品采集 |
| 1.3 测定指标与方法 |
| 1.3.1 总RNA提取及反转录 |
| 1.3.2 引物设计 |
| 1.3.3 qRT-PCR |
| 1.4 数据处理与统计分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 PBD114 在藏猪和DLY猪组织中的表达丰度 |
| 2.2 PBD114 在藏猪和DLY猪中的差异表达 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 试验二 PBD114 基因的表达调控机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验设计 |
| 1.2.1 E.Coli K88 攻毒对PBD114 基因表达的影响 |
| 1.2.2 不同TLRs信号途径对PBD114 基因表达的影响 |
| 1.2.3 转录因子RELA、FOS和 JUN对 PBD114 基因表达的调控 |
| 1.2.4 转录因子RELA和 FOS的抑制对IPEC-J2的PBD114 基因表达的影响 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 腹泻评分 |
| 1.3.2 E.coli K88 的培养 |
| 1.3.3 细胞培养 |
| 1.3.4 总RNA提取、反转录和qRT-PCR |
| 1.3.5 酶联免疫检测细胞因子 |
| 1.3.6 PBD114 启动子区转录因子结合预测 |
| 1.3.7 载体构建 |
| 1.3.8 转染与荧光检测 |
| 1.4 数据处理与统计分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 免疫激活对PBD114 基因表达的影响 |
| 2.2 不同TLRs信号途径对PBD114 基因表达的调控 |
| 2.3 转录因子RELA、FOS和 JUN对 PBD114 基因表达的调控 |
| 2.4 反向验证转录因子RELA和 FOS对 PBD114 表达的调控 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 试验三 PBD114 的大肠杆菌异源表达及其生物学特性研究 |
| 1 表达策略 |
| 2 试验材料 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 表达载体的构建 |
| 3.2 重组大肠杆菌构建 |
| 3.3 诱导表达 |
| 3.4 SDS-PAGE鉴定 |
| 3.5 蛋白质质谱 |
| 3.6 诱导表达条件优化 |
| 3.6.1 诱导初始OD值的优化 |
| 3.6.2 诱导剂IPTG的优化 |
| 3.6.3 诱导时间的优化 |
| 3.7 重组蛋白的纯化回收 |
| 3.8 PBD114 蛋白质的空间结构和物理化学特性的预测 |
| 3.9 MIC |
| 3.10 溶血性 |
| 3.11 细胞毒性 |
| 4 数据处理与统计分析 |
| 5 试验结果 |
| 5.1 表达载体的构建 |
| 5.2 重组菌Origami B-pET32-PBD114 的构建 |
| 5.3 重组蛋白rPBD114 的表达 |
| 5.4 表达条件的优化 |
| 5.5 重组蛋白rPBD114 的纯化和蛋白质质谱鉴定 |
| 5.6 重组蛋白rPBD114 的空间结构和物理化学特性 |
| 5.7 最小抑菌浓度 |
| 5.8 溶血性 |
| 5.9 细胞毒性 |
| 6 讨论 |
| 7 小结 |
| 试验四 重组PBD114 对肠道屏障炎性损伤的缓解及其机制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验设计 |
| 1.2.1 重组蛋白rPBD114 处理IPEC-J2 浓度梯度 |
| 1.2.2 重组蛋白rPBD114 处理IPEC-J2 时间梯度 |
| 1.2.3 重组蛋白rPBD114 缓解IPEC-J2 肠道屏障炎性损伤 |
| 1.2.4 重组蛋白rPBD114 缓解IPEC-J2 肠道屏障炎性损伤及其机制 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 细胞培养 |
| 1.3.2 抑制剂安全剂量 |
| 1.3.3 细胞增殖 |
| 1.3.4 荧光定量PCR |
| 1.3.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 1.3.6 ELISA检测细胞因子 |
| 1.3.7 免疫荧光检测ZO-1和claudin-1 |
| 1.3.8 免疫印迹 |
| 1.4 数据处理与统计分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 重组蛋白rPBD114 浓度梯度和时间梯度的优化 |
| 2.1.1 重组蛋白rPBD114 浓度梯度优化 |
| 2.1.2 重组蛋白rPBD114 时间梯度优化 |
| 2.2 重组蛋白rPBD114 缓解IPEC-J2 炎性损伤 |
| 2.2.1 重组蛋白rPBD114对LPS处理IPEC-J2 细胞增殖的影响 |
| 2.2.2 重组蛋白rPBD114对LPS处理IPEC-J2 细胞凋亡的影响 |
| 2.2.3 重组蛋白rPBD114对LPS处理IPEC-J2 细胞凋亡基因的影响 |
| 2.2.4 重组蛋白rPBD114对LPS处理IPEC-J2 细胞炎症因子的影响 |
| 2.2.5 重组蛋白rPBD114对LPS处理IPEC-J2 细胞紧密连接蛋白的影响 |
| 2.3 重组蛋白rPBD114 缓解IPEC-J2 肠道屏障炎性损伤及其机制 |
| 2.3.1 抑制剂浓度梯度筛选 |
| 2.3.2 重组蛋白rPBD114 和抑制剂对IPEC-J2 细胞增殖的影响 |
| 2.3.3 重组蛋白rPBD114 和抑制剂对IPEC-J2 细胞紧密连接蛋白的影响 |
| 2.3.4 重组蛋白rPBD114 和抑制剂对IPEC-J2 细胞炎症因子的影响 |
| 2.3.5 重组蛋白rPBD114 和抑制剂对IPEC-J2 细胞凋亡的影响 |
| 2.3.6 重组蛋白rPBD114 和抑制剂对IPEC-J2 细胞凋亡基因和凋亡蛋白的影响 |
| 2.3.7 重组蛋白rPBD114 和抑制剂对IPEC-J2 细胞NF-κB/MAPK信号通路蛋白的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 试验五 重组蛋白rPBD114 对小鼠肠道屏障炎性损伤的缓解作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验设计 |
| 1.3 饲养管理 |
| 1.4 样品采集 |
| 1.5 测定指标与方法 |
| 1.5.1 生长性能 |
| 1.5.2 血液生化 |
| 1.5.3 空肠粘膜凋亡 |
| 1.5.4 肠道形态 |
| 1.5.5 空肠免疫荧光 |
| 1.5.6 荧光定量PCR |
| 1.6 数据处理与统计分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 重组蛋白rPBD114对ICR小鼠生长性能的影响 |
| 2.2 重组蛋白rPBD114对ICR小鼠脏器指数的影响 |
| 2.3 重组蛋白rPBD114对ICR小鼠血清二胺氧化酶和D-乳酸的影响 |
| 2.4 重组蛋白rPBD114对ICR小鼠血清生化的影响 |
| 2.5 重组蛋白rPBD114对ICR小鼠血清免疫球蛋白和补体的影响 |
| 2.6 重组蛋白rPBD114对ICR小鼠肠道形态的影响 |
| 2.7 重组蛋白rPBD114对ICR小鼠空肠紧密连接蛋白的影响 |
| 2.8 重组蛋白rPBD114对ICR小鼠空肠凋亡及相关基因的影响 |
| 2.9 重组蛋白rPBD114对ICR小鼠炎症的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 总体讨论、结论与展望 |
| 1 总体讨论 |
| 2 主要结论 |
| 3 创新点 |
| 4 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）罗伊氏乳杆菌激活Wnt/β-catenin通路刺激仔猪肠上皮细胞增殖机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRAT |
| 缩略语中英文对照 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 动物肠黏膜屏障的研究进展 |
| 1 肠黏膜屏障的组成及功能 |
| 2 畜禽肠炎的研究进展 |
| 3 益生菌维护肠黏膜屏障机制 |
| 参考文献 |
| 第二章 肠干细胞的研究进展 |
| 1 肠干细胞增殖分化的调控机制 |
| 1.1 肠干细胞的简介和动物体外培养模型的发展 |
| 1.2 肠干细胞增殖分化相关信号通路的研究进展 |
| 2 肠道菌群调控肠干细胞的研究进展 |
| 2.1 肠道菌群的研究进展 |
| 2.2 乳酸杆菌等肠道菌群调控肠干细胞的机制 |
| 参考文献 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第三章 乳酸杆菌体内调控肠道干细胞增殖维护肠道屏障 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物和菌株 |
| 1.2 试验设备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 动物实验细菌的准备和培养 |
| 1.5 牛津杯实验 |
| 1.6 实验分组 |
| 1.8 乳酸杆菌的定殖 |
| 1.9 病原菌定殖的检测 |
| 1.10 小鼠存活率统计 |
| 1.11 ELISA检测肠道炎症因子水平核血清中LPS水平 |
| 1.12 小鼠肠道组织中的免疫荧光的检测 |
| 1.13 qRT-PCR检测罗伊氏乳杆菌D8对肠道类器官增殖水平的影响 |
| 1.14 数据统计 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 乳酸菌对于病原菌的抑制作作用 |
| 2.2 罗伊氏乳杆菌抑制枸橼柠檬杆菌定殖 |
| 2.3 罗伊氏乳杆菌改善了由枸橼柠檬杆菌引起的肠道炎症 |
| 2.4 嗜酸乳杆菌能够抑制沙门氏菌的定殖 |
| 2.5 嗜酸乳杆菌改善沙门氏菌感染小鼠的病理状况 |
| 2.6 乳酸菌能够调控肠道干细胞和肠上皮增殖改善病原菌引起的损伤 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 罗伊氏乳杆菌通过在生理条件下激活Wnt/β-catenin途径来刺激肠类器官增殖 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物和菌株 |
| 1.2 试验设备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 肠道类器官和罗伊氏乳杆菌共培养模型的建立 |
| 1.5 免疫荧光检测肠道类器官增殖水平以类器官中Lgr5阳性干细胞的数量、活跃型β-catenin表达量及位置 |
| 1.6 实验分组 |
| 1.7 qRT-PCR检测罗伊氏乳杆菌D8对肠道类器官增殖水平的影响 |
| 1.8 Western blot检测活跃型肠道干细胞标志蛋白Lgr5和β-catenin蛋白的表达水平 |
| 1.9 数据统计 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 小肠类器官和罗伊氏乳杆菌共培养模型的建立 |
| 2.2 罗伊氏乳杆菌能够促进小肠类器官的增殖 |
| 2.3 罗伊氏乳杆菌能够激活Wnt-β-catenin信号通路 |
| 2.4 罗伊氏乳杆菌能够促进肠道干细胞增殖 |
| 2.5 罗伊氏乳杆菌D8能够代替R-spondin激活Wnt-β-catenin信号通路 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 罗伊氏乳杆菌D8改善TNF-α诱导的肠炎 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物和菌株 |
| 1.2 试验设备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 肠道类器官和罗伊氏乳杆菌共培养模型的建立 |
| 1.5 实验分组 |
| 1.6 免疫荧光检测肠道类器官增殖、溶菌酶的表达 |
| 1.7 qRT-PCR检测罗伊氏乳杆菌D8对肠道类器官增殖水平的影响 |
| 1.8 Western blot检测活跃型肠道干细胞标志蛋白Lgr5和β-catenin蛋白的表达水平 |
| 1.9 数据统计 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 罗伊氏乳杆菌D8维持Wnt/β-catenin信号通路激活修复TNF-α诱导的肠上皮损伤 |
| 2.2 罗伊氏乳杆菌维持潘氏细胞的数量和溶菌酶的表达量 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 罗伊氏乳杆菌D8调控仔猪肠道屏障以及免疫功能的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物和菌株 |
| 1.2 试验设备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 实验分组 |
| 1.5 HE染色显示仔猪肠道形态学变化 |
| 1.6 qRT-PCR检测罗伊氏乳杆菌D8对仔猪肠道基因水平的影响 |
| 1.7 免疫组化 |
| 1.8 统计 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 罗伊氏乳杆菌D8能够增加仔猪的体重,促进仔猪肠道发育 |
| 2.2 罗伊氏乳杆菌D8能够促进仔猪的肠上皮的增殖 |
| 2.3 罗伊氏乳杆菌D8对仔猪黏膜免疫系统发育的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 论文发表情况 |
| 致谢 |
（8）宽叶独行菜促胃肠动力药效成分的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 论文缩略词表 |
| 第一章 综述 |
| 1.1 独行菜属植物化学成分及药理作用 |
| 1.1.1 独行菜属植物化学成分 |
| 1.1.2 独行菜属植物药理作用 |
| 1.2 促胃肠动力药物的作用机制 |
| 1.2.1 西药在促胃肠动力方面的作用及其机制 |
| 1.2.2 中药在促胃肠动力方面的作用及其机制 |
| 第二章 宽叶独行菜对大鼠胃肠组织中胃肠激素和Cx43及C-Kit表达的影响 |
| 2.1 宽叶独行菜对大鼠胃肠激素的影响 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 仪器 |
| 2.1.4 方法 |
| 2.1.5 数据分析 |
| 2.1.6 结果 |
| 2.2 宽叶独行菜对大鼠胃肠组织中Cx43及C-Kit表达的影响 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 仪器 |
| 2.2.3 试剂 |
| 2.2.4 方法 |
| 2.2.5 数据分析 |
| 2.2.6 结果 |
| 第三章 宽叶独行菜不同组分对大鼠胃肠平滑肌细胞收缩、增殖及胃肠激素的影响 |
| 3.1 宽叶独行菜不同组分对大鼠胃肠平滑肌细胞收缩的影响 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 仪器 |
| 3.1.4 方法 |
| 3.1.5 数据分析 |
| 3.1.6 结果 |
| 3.2 宽叶独行菜不同组分对大鼠胃肠平滑肌细胞增殖的影响 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 试剂 |
| 3.2.3 仪器 |
| 3.2.4 方法 |
| 3.2.5 数据分析 |
| 3.2.6 结果 |
| 3.3 宽叶独行菜不同组分对大鼠胃肠平滑肌细胞胃肠激素含量的影响 |
| 3.3.1 材料 |
| 3.3.2 试剂 |
| 3.3.3 仪器 |
| 3.3.4 方法 |
| 3.3.5 数据分析 |
| 3.3.6 结果 |
| 第四章 宽叶独行菜促胃肠动力作用的分子机制研究 |
| 4.1 对缝隙连接蛋白Cx43 和相关蛋白激酶m RNA表达的影响 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 仪器 |
| 4.1.3 试剂 |
| 4.1.4 方法 |
| 4.1.5 数据分析 |
| 4.1.6 结果 |
| 4.2 对毒蕈碱M2 受体mRNA表达的影响 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 仪器 |
| 4.2.3 试剂 |
| 4.2.4 方法 |
| 4.2.5 数据分析 |
| 4.2.6 结果 |
| 第五章 讨论 |
| 5.1 对胃肠激素的影响 |
| 5.2 对大鼠胃肠组织中Cx43及C-Kit表达的影响 |
| 5.3 对大鼠胃肠平滑肌细胞的影响 |
| 5.4 对缝隙连接蛋白Cx43 和相关蛋白激酶m RNA表达的影响 |
| 5.5 对毒蕈碱M2 受体mRNA表达的影响 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）健脾理气方通过cAMP和NF-κB通路修复十二指肠紧密连接治疗功能性消化不良的机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 功能性消化不良的现代医学研究进展 |
| 1 流行病学 |
| 2 病因病机 |
| 3 诊断 |
| 4 治疗 |
| 5 展望 |
| 综述二 功能性消化不良的中医药研究进展 |
| 1 病名 |
| 2 病因病机 |
| 3 辨证分型 |
| 4 治疗 |
| 5 问题及展望 |
| 综述三 十二指肠黏膜屏障损伤与功能性消化不良发病之间的关系研究进展 |
| 1 十二指肠黏膜屏障功能概述 |
| 2 十二指肠屏障损伤导致功能性消化不良发病的原因 |
| 3 功能性消化不良患者十二指肠屏障损伤的原因 |
| 4 十二指肠紧密连接蛋白调控分子机制 |
| 5 总结 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 实验一 健脾理气方对功能性消化不良大鼠胃顺应性及敏感性的影响 |
| 1 实验目的 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 统计方法 |
| 5 实验结果 |
| 6 讨论 |
| 7 结论 |
| 实验二 健脾理气方对功能性消化不良大鼠十二指肠黏膜机械屏障及紧密连接蛋白的影响 |
| 1 实验目的 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 统计方法 |
| 5 实验结果 |
| 6 讨论 |
| 7 结论 |
| 实验三 健脾理气方对功能性消化不良大鼠十二指肠cAMP及NF-κB相关通路的影响 |
| 1 实验目的 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 统计方法 |
| 5 实验结果 |
| 6 讨论 |
| 7 结论 |
| 结语 |
| 创新性 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简历 |
（10）miR-31在小肠干细胞、上皮再生和肿瘤发生中的功能与机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 哺乳动物肠道上皮 |
| 1.1.1 肠道的胚胎期发育 |
| 1.1.2 肠道上皮的分化细胞 |
| 1.1.3 小肠干细胞 |
| 1.1.4 小肠上皮的损伤 |
| 1.1.5 肠道干细胞命运调控的信号 |
| 1.2 miRNA的研究进展 |
| 1.2.1 miRNA的发现 |
| 1.2.2 miRNA的生物起源和作用机制 |
| 1.2.3 miRNA的生物学功能 |
| 1.2.4 miRNA与压力应激 |
| 1.3 miRNA-31的研究进展 |
| 1.3.1 miR-31与干细胞 |
| 1.3.2 miR-31与肠炎及肠道肿瘤 |
| 1.3.3 miR-31与凋亡 |
| 1.3.4 miR-31与其它肿瘤 |
| 1.4 研究的目和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 细胞株 |
| 2.1.3 载体及菌株 |
| 2.1.4 miR-31 mimics和miR-31 inhibitor及引物合成 |
| 2.1.5 试剂及耗材 |
| 2.1.6 常用试剂配制 |
| 2.1.7 主要仪器设备 |
| 2.1.8 主要分析工具软件 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 转基因小鼠的获得及杂交 |
| 2.2.2 基因组的提取及基因型的鉴定 |
| 2.2.3 RNA的提取、反转录及定量 |
| 2.2.4 蛋白质的提取及Western Blot |
| 2.2.5 载体构建 |
| 2.2.6 双荧光素酶报告基因载体构建及相关细胞实验 |
| 2.2.7 小鼠小肠上皮细胞的分离及其相关实验 |
| 2.2.8 小鼠肠道上皮组织石蜡包埋块的制作 |
| 2.2.9 小鼠肠道上皮组织H&E分析 |
| 2.2.10 免疫组化染色 |
| 2.2.11 免疫荧光染色 |
| 2.2.12 miR-31原位杂交 |
| 2.2.13 X-gal染色 |
| 2.2.14 BrdU、EdU标记实验 |
| 2.2.15 染色质免疫沉淀技术(ChIP技术) |
| 2.2.16 CLIP-qPCR实验 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 miR-31在小鼠小肠上皮中的表达模式 |
| 3.1.1 正常状态下小鼠小肠上皮中miR-31的表达模式 |
| 3.1.2 压力条件下小鼠肠道上皮中miR-31的表达模式 |
| 3.2 可诱导的miR-31过表达转基因小鼠、miR-31全身敲除小鼠和miR-31小肠上皮特异敲除小鼠的构建 |
| 3.2.1 miR-31过表达转基因小鼠构建策略及效果检测 |
| 3.2.2 miR-31全身敲除小鼠(miR-31~(-/-))构建策略及效果检测 |
| 3.2.3 miR-31小肠上皮特异性敲除小鼠构建及效果检测 |
| 3.3 过表达miR-31促进小肠隐窝增高、上皮细胞增殖和干细胞增多 |
| 3.3.1 miR-31促进小肠隐窝增高 |
| 3.3.2 miR-31促进小肠上皮细胞增殖,并影响上皮细胞分化及凋亡 |
| 3.3.3 miR-31促进小肠上皮Lgr5~+干细胞的增殖 |
| 3.3.4 miR-31促进体外培养隐窝的生长 |
| 3.4 辐照后miR-31促进小肠上皮的再生 |
| 3.4.1 miR-31促进辐照处理后小肠隐窝再生 |
| 3.4.2 辐照后miR-31抑制Lgr5~+细胞的凋亡 |
| 3.5 miR-31促进炎症损伤肠道上皮的恢复 |
| 3.6 miR-31促进肠道肿瘤生长 |
| 3.7 miR-31激活Wnt、抑制BMP/TGFβ信号通路 |
| 3.7.1 miR-31激活Wnt信号通路 |
| 3.7.2 miR-31抑制BMP/TGFβ信号通路活性 |
| 3.8 miR-31通过p38和Gsk3β抑制细胞凋亡 |
| 3.9 miR-31直接作用的靶基因 |
| 3.10 STAT3和NF-κB通路介导辐照和炎症反应中miR-31的诱导表达 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 miR-31是ISCs本身固有的微环境信号调节因子 |
| 4.2 miR-31保护ISCs对抗凋亡 |
| 4.3 miR-31促进辐照损伤后肠道上皮的再生 |
| 4.4 miR-31在肠炎中的功能 |
| 4.5 STAT3和NF-κB调控miR-31的表达 |
| 4.6 miR-31促进肠道肿瘤进展 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 引物序列 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、小鼠小肠隐窝素基因的表达及大黄对其表达的影响（论文参考文献）
- [1]蒙药“巴布-7”对大肠杆菌性腹泻小鼠肠黏膜屏障保护机制的相关研究[D]. 高瑞娟. 内蒙古农业大学, 2021(01)
- [2]苦荞D-手性肌醇与多酚类化合物协同降糖作用机制研究[D]. 赵梦雅. 哈尔滨工业大学, 2020(02)
- [3]基于“脾为之卫”探讨益气解毒方对急性放射损伤小鼠的防护研究[D]. 王安. 北京中医药大学, 2020(04)
- [4]辣木叶对慢性便秘的治疗作用及蛋白质组学研究[D]. 高启霞. 中央民族大学, 2020
- [5]HD5衍生抗生素的设计、制备及其对小鼠辐射后细菌感染的救治作用[D]. 赵高梅. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [6]猪β防御素114的表达调控机制及其在缓解肠道屏障炎性损伤中的作用研究[D]. 苏国旗. 四川农业大学, 2019
- [7]罗伊氏乳杆菌激活Wnt/β-catenin通路刺激仔猪肠上皮细胞增殖机制的研究[D]. 吴海琴. 南京农业大学, 2019
- [8]宽叶独行菜促胃肠动力药效成分的作用机制研究[D]. 钟江斌. 青海师范大学, 2019(01)
- [9]健脾理气方通过cAMP和NF-κB通路修复十二指肠紧密连接治疗功能性消化不良的机制[D]. 常雄飞. 北京中医药大学, 2018(01)
- [10]miR-31在小肠干细胞、上皮再生和肿瘤发生中的功能与机制研究[D]. 田玉华. 中国农业大学, 2017(05)