一、肝纤维化形成机制的研究进展（论文文献综述）
谢宇欣[1]（2021）在《Gremlin1、VEGFR2、CD31及vWF在CCL4小鼠肝纤维化组织中表达相关性的研究》文中提出目的:临床研究显示肝纤维化是肝病晚期发生门静脉高压、腹水、肝性脑病等并发症的基础。因此,肝纤维化发生机制的研究对于肝病的治疗及预防具有重要的临床意义。Gremlin1对多种纤维化疾病的发生有重要作用。有研究发现,Gremlin1是通过拮抗BMP信号通路实现的。近年来发现,Gremlin1还是一种新型VEGFR2激动剂,与血管生成相关性疾病有关。血管内皮生长因子受体-2（VEGFR2）是表达酪氨酸激酶受体内皮细胞的主要促血管生成因子受体,在调控血管新生及重塑过程中起着重要的调控作用。现研究发现肝纤维化与肝窦毛细血管化、肝内血管生成有关。在肝纤维化形成过程中,肝窦内皮窗孔逐渐减少或消失、内皮下基底膜形成,形成类似于连续性的毛细血管。正常情况下肝组织几乎不表达血小板内皮细胞粘附因子（CD31）和Ⅷ因子相关抗原（v WF）等连续性内皮细胞标志物。因此本研究拟探讨Gremlin1、VEGFR2、CD31及v WF在小鼠肝纤维化模型中的表达及其相关性作用机制,以期为临床治疗肝硬化的防治提供新的靶点。方法:（1）建立模型:雄性C57小鼠30只,随机分为正常对照组和CCL4模型组,每组各15只。CCL4模型组给予灌胃35%CCL4橄榄油溶液（10ml/kg）,2次/周,持续8周;正常对照组腹腔注射橄榄油溶液（10ml/kg）,2次/周,持续8周。（2）天狼星红染色观察肝纤维化程度;（3）免疫组织化学法染色分析Gremlin1、VEGFR2、CD31及v WF在肝纤维化组织中的表达和分布;（4）Western Blotting分析Gremlin1、VEGFR2、CD31及v WF在肝纤维化组织中的表达和分布;（5）数据分析及作图选用Graph Pad Prism 7、Image Plus Pro统计软件,两样本之间采用非配对t检验,Pearson相关系数用于评估两样本之间的关联程度,针对数据的分析,P<0.05为差异有统计学意义,P<0.01为差异有统计学意义。结果:（1）免疫组化结果显示Gremlin1、VEGFR2、CD31及v WF在小鼠肝纤维化组织中表达水平高于正常对照组（P<0.0001,P<0.05）;（2）在CCL4小鼠肝纤维化组织中,Gremlin1的表达水平分别与VEGFR2、CD31及v WF呈正相关（P<0.0001）;（3）在CCL4小鼠肝纤维化组织中,VEGFR2表达水平分别与CD31及v WF呈正相关（P<0.01）。（4）Western Blotting结果显示Gremlin1、VEGFR2、CD31及v WF在小鼠肝纤维化组织中表达水平高于正常对照组（P<0.05,P<0.01）。结论:Gremlin1、VEGFR2、CD31及v WF在小鼠肝纤维化组织中的表达呈正相关,提示Gremlin1、VEGFR2、CD31及v WF可能共同参与肝纤维化的发生发展过程。
张荣[2]（2021）在《芪术颗粒治疗早期肝硬化临床疗效观察及其抗肝纤维化血管新生的机制研究》文中研究表明在前期理论、临床与实验研究中我们认识到“毒瘀肝络”是肝纤维化的基本病机,治疗在扶正的基础上强调化瘀通络、解毒散结,以芪术颗粒（黄芪、莪术、白术、丹参等）用于肝纤维化及早期肝硬化的防治。前期研究发现芪术颗粒可减弱肝组织血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、血管紧张素（angiotensin,Ang）/酪氨酸激酶受体 2（tyrosine kinase receptors 2,Tie-2）、p38-分裂原激活蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinase,P38 MAPK）、磷脂酰肌醇 3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B,AKT）等表达,从而起到减轻肝纤维化的作用,其作用机制可能是影响肝纤维化过程中肝窦毛细血管化。至于芪术颗粒如何影响肝窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cell,LSEC）毛细血管化,需要进一步研究。本研究结合临床、整体动物及细胞实验,进一步完善芪术颗粒对早期肝硬化的临床疗效及其抗肝窦毛细血管化的作用机制。目的:1.通过临床观察芪术颗粒对早期肝硬化气虚血瘀证患者中医证候积分、肝功能、肝纤维化四项及肝脏弹性纤维值的影响,研究芪术颗粒治疗早期肝硬化气虚血瘀证的临床疗效,并评价其安全性。2.通过体内实验（Wistar大鼠）与体外实验（大鼠LSEC）相结合,观察芪术颗粒对四氯化碳（Carbon tetrachloride,CC14）诱发肝纤维化大鼠模型肝窦内皮毛细血管化的影响及其可能作用机制。方法:1.临床试验:选取2019年03月-2021年01月在中国中医科学院广安门医院肝炎门诊及消化科病房就诊的18-65岁早期肝硬化气虚血瘀证患者作为研究对象,随机分为芪术颗粒组和复方鳖甲软肝片组,两组在西医常规治疗的基础上,分别给予芪术颗粒和复方鳖甲软肝片治疗,治疗12周,两组患者分别于治疗前及停药后检查肝功能、肝纤维化四项、肝脏弹性指标,并记录治疗前后中医证候评分。2.动物实验:雄性健康无特定病原体动物（specified pathogen free,SPF）级Wistar大鼠40只,其体重约180～200g,随机分为正常组、模型组、复方鳖甲软肝片组和芪术颗粒组,除正常组大鼠外其它各组大鼠均腹腔注射40%CC14橄榄油溶液,以3ml/kg的剂量每周2次,连续注射4周制造大鼠肝纤维化模型,并在建模的同进行药物灌胃。造模4周时,取各组大鼠肝脏组织Masson及HE染色来评估肝损伤及肝纤维化程度,造模成功后处死各组大鼠,取肝组织免疫组化方法染色检测α-平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin,α-SMA）、高度糖基化的i型跨膜糖蛋白（cluster-of-differentiation-34,CD34）、血小板内皮细胞粘附分子（Platelet endothelial cell adhesion molecule-1,CD31）的表达,并进行图像分析,同时进行新生微血管密度（microvessel density,MVD）分析,Western blot法检测各组大鼠肝组织毛细血管内皮陷窝蛋白-1（Caveolin-1）、Ⅷ因子相关抗原（von Willebrand factor,vWF）蛋白的表达。3.细胞实验:将Wistar大鼠腹腔注射40%CC14橄榄油溶液4周诱导肝纤维化,通过原代分离正常大鼠LSEC及肝纤维化大鼠LSEC。制备正常大鼠含药血清、芪术颗粒含药血清、复方鳖甲软肝片含药血清。正常组（正常大鼠LSEC+正常大鼠血清）、模型组（肝纤维化大鼠LSEC+正常大鼠血清）、芪术颗粒组（肝纤维化大鼠LSEC+芪术颗粒含药大鼠血清）、复方鳖甲软肝片组（肝纤维化大鼠LSEC+复方鳖甲软肝片含药大鼠血清）分别常规培养48h。采用台盼蓝染色及流式细胞术鉴定各组LSEC,电镜下观察各组大鼠LSEC的窗孔情况;Western Blot检测各组大鼠LSEC表型CD31、SE-1（大鼠肝窦内皮细胞标记物）及整合素α Vβ 3-黏着斑激酶（focal adhesion kinase,FAK）-R as/丝分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路及相关蛋白表达情况。结果:1.临床试验（1）两组患者一般资料比较:本研究共60例早期肝硬化气虚血瘀证患者完成了临床观察,芪术颗粒组30例（男性17例,女性13例）,年龄均值为53.53±6.83岁,病程6.23±3.24年,Child-Pugh评分均为A级;复方鳖甲软肝片组30例（男性16例,女性14例）,年龄均值为54.13±6.21岁,病程6.00±2.83年;Child-Pugh评分均为A级。两组早期肝硬化患者病因均以乙型肝炎病毒为主。两组患者一般资料比较差异无统计学意义。（2）肝功能的影响:芪术颗粒组及复方鳖甲软肝片组患者治疗前血清谷草转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）和谷丙转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）对比差异无统计学意义（P>0.05）,治疗12周结束后两组患者血清AST和ALT的均值较治疗前降低,差异有统计学意义（P<0.05）,且两组患者治疗后血清AST和ALT均恢复到正常水平,两组患者治疗后血清AST、ALT比较差异无统计学意义（P>0.05）。（3）纤维化四项的影响:两组早期肝硬化患者治疗前血清Ⅲ型前胶原（procollagen type Ⅲ,PC-Ⅲ）、层粘连蛋白（laminin,LN）、透明质酸（hyaluronic acid,HA）及 Ⅳ 型胶原（collagen type Ⅳ,Ⅳ-C）比较差异无统计学意义（P>0.05）,治疗12周后,芪术颗粒组患者血清PC-Ⅲ、LN、HA及Ⅳ-C的均值均较治疗前降低,差异有统计学意义（P<0.01）。复方鳖甲软肝片组患者血清PC-Ⅲ、LN、HA及Ⅳ-C的均值较治疗前降低,差异有统计学意义（P<0.01）。（4）肝脏弹性值的影响:本研究纳入的60例早期肝硬化气虚血瘀证患者肝脏弹性值均高于正常水平,早期肝硬化患者给与芪术颗粒治疗后肝脏弹性值较治疗前降低,差异有统计学意义（P<0.01）。（5）中医证候疗效及安全性分析:芪术颗粒治疗12周后患者食欲不振、神疲乏力、肝区（胁肋部）疼痛、气短懒言、胸闷善太息的症状均得到改善（P<0.01）,芪术颗粒中医证候总有效率为93.33%,高于复方鳖甲软肝片组,其中在改善患者神疲乏力、气短懒言症状,芪术颗粒明显优于复方鳖甲软肝片（P<0.05）。芪术颗粒在缓解早期肝硬化气虚血瘀证患者中医证候上具有明显优势且无不良反应的发生。2.动物实验（1）对肝纤维化大鼠肝脏病理的影响:4周后处死大鼠,取正常组、模型组、芪术颗粒组复方鳖甲软肝片组肝组织进行Masson和苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin,HE）,结果模型组大鼠肝组织出现增生的纤维组织和纤维隔形成,表明本研究大鼠肝纤维化模型造模成功,同时芪术颗粒组及复方鳖甲软肝片组大鼠肝纤维化程度较模型组减轻。（2）对肝纤维化大鼠肝组织α-SMA的表达的影响:正常组大鼠肝组织α-SMA表达很低,肝纤维化大鼠模型组肝组织α-SMA表达明显升高（P<0.05）。与模型组相比,芪术颗粒组及复方鳖甲软肝片组肝组织α-SMA表达显着降低（P<0.05）。（3）对肝纤维化大鼠肝组织中CD31、CD34表达的影响:免疫组化染色检测各组大鼠肝组织中CD31、CD34的表达,其中模型组肝组织染色强度最强,芪术颗粒组及复方鳖甲软肝片组肝组织中CD31、CD34平均光密度面积比较模型组明显减少,差异有统计学意义（P<0.05）。（4）对肝纤维化大鼠肝组织中vWF、Caveolin-1蛋白表达的影响:正常大鼠肝组织很少表达vWF和Caveolin-1蛋白,vWF和Caveolin-1蛋白的表达水平在大鼠肝纤维化过程中显着增加。与肝纤维化模型组比较,芪术颗粒组及复方鳖甲软肝片组肝纤维化大鼠肝组织中vWF及Caveolin-1蛋白的表达降低（P<0.05）。（5）对肝纤维化大鼠肝脏新生MVD的影响:分别用CD31、CD34标记对各组大鼠肝脏组织进行新生MVD分析,经CC14处理后,模型组大鼠肝脏组织中MVD明显增加,明显高于正常组大鼠（P<0.05）。CCl4诱导大鼠肝纤维化的同时给予芪术颗粒或者复方鳖甲软肝片灌胃处理,大鼠肝组织新生MVD明显减少,与模型组大鼠肝组织相比差异有统计学意义（P<0.05）。3.细胞实验（1）LSEC的观察:台盼蓝染色结果显示模型组与正常组LSEC的细胞存活率无明显差异。流式细胞术结果显示正常组及模型组LSEC中CD146+细胞和SE-1+细胞的比例均在90%以上。（2）对肝纤维化大鼠LSEC窗孔的影响:在扫描电镜下,正常LSEC的表面可见许多窗孔,模型组出现LSEC窗孔的减少,肝纤维化LSEC经芪术颗粒药物血清处理后LSEC窗孔增加。（3）对肝纤维化大鼠LSEC表型的影响:模型组大鼠LSEC表达CD31和SE-1的量明显高于正常组（P<0.05）。与肝纤维化大鼠模型组比较,芪术颗粒组LSEC中CD31和SE-1的表达明显降低（P<0.05）。（4）对肝纤维化大鼠LSEC整合素α Vβ 3-FAK-R as/MAPK信号通路的影响:与正常组比较,模型组大鼠LSEC整合素α Ⅴ β 3/GAPDH比值显着升高（P<0.01）,肝纤维化大鼠LSEC给予芪术颗粒含药血清处理后,LSEC中整合素α Ⅴβ 3/GAPDH比值降低（P<0.01）。与正常组比较,模型组大鼠LSEC中p-FAK/FAK、p-MAPK/MAPK比值均显着升高（P<0.01）,芪术颗粒含药血清处理肝纤维化大鼠LSEC后,LSEC中p-FAK/FAK、p-MAPK/MAPK比值降低,差异有统计学意义（P<0.01）。与复方鳖甲软肝片组对比,芪术颗粒组整合素αV β 3蛋白表达水平下降更为明显（P<0.05）。结论:1.芪术颗粒治疗3月后可明显改善早期肝硬化气虚血瘀证中医证候评分,使转氨酶恢复正常,并改善患者肝纤维化指标,可降低早期肝硬化气虚血瘀证患者肝脏弹性值。2.芪术颗粒可显着抑制CCl4诱导肝纤维化大鼠的纤维化,可减少肝纤维化肝组织中CD31、CD34、vWF和Caveolin-1的表达,降低肝窦微血管密度,减少肝窦微血管增生,防止肝窦毛细血管化。3.芪术颗粒可减轻肝纤维化过程中肝窦毛细血管化,其机制为抑制肝纤维化过程中LSEC窗孔的减少,改善肝纤维化过程中LSEC的表型,同时可调控LSEC中整合素αVβ3-FAK-Ras/MAPK信号通路发挥抗肝窦毛细血管化作用。
田园硕[3]（2021）在《活血软坚扶正方干预乙肝后肝纤维化的临床疗效研究及机制探索》文中认为研究目的:本研究通过网络药理学方法筛选活血软坚扶正方治疗乙肝后肝纤维化的作用靶点、信号通路;通过临床研究观察活血软坚扶正方对气虚血瘀型乙肝后肝纤维化患者的有效性和安全性,并通过对人转化生长因子β 1、金属蛋白酶抑制因子1浓度的测定,探讨活血软坚扶正方干预本病的可能疗效机制,为临床应用提供科学依据。研究方法:1.网络药理学研究:采用 TCMSP、TCMID、SwissTargetPrediction、PubChem、DisGeNET、OMIM、GeneCards等数据库筛选活血软坚扶正方活性成分及与乙肝后肝纤维化相关靶基因,采用Cytoscape软件构建“方药-成分-靶点-疾病”网络图,采用String数据库构建蛋白质相互作用网络,采用Metascape对活血软坚扶正方治疗乙肝后肝纤维化关键作用靶点进行GO富集分析和KEGG富集分析,获取活血软坚扶正方治疗乙肝后肝纤维化的主要生物过程和信号通路。2.临床试验研究:采用随机数分组方法,将符合纳入标准、不符合排除标准的63例气虚血瘀型乙肝后肝纤维化患者随机分为中药组和对照组,中药组33例（后脱落3例）,对照组30例。在抗病毒治疗的基础上,中药组予活血软坚扶正方,对照组予复方鳖甲软肝片,连续干预6个月。两组均于治疗前后记录中医证候评分、检测肝弹性值,检查肝功能、血清蛋白、凝血功能、肝纤四项、人转化生长因子β1、血清金属蛋白酶抑制因子1,计算无创肝纤维化指标（APRI、FIB-4）,并在治疗前、治疗3个月、治疗6个月时检测血、尿、便常规等安全性指标。观察比较两组患者治疗前后的肝弹性值、肝纤四项、APRI、FIB-4、肝功能、血清蛋白、凝血功能、人转化生长因子β1、血清金属蛋白酶抑制因子1、中医证候评分以及相关安全性指标的变化,并统计分析。研究结果:1.网络药理学研究结果研究最终共筛选获取33个活性成分,129个作用靶点与活血软坚扶正方治疗乙肝后肝纤维化密切相关。活血软坚扶正治疗乙肝后肝纤维化主要涉及生物过程、细胞组成、分子功能等多层次功能,通过调节PI3K-Akt信号通路、mTOR信号通路、phospholipase D信号通路、HIF-1α信号通路、FoxO信号通路、JAK-STAT信号通路、IL-17信号通路、MAPK信号通路、AMPK信号通路、TNF信号通路、PPARγ信号通路等多个通路等来发挥治疗作用。2.临床试验研究结果（1）影像学肝纤维化指标:中药组和对照组组内对比均能够显着降低患者的肝弹性值（P<0.01）,且中药组疗效优于对照组（P<0.05）。（2）血清学肝纤维化指标:中药组能显着降低血清中CIV的水平（P<0.01）,对照组治疗前后CIV无明显差异（3）无创肝纤维化指标:中药组和对照组组内对比均能降低FIB-4的水平（P<0.05）,且中药组疗效优于对照组（P<0.05）;中药组可显着降低APRI的水平（P<0.01）,对照组治疗前后APRI无显着差异。（4）肝功能相关指标:中药组和对照组组内对比均能显着降低血清中TBIL的水平（P<0.05）,且两组组间无明显差异;中药组可显着降低AST的水平（P<0.01）,对照组治疗前后AST无显着差异。（5）血清蛋白相关指标:两组治疗前后组内对比ALB和GLO水平无显着差异。（6）凝血功能相关指标:中药组可显着升高的PTA和PLT的水平（P<0.01）,对照组无明显PTA和PLT升高。（7）TIMP-1和TGF-β1:中药组可降低血清中TIMP-1的浓度（P>0.05）,对照组能够降低血清中TGF-β1的浓度（P>0.05）,但TIMP-1和TGF-β1组内、组间差异均无统计学意义。（8）中医证候指标:中药组和对照组均能明显降低患者的中医证候评分（P<0.01）,且中药组疗效优于对照组（P<0.01）。结论:1.网络药理学研究提示:活血软坚扶正方改善乙肝后肝纤维化具有多层次、多系统和整体干预的特点。2.通过影像学、血清学、无创肝纤维化指标三种方式的比较,发现:活血软坚扶正方可有效抑制乙肝后肝纤维化的形成。3.活血软坚扶正方能够显着改善气虚血瘀型乙肝后肝纤维化患者的症状、减轻肝脏炎症,调节凝血功能。4.活血软坚扶正方干预血清中金属蛋白酶抑制因子-1（TIMP-1）和人转化生长因子β1（TGF-β1）的作用不显着,药物对其可能存在一定抑制作用,但是否是主要干预因子尚存疑,需进一步的研究进行验证。
周怡驰[4]（2021）在《柴芪益肝方治疗肝纤维化的临床和实验研究》文中提出中国是肝病大国,多种肝病高发,肝纤维化作为肝病研究和治疗的重要领域,越来越受到重视。肝纤维化是肝脏修复肝损伤引起的异常结缔组织增生和细胞外基质过度沉积的病理改变。肝纤维化存在于大多数慢性肝病中,是慢性肝病向肝硬化发展的必经阶段,甚至可持续进展为肝硬化、肝癌,给患者生命健康带来严重威胁。研究肝纤维化的病因及发病机制、寻找有效的治疗靶点,对于阻止肝病的发展、维护患者的生命健康有很大的意义。近年来,肝纤维化的病理分子生物学机制、临床诊疗技术等取得了长足发展。但目前西医对于抗纤维化疗效尚不确切,缺乏有效的治疗手段。中医药治疗肝纤维化具有确切的优势,已有多种注册适应证为肝纤维化的中成药上市。柴芪益肝方由导师胡世平教授所创,是治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的经验方,前期临床和实验研究发现对肝纤维化有较好疗效,但其作用机制尚不清楚。胡教授现任北京中医药大学深圳医院党委书记,广东省名中医,全国基层名老中医师承项目指导老师,深圳市地方级领军人才,获评“南粤最美中医”,从事中医药防治慢性肝病的临床与科研工作30多年,擅长中医、中西医结合治疗肝脏疾病,形成了独特的学术思想体系。目的结合临床回顾性研究、网络药理学预测和动物实验探讨柴芪益肝方治疗肝纤维化的疗效与作用机制,为该方的进一步开发应用提供依据,并分析总结导师胡世平教授“推陈致新”的学术思想及其在柴芪益肝方组方思路中的应用。方法1、临床研究:通过回顾性研究方法,收集2018年1月1日至2021年2月3日期间在北京中医药大学深圳医院肝病科门诊及住院部诊断为慢性乙型肝炎患者的病例资料,并筛选出符合本研究标准的慢性乙型肝炎肝纤维化肝郁脾虚型患者。根据患者所服药物分为常规治疗组和CQYG组,收集所有患者治疗12个月前后的指标,包括主要指标:肝脏硬度值（LSM）、纤维化-4指数（FIB-4）、天门冬氨酸氨基转移酶和血小板比率指数（APRI）、乙肝病毒表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎病毒（HBV-DNA）定量;次要指标:谷丙转氨酶（ALT）,谷草转氨酶（AST）,总胆红素（TBiL）,谷氨酰转酞酶（GGT）,白蛋白（ALB）,将所有检测指标进行治疗前后的组内与组间比较。2、网络药理学:检索 TCMSP、TCMID、Swiss Target Prediction、OMIM、Gene Cards等数据库,筛选CQYG治疗肝纤维化的活性成分和潜在作用靶点。借助Cytoscape软件和String数据库,分别构建“药物-成分-靶点-疾病”网络和蛋白互作PPI网络,并进行拓扑学分析,筛选关键药效分子和核心靶点。运用Autodock vina软件进行分子对接,并基于R语言对作用靶点进行GO和KEGG富集分析。3、动物实验:选取50只6周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠,随机抽取10只分别纳入空白对照组（CTL）、肝纤维化模型组（Model）、柴芪益肝方低剂量组（CQYG-L）、柴芪益肝方高剂量组（CQYG-H）和水飞蓟素治疗组（Silymarin）,共5组。四氯化碳（carbontetrachloride,CCl4）腹腔注射建立小鼠肝纤维化模型:除空白对照组外,其余各组小鼠腹腔注射含15%CCl4的橄榄油5ml·kg-1,每周2次,连续注射8周。从造模第1天起,柴芪益肝方低、高剂量组小鼠分别灌胃给予0.37 g·kg-1·d-1、0.74 g·kg-1·d-1的柴芪益肝方,水飞蓟素组给予100 mg·kg-1·d-1灌胃。实验结束,摘取所有小鼠肝脏、收集血清,对各组小鼠肝组织进行HE、天狼星红、Masson染色;用自动生化分析仪检测血清AST和ALT的含量;ELISA法检测肝组织中MDA、SOD、GSH-Px和Hyp水平;免疫组化法检测肝组织中α-SMA、Collagen I、Vimentin的表达;免疫荧光法检测肝组织中Ki67+和Lgr5+细胞;提取各组肝组织RNA和蛋白,Real-time PCR和Western blot分别检测肝纤维化小鼠肝组织中NF-κB、TGF-β/Smad、Wnt/β-Catenin信号通路相关靶标mRNA和蛋白表达。结果1、临床研究:共纳入符合标准的患者203人,其中,常规治疗组纳入101人,年龄最大者76岁,最小22岁,平均年龄（41.34±0.90）岁;CQYG组纳入102人,年龄最大者67岁,最小27岁,平均年龄（43.13±0.78）岁,两组年龄无统计学差异（P>0.05）,具有可比性。（1）无创肝纤维化指标（LSM、FIB-4、APRI）在两组患者自身治疗前后比较,以及治疗后的组间比较,均无显着性差异（P>0.05）,但两组治疗后LSM均较治疗前有降低趋势。（2）两组患者自身前后比较,乙型肝炎病毒（HBV-DNA）定量和乙肝病毒表面抗原（HBsAg）治疗前和后均无显着性差异（P>0.05）;CQYG组较常规治疗组治疗后HBsAg显着性降低（P<0.05）,CQYG组治疗后HBV-DNA定量和HBsAg较治疗前均有下降趋势。（3）两组患者自身治疗前后血清肝功能指标（ALT、AST、GGT、TBiL、ALB）均在正常范围内,治疗后组间比较肝功能均无显着性差异（P>0.05）。2、网络药理学预测:共获得121种CQYG治疗肝纤维化的潜在活性成分和257个对应的作用靶点,并筛选出14种关键药效分子及28个核心靶点。点度中心性值前10的核心靶点和关键药效分子具有较好的结合活性。GO和KEGG结果主要涉及炎症反应、氧化应激、成纤维细胞增殖、内皮细胞增殖、调节脂质代谢活动、血管生成、肝再生等生物学过程及TNF信号通路、Th17细胞分化信号通路、IL-17信号通路、PI3K/Akt信号通路、Wnt信号通路、NF-κB信号通路等。3、动物实验研究:与模型组相比,CQYG各组和水飞蓟素组小鼠肝组织形态和胶原沉积较模型组改善,水飞蓟素组和CQYG-H小鼠血清ALT、AST水平均显着降低（P<0.01）;CQYG高剂量组肝组织MDA和Hyp的含量显着低于模型组（P<0.05）,SOD和GSH-Px含量显着高于模型组（P<0.05）;免疫组化结果显示,CQYG组和水飞蓟素组α-SMA、CollagenI、Vimentin阳性表达区域较模型组少;免疫荧光结果显示,柴芪益肝方组Ki67阳性细胞和Lgr5阳性细胞数量均较模型组有增多趋势;CQYG组肝组织中p-NF-κBp65、TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表达水平较模型组显着降低（P<0.05）;与模型组相比,CQYG-H 肝组织 CollagenI、TGF-β、TNF-α、IL-1βmRNA 的表达水平以及 Collagen I、α-SMA、TIMP-1、TGF-β、磷酸化 Smad2/3、Smad2/3、Smad4、Wnt3a、β-Catenin 蛋白表达均较模型组有不同程度降低,而MMP-9、Smad7蛋白表达水平显着升高（P<0.05）。结论1、临床研究:柴芪益肝方加减联合常规治疗有降低慢乙肝肝纤维化患者肝脏硬度值、HBV-DNA和HBsAg含量的趋势,且在降低HBsAg定量上优于单纯常规治疗。2、网络药理学:柴芪益肝方可能通过槲皮素、白藜芦醇、山奈酚等活性成分作用于丝裂原激活蛋白激酶MAPK1/3/8、原癌基因酪氨酸激酶Src、激活子蛋白Jun等靶点,以及TNF信号通路、Th17细胞分化信号通路、IL-17信号通路、PI3K/Akt信号通路、HIF-1信号通路、Rap1信号通路、Wnt信号通路、NF-κB信号通路等,调节肝脏炎症反应、氧化应激、细胞增殖、肝再生等生物学过程发挥治疗肝纤维化的作用。3、动物实验研究:柴芪益肝方能显着减轻四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化,其作用机制可能减轻氧化应激反应、抑制NF-κB介导的炎症信号通路,下调炎症细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β的释放,减轻肝脏炎症,并通过调节TGF-β/Smad、Wnt3a/β-catenin信号通路,抑制肝星状细胞的活化,调节MMP-9和TIMP-1活性平衡,减少细胞外基质α-SMA、Collagen I、Hyp的合成,促进ECM降解相关。4、“推陈致新”学术思想:导师胡世平教授“推陈致新”的学术思想核心在于顺应人体本身的正气祛邪之势和气血津液各自的新陈代谢过程,协助人体自然排邪,促进疾病向愈。在肝纤维化治疗上,通过“推陈致新”,加强气化动力、调节气机升降,使病理产物消除的同时,人体气血津液正常化生。
宋健[5]（2021）在《基于核受体探讨人参皂苷25-OCH3-PPD和M4调控肝纤维化的作用机制研究》文中研究指明目的:肝纤维化（hepatic fibrosis）是慢性肝病的常见病理基础,并且是慢性肝病发展为肝硬化的必要阶段。肝纤维化的主要特征是激活肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）介导细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的过度沉积。并且慢性肝脏炎症也会加速肝纤维化的进程。人参皂苷活性成分是人参中主要的活性物质,其药理作用与能量代谢和调控炎症反应有关。人参皂苷具有肝保护、抗氧化、抗炎等广谱的药理活性。核受体肝X受体（liver X receptor,LXRs）与法尼酯X受体（Farnesoid X receptor,FXR）作为调节能量代谢的重要途径,在调控肝纤维化和炎症中发挥重要作用。本课题是基于核受体LXRs与FXR探讨人参皂苷25-OCH3-原人参二醇（25-OCH3-PPD）及20S-原人参三醇（M4）调控肝纤维化的作用与机制研究。方法:1.人参皂苷25-OCH3-PPD促进LXRs的活性改善P2X7r介导的NLRP3炎症小体在肝纤维化进程中的作用:（1）TAA诱导的肝纤维化:C57BL/6小鼠分为六组:正常组、TAA组、TAA+25-OCH3-PPD（5、10、20 mg/kg）给药组和TAA+Silymarin（100 mg/kg）组。25-OCH3-PPD与Silymarin组小鼠通过灌胃的方式给药。除正常组外,其他各组小鼠均通过腹腔注射TAA（第一周100 mg/kg,三次;第二周至第五周200mg/kg,每周两次）。相关指标的测定:采用H&E染色、Sirius Red染色、Masson染色法检测组织病理学变化。检测血清中ALT、AST变化水平。TUNEL染色法检测25-OCH3-PPD对肝细胞凋亡的影响。在TAA诱导的肝纤维化中,通过蛋白印记、RT-PCR、免疫组织化学染色以及组织荧光染色实验检测细胞外基质、炎症因子、SIRT1、FXR、LXRα、LXRβ、P2X7r和NLRP3等蛋白或m RNA的表达情况。分析了与TAA诱导的凋亡途径相关的几个分子蛋白的表达,包括caspase-3、Bcl-2、Bax、Bid、c FILP。（2）体外实验:选用HSC-T6细胞,TGF-β刺激2 h,然后用25-OCH3-PPD（1、5或10μM）或caspase-1抑制剂I培养6 h。这些细胞被收集,分别做Western blotting以及免疫荧光实验,检测HSC-T6细胞中α-SMA、P2X7r、NLRP3、LXRβ、LXRα、caspase-1、IL-1β等蛋白的表达水平;并通过免疫荧光染色做进一步验证。2.20S-原人参三醇通过调控FXR-P2X7r信号通路改善肝纤维化进程的研究中:（1）TAA诱导的肝纤维化:C57BL/6小鼠随机分成4组:正常组、TAA组、TAA+M4-10组、TAA+M4-20组。小鼠每天采用M4（10和20 mg/kg）或等量生理盐水灌胃处理。除正常组小鼠外,小鼠腹腔注射TAA（第一周100 mg/kg,三次;第二周至第五周200 mg/kg,每周两次）,以建立小鼠肝纤维化模型。相关指标的测定:采用H&E染色法检测组织病理学变化。提取总蛋白进行蛋白印迹分析实验,检测α-SMA、Collagen I、TIMP-1、MMP-13、FXR、P2X7r、NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6等蛋白的表达水平;并提取RNA,通过RT-PCR定量分析,检测m RNA的表达水平,以及免疫荧光染色做进一步验证。（2）HSC-T6细胞体外实验:HSC-T6细胞被TGF-β刺激2 h后,再用浓度为10、20μM的M4或guggulsterone（50μM）或GW4064（2μM）处理4 h。提取细胞总蛋白进行蛋白印迹分析实验,检测HSCs细胞中α-SMA、FXR、P2X7r、caspase-1等蛋白的表达水平;并提取RNA,通过RT-PCR定量分析,检测m RNA的表达水平,以及FXR与P2X7r免疫荧光染色做进一步验证。（3）Hep G2细胞质粒转染（sh RNA-FXR）:对Hep G2细胞给予FXR特异性si RNA转染48 h,然后给予TGF-β培养2 h,再用M4孵育细胞4 h。利用RT-PCR、Westeron blot,以及免疫荧光法检测FXR、α-SMA和P2X7r的表达变化以及IL-1β蛋白表达情况。结果:1.人参皂苷25-OCH3-PPD通过促进LXRs的活性改善P2X7r介导的NLRP3炎症小体在肝纤维化进程中的研究:（1）TAA诱导肝纤维化小鼠模型:TAA组小鼠血清ALT、AST水平升高,肝组织发生损伤并有大量胶原沉积;而25-OCH3-PPD可以降低血清中ALT、AST水平;改善TAA诱导小鼠肝脏组织的病理变化以及肝组织中胶原沉积情况;25-OCH3-PPD可以改善肝组织中纤维化相关指标α-SMA、Collagen-I、TIMP-1、MMP-13;降低促炎细胞因子表达水平,包括降低caspase-1、IL-1β、IL-18等蛋白和m RNA的表达水平;改善肝组织中肝细胞凋亡情况,调控了caspase-3、Bcl-2、Bax、Bid、FILP凋亡途径相关分子蛋白的表达;并抑制P2X7r-NLRP3炎症小体的活化进;抑制PI3K/Akt磷酸化,活化LKB1/AMPK-SIRT1信号通路;25-OCH3-PPD还能改善由TAA诱导的LXRs和FXR的活性降低。（2）体外实验中,25-OCH3-PPD减弱HSC-T6细胞中促纤维化标志物α-SMA的转录活性;25-OCH3-PPD可以通过调控LXRs和P2X7r-NLRP3、P-PI3K/P-Akt的表达降低,抑制肝星状细胞的活化;并且在肝星状细胞中抑制了caspase-1、IL-1β、IL-18的表达,与caspase-1抑制剂I效果一致。2.20S-原人参三醇通过调控FXR-P2X7r信号通路改善肝纤维化进程的研究:（1）在TAA诱导的小鼠肝纤维化中,M4可减轻组织病理学改变,改善肝损伤;M4可以调节肝组织中肝纤维化相关指标α-SMA、Collagen-I、TIMP-1、MMP-13的表达;并降低肝组织中促炎细胞因子表达水平,包括降低F4/80、caspase-1、IL-1β、IL-18等蛋白和m RNA的表达水平;蛋白印记、RT-PCR、组织免疫荧光实验表明,M4显着增加FXR的蛋白和m RNA的表达;M4也抑制了和P2X7r、NLRP3的表达,对P2X7r-NLRP3信号通路具有调控作用。（2）HSC-T6细胞体外实验中,TGF-β刺激后肝星状细胞被活化;给予M4可抑制HSC-T6中细胞外基质（ECM）的沉积包括α-SMA、Collagen-I、TIMP-1的表达,升高MMP-13的表达;以及降低caspase-1、IL-1β、IL-1R1和IL-6等炎症因子的表达水平;M4显着增加了FXR的表达,抑制了P2X7r-NLRP3信号通路,并作为FXR激动剂GW4064发挥作用;M4与GW4064激活FXR,抑制了P2X7r、α-SMA、caspase-1、IL-1β、IL-1R1的表达;（3）并且对Hep G2细胞转染FXR,建立sh RNA-FXR,实现了Hep G2细胞低表达FXR;但给予M4后FXR被激活,活化FXR后进而抑制了P2X7r、α-SMA、caspase-1的表达。结论:人参皂苷25-OCH3-PPD与M4可改善TAA诱导小鼠和活化HSCs中纤维化形成及炎症。25-OCH3-PPD可能激活LXRs,以改善P2X7r介导的NLRP3炎症小体。并且25-OCH3-PPD可以通过调控LKB1-AMPK信号通路以及激活SIRT1调节TAA诱导的肝纤维化和肝脏炎症。M4改善了TAA诱导的肝纤维化,其调控肝纤维化机制可能通过激活FXR介导P2X7r-NLRP3炎症信号通路。因此,25-OCH3-PPD和M4可能是一种有效的抗肝纤维化和抗肝脏炎症活性物质。
于亚男[6]（2021）在《滇产铁皮石斛对CCl4诱导大鼠肝纤维化的保护作用》文中指出目的:观察不同剂型的滇产铁皮石斛（Dendrobium candidum from Yunnan,DCY）对CCl4诱导肝纤维化大鼠肝组织病理学、肝功能和肝纤维化生化学指标的影响,同时通过体外观察铁皮石斛多糖（Dendrobium candidum polysaccharide,DCP）对活化肝星状细胞系LX2（Hepatic stellate cell LX2,HSC-LX2）增殖、凋亡的影响,探讨其抗肝纤维化的作用机制。方法:（1）实验一:选取86只SD大鼠,将其随机分为正常组15只、模型组71只,模型组大鼠行CCl4皮下注射诱导肝纤维化,正常组给予等量生理盐水处理,每周3次,同时称体重。连续注射5周后,随机处死正常组和模型组大鼠各5只,行肝组织病理切片,镜下观察各组肝组织的病理学改变。再随机选取8只正常组大鼠为阴性对照组（NG）,剩余MG 64只大鼠随机分为DCY粉剂组（DDG）、鲜榨组（FDG）、秋水仙碱阳性对照组（CG）和模型组（MG）,其中粉剂组和鲜榨组又随机分别分为低浓度组（DGl,0.15g/m L）、中浓度组（DGm,0.45g/m L）、高浓度组（DGh,0.75g/m L）。DCY的粉剂和鲜榨组分别给药浓度由低到高分别为0.15g/m L、0.45g/m L、0.75g/m L,CG给予秋水仙碱浓度为0.002%,同时MG和NG给予等量生理盐水,各组给药剂量均为3 m L/只,每天灌胃1次。连续灌胃4周后,各组大鼠称体重,断头处死,立即在无菌条件下剖腹行腹主动脉采血,然后观察肝的色泽、质地,并取肝称肝重,计算肝脏指数（Liver index,LI）;采用HE染色、Masson染色法,镜下观察各组肝组织的病理学改变;通过免疫组织化学染色法,检测各组肝组织中转化生长因子-β1（TGF-β1）的表达情况;应用血液生化仪检测大鼠血清肝功能指标ALP、AST、GPT的改变,并采用ELISA法检测其血清肝纤维化指标HA、LN、PCIII的变化。（2）实验二:体外传代HSC-LX2,取对数生长期细胞培养,以5×104/孔的细胞密度种入6孔板,分阴性对照组和DCP组进行划痕实验,其中DCP组给予含药浓度为400ug/m L,然后检测HSC-LX2在2 h、6 h、12 h、24 h、48 h的细胞迁移率;另体外培养HSC-LX2,以1×103/孔的细胞密度种入96孔板,分为阴性对照组（NG）、25ug/m L DCP组（DCPG-25）、50ug/m L DCP组（DCPG-50）、100ug/m L DCP组（DCPG-100）、200ug/m L DCP组（DCPG-200）、400ug/m L DCP组（DCPG-400）,分别给予不同浓度的DCP处理24 h后,采用MTT法检测并计算DCP对HSC-LX2的抑制率;同上方法体外培养HSC-LX2,以5×104/孔的细胞密度接种至6孔板内,分为阴性对照组（NG）、100ug/m L DCP组（DCPG-100）、200ug/m L DCP组（DCPG-200）、400ug/m L DCP组（DCPG-400）,细胞培养12h时后,低、中、高浓度组分别加入DCP的浓度为100μg/m L、200μg/m L、400μg/m L,各孔加入同等液量1.5 m L,作用24h后,倒置显微镜下观察细胞形态并进行流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:（1）实验一:（1）一般情况及肝脏外观的变化:模型制备期间MG大鼠一般状态差,体重呈缓慢上升态势,两种剂型的DCY给药干预后,DDG、FDG、CG三组大鼠一般状态好转。NG大鼠肝脏多分为6叶,呈棕红色,表面滑润,质地柔软;MG大鼠肝脏则偏暗红色,肝表面可见弥漫性小结节,质地偏韧;DDG、FDG、CG三组大鼠肝脏质地较韧并有颗粒感,但与MG比较均有较明显改善。（2）LI变化:与NG比较,MG大鼠LI明显升高（P<0.01）;CG、DDG、FDG的LI较NG偏高,但分别与NG比较差异无统计学意义（P>0.05）;与MG比较,DDGl、DDGm、DDGh、FDGl、FDGm、FDGh、CG的LI均明显降低（P<0.05或P<0.01）;与CG比较,DDGl、DDGm、DDGh、FDGl、FDGm、FDGh各组的LI偏高,但差异无统计学意义（P>0.05）;与DDGh比较,DDGl的LI降低不明显,有统计学意义（P<0.05）;与FDGh比较,FDGl和FDGm两组的LI变化无统计学意义（P>0.05）。（3）肝组织病理学改变:HE染色显示,NG大鼠肝脏细胞形态正常,核圆居中,肝细胞索呈放射状排列紧密;MG大鼠肝脏细胞排列紊乱,细胞内广泛形成脂肪空泡,可见大量假小叶形成,汇管区扩大,有炎细胞浸润;CG、DDG、FDG大鼠的肝损伤均有明显改善。Masson染色显示,NG大鼠肝组织中的肝细胞形态正常,肝细胞索排列规则,细胞内未见明显脂肪空泡,汇管区无明显胶原纤维沉积;MG大鼠肝细胞索排列紊乱,可见大量假小叶形成,汇管区有大量胶原纤维沉积;CG、DDG、FDG大鼠的肝损伤明显缓解,假小叶形成减少,汇管区纤维化程度降低。随着DCY各剂型给药浓度的增高,大鼠肝组织的病理变化改善更加明显,可能存在剂量依赖性。（4）免疫组织化学染色结果:与NG相比,MG、DDGl和FDGl大鼠肝组织中TGF-β1的表达明显增多（P<0.01）;与MG相比,DDGm、DDGh、FDGm和FDGh各组的TGF-β1表达明显降低（P<0.01）;与CG比,DDGl、FDGl、DDGm和FDGm各组的TGF-β1表达差异均十分显着（P<0.01）;DDGl、DDGm与DDGh相比,FDGl、FDGm与FDGh相比,TGF-β1的表达差异均有统计学意义（P<0.01）。结果表明,DCY能降低大鼠肝组织TGF-β1的表达水平,且可能有剂量依赖性。（5）肝功能血清生化指标变化:与NG相比,MG大鼠血清ALP、AST、GPT的表达明显升高（P<0.01）;与MG相比,DDGl、DDGm、DDGh、FDGl、FDGm、FDGh各组大鼠血清ALP、AST、GPT的表达均降低（P<0.01）;与CG相比,DDGl、DDGm、DDGh、FDGl、FDGm、FDGh各组大鼠血清ALP、AST、GPT的表达均无统计学意义（P>0.05）;DDGl、DDGm与DDGh相比,FDGl、FDGm和FDGh相比,各组大鼠血清ALP、AST、GPT的表达差异均无统计学意义（P>0.05）。（6）肝纤维化血清生化指标变化:与NG相比,MG大鼠血清HA、LN、PC-III的表达明显升高（P<0.01）;与MG相比,DDGl、DDGm、DDGh、FDGl、FDGm、FDGh各组大鼠血清HA、LN、PC-III的表达均降低（P<0.05）;与CG相比,DDGm、DDGh、FDGm和FDGh各组血清HA、LN、PC-III的表达差异无统计学意义（P>0.05）,而DDGl和FDGl均有显着统计学意义（P<0.01和P<0.05）。但值得注意的是,在不同剂量药物干扰组进行组内比较时,仅LN的表达可能存在剂量依赖性,即DDGl与DDGh相比,FDGl与FDGh相比,LN的表达差异均十分显着（P<0.01）。（2）实验二:（1）一般情况:传代的HSC-LX2贴壁后,光镜下显示细胞生长旺盛,胞质透亮,细胞伸展呈星状,核仁清晰,细胞碎片少。（2）划痕实验:给药组细胞迁移率显着降低,表明DCP可通过抑制HSC-LX2的迁移来起到抗肝纤维化的作用。（3）MTT法检测结果:随着DCP给药浓度的增高,细胞增殖抑制率逐渐增高,各浓度给药组分别与NG比较,差异显着有统计学意义（P<0.01）;DCPG-25、DCPG-50、DCPG-100、DCPG-200和DCPG-400各组进行两两比较,HSC-LX2的增殖抑制率均显着较低,差异有统计学意义（P<0.05）。结果表明,DCP可抑制HSC-LX2的增殖且呈剂量依赖性。（4）流式细胞术结果:随着给药浓度增加,HSC-LX2的生长密度逐渐降低,细胞凋亡率逐渐升高,并与给药浓度呈正相关。各浓度给药组分别与NG比较,差异显着有统计学意义（P<0.01）;与DCPG-400比较,DCPG-100和DCPG-200凋亡率较低,差异显着,有统计学意义（P<0.01）,表明DCP能显着促进HSC-LX2凋亡且呈剂量依赖性。结论:两种剂型DCY均可改善肝纤维化大鼠的一般状态、肝功能、肝纤维化生化指标以及肝组织的病理变化,并降低肝组织中TGF-β1的表达;DCP能抑制活化的HSC-LX2增殖并促进其凋亡;随着给药浓度的升高,体内外检测指标大部分得到明显改善。因此,铁皮石斛具有抗肝纤维化作用,可能存在剂量依赖性。
张嘉鑫[7]（2021）在《基于弹性蛋白合成及降解探讨益肝消积方干预早期肝硬化的机制研究》文中认为背景:肝硬化（Hepatic cirrhosis,HC）为肝脏受各种损伤因素侵袭,出现以肝纤维化、假小叶为特点的疾病,由乙肝病毒、丙肝病毒、酒精等一种或多种病因引起。5年生存率为14-35%,已成为全球成人死亡率第14高的病因。目前的治疗主要集中在病因与并发症防治方面,肝硬化本身能否被逆转一直存在争议。国内外学者认为,肝硬化实现逆转必然涉及以下三方面环节:细胞外基质（extracellular matrix,ECM）降解,肝细胞再生及肝小叶结构重建。其中,ECM降解为重要前提。近年研究提示,弹性蛋白合成、降解及其交联阻碍了 ECM降解,进而影响逆转过程。弹性蛋白是由肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）分泌的,为ECM重要组分。其在正常肝脏中也存在,但含量极低,在肝硬化阶段,沉积迅速。目前,中药单体、复方研究多集中于抗纤维化领域,对早期肝硬化关注较少,需要更多基础研究及高质量的临床试验进一步证实中药疗效优势,并对其相关机制进行深入挖掘。中药复方具有多层次、多靶点的先天优势,但现有研究多聚焦于抑制HSCs活化、促进胶原降解或抗肝窦毛细血管化等方向,尚未对中医药潜在的调控弹性蛋白合成及降解的相关机制进行探索。目的:基于益肝消积方对弹性蛋白合成及降解的调控作用,探索在四氯化碳（CCl4）诱导的肝脏发生损伤形成早期肝硬化病变后,该复方干预早期肝硬化的效果及其可能的机制,以期为益肝消积方进一步成果转化提供理论支撑,同时亦为其它防治早期肝硬化药物的研发提供方向。方法:通过给予SPF级雄性Sprague Dawley大鼠（200±10g）1ml/kg腹腔内注射50%CCl4和橄榄油混合液,2次/周,共6周,构建早期肝硬化模型。7周始,予益肝消积方、阳性对照药（安络化纤丸）,1ml/100g剂量灌胃。空白对照、模型对照组予等剂量蒸馏水灌胃,日1次,持续6周。用生化法检测ALT、AST评估肝功能;行组织病理学染色（HE染色、天狼猩红染色及Masson染色）评估早期肝硬化病变进展、检测肝脏胶原沉积;用弹性纤维染色评估肝脏的弹性蛋白沉积;免疫组织化学染色、免疫荧光染色观察肝组织中TGF-β1、CD68、CD80、CD163和α-SMA表达情况;用蛋白免疫印迹（Western blot,WB）分析以及实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测 Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、CCL2、CCR2、TGF-β1、TGF-βR-Ⅱ、Smad2/3、P-Smad2/3、Smad4、Smad7、Sp1、TNF-α、Ras、MEK1/2、ERK1/2、MMP-2、MMP-9、MMP-12、TIMP-1的蛋白水平及bFGF、弹性蛋白（Elastin）的mRNA水平变化,进而对益肝消积方干预早期肝硬化的作用及其相关机制进行初步探索。结果:1.模型制备:予50%CCl4/橄榄油混合液,腹腔注射,1ml/kg,2次/周。造模6周后,组织病理染色发现,模型组大鼠肝脏出现大量纤维增生,汇管区增宽,形成假小叶,说明模型制备成功。2.一般情况:益肝消积方治疗组及阳性对照安络化纤丸组大鼠毛色、精神状态、进食量等方面均优于模型组。体重上,治疗组大鼠体重均明显高于模型组（P<0.01）;体重增长趋势上,益肝消积方组优于安络化纤丸组。3.肝功能:与正常组相比,模型组大鼠血清中ALT、AST含量升高显着（P<0.01）。益肝消积方和阳性对照组（安络化纤丸）较模型组显着下降（P<0.05或P<0.01）。与安络化纤丸相比,益肝消积方在改善ALT方面疗效较优。4.肝组织病理学表现:从肝脏外观看,模型组大鼠颜色变暗,体积缩小,表面粗糙,边缘较钝,质地较硬韧,部分肝脏在剥离时与胸膜腔其他组织相粘连,难以剥离。益肝消积方和安络化纤丸治疗后的大鼠肝体积缩小不明显,表面粗糙不明显,质地较柔韧,未发现与胸腔其他组织粘连,较易剥离。此外,通过组织学染色（HE染色、Masson染色、天狼猩红染色）发现,与模型组大鼠相比,益肝消积方和安络化纤丸治疗后的大鼠肝脏炎性细胞浸润程度减轻,病变范围减小,汇管区及周围纤维增生程度减轻,假小叶数量明显减少,且胶原纤维等细胞外基质成分沉积减少（P<0.01）。对比安络化纤丸,益肝消积方抑制胶原沉积的效果较好。说明益肝消积方能够有效抑制炎细胞浸润,减少胶原纤维过度沉积,从而发挥干预早期肝硬化的作用。5.弹性纤维染色结果:为观测弹性纤维变化,我们对其进行了特殊染色。实验发现,在早期肝硬化阶段,模型组弹性纤维含量增多迅速,显着高于空白对照组（P<0.01）。益肝消积方、安络化纤丸治疗组与模型组相比,弹性纤维含量显着减少（P<0.01）,且益肝消积方效果较明显。6.免疫组化、免疫荧光染色结果:与空白对照组相比,模型组TGF-β1、α-SMA、CD68、CD80、CD163阳性表达区域明显增多。与模型组相比,益肝消积方、安络化纤丸组阳性区域明显减少。7.qRT-PCR结果:模型组与空白对照组相比,ElastinmRNA表达量显着升高（P<0.01）。与模型组相比,益肝消积方治疗组ElastinmRNA表达量显着下降（P<0.01）。对比安络化纤丸,益肝消积方减少ElastinmRNA表达更显着;模型组bFGF mRNA较正常组升高显着（P<0.01）。对比模型组,益肝消积方治疗组bFGF mRNA表达量显着下降（P<0.01）。对比安络化纤丸,益肝消积方下调bFGF mRNA表达更显着。8.Western blot 结果:与空白对照组相比,模型组 Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、CCL2、CCR2、TGF-β1、TGF-β RⅡ、P-Smad2/3、Smad4、Ras、Sp1、MMP-2、MMP-9、MMP-12、TIMP-1 蛋白表达含量明显升高（P<0.05 或 P<0.01）,Smad7、TNF-α、MEK1/2 蛋白表达含量明显下降（P<0.05或P<0.01）;与模型组相比,益肝消积方治疗组Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、CCL2、CCR2、TGF-β1、TGF-β RⅡ、P-Smad2/3、Smad4、Ras、Sp1、MMP-2、MMP-9、MMP-12、TIMP-1 蛋白表达含量明显降低（P<0.05 或 P<0.01）,Smad7、TNF-α、MEK1/2蛋白表达含量明显上升（P<0.05或P<0.01）。结论:1.予50%CCl4/橄榄油混合液,腹腔注射,1ml/kg,2次/周,共6周,可成功制备早期肝硬化大鼠模型。予益肝消积方干预后,可改善早期肝硬化大鼠体重、肝功能;有效抑制早期肝硬化大鼠肝脏炎性细胞浸润,肝细胞变性、坏死,胶原纤维（Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ）、弹性纤维等ECM沉积,改善病变程度。2.益肝消积方可抑制α-SMA表达,下调CD68、CD80、CD163表达量,抑制CCL2-CCR2通路,进而具有抑制HSCs激活,抑制单核/巨噬细胞浸润,及向M2型巨噬细胞极化,阻止单核/巨噬细胞向损伤肝组织部位迁移,减少Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和Elastin含量,发挥干预早期肝硬化的作用。3.益肝消积方能通过 TGF-β1/Smads、TGF-β1/Ras/ERK 和 bFGF、TNF-α/MEK/ERK信号转导通路抑制胶原纤维、弹性纤维等ECM合成,发挥干预早期肝硬化的作用。4.益肝消积方可通过调节MMPs/TIMPs酶系,促进胶原纤维、弹性纤维等ECM降解,达到干预早期肝硬化的作用。
刘佳萱[8]（2021）在《ACSL1在HSC/肝纤维化中的功能及机制研究》文中进行了进一步梳理研究目的:肝纤维化是肝脏受到某些刺激和损伤后的一种病理状态,以肝损伤后再生修复过程中出现肝内细胞外基质（extracellular matrix,ECM）过度沉积为特点。导致肝纤维化发生的关键细胞是肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）,其在炎症、肝细胞死亡等因素刺激时,可被激活转变为成肌纤维细胞（样）细胞。最近的研究表明,HSC的脂质代谢改变对于其活化十分重要。在肝组织中,长链酰基辅酶A合成酶1（acyl-co A synthetase long-chain 1,ACSL1）是ACSL家族中表达最高的同工型,是肝脏组织脂质代谢的主要调节剂。本组工作曾提示ACSL1可能有抑肝纤维化作用但作用机制尚不清楚。本研究首先检测了人肝纤维化等几种肝组织中ACSL1的表达和人HSC（LX-2细胞系）中ACSL1的表达情况、分析ACSL1与HSC活化/肝纤维化进程的关系,体外实验明确了ACSL1在HSC活化/纤维化中的生物学作用。再通过靶向脂质组学研究了过表达ACSL1后HSC脂质代谢的变化并筛选出ACSL1过表达后HSC内差异表达的脂质代谢物,后续实验进一步验证了差异代谢物对HSC活化/肝纤维化的影响,并阐述了ACSL1影响HSC细胞内的脂代谢进而影响纤维化的可能调控机制。在此基础之上,经阅读大量文献报道发现核因子κB（nuclear factor kappaB,NF-κB）所调控的炎症通路对肝纤维化影响重大,而应用生物信息学技术分析和筛选又发现NF-κB可结合ACSL1启动子片段,故进一步进行实验探究了NF-κB与ACSL1的结合及NF-κB通过对ACSL1的调控而影响肝纤维化的相关机制。研究方法:首先通过对临床肝组织样本中ACSL1的表达进行检测,明确ACSL1在肝纤维化等几种肝组织中的表达情况;在体外人HSC细胞系LX-2中对ACSL1的表达进行验证,功能实验明确ACSL1对HSC/纤维化的生物学功能。通过ACSL1的序列信息构建过表达及干扰ACSL1慢病毒,完成病毒包装后进行LX-2细胞感染并获得过表达或干扰ACSL1稳定株转染细胞、进一步对ACSL1的功能进行验证;进一步通过Ed U增殖实验和Annexin V-APC单染法凋亡实验检测来分析ACSL1对HSC细胞增殖凋亡的影响。接着,通过使用构建好的ACSL1的过表达慢病毒稳转株和相应对照进行液相色谱与质谱串联（LC-MS/MS）的靶向定量脂质组学分析,以分析HSC内ACSL1变化对HSC内脂质含量变化及对肝纤维化相关功能的影响;通过分析过表达ACSL1后HSC脂质代谢的变化,进一步通过对这些脂代谢差异物质的干预,明确其对HSC/纤维化的影响。最后,通过PROMO预测出NF-κB是ACSL1上游的转录因子后再通过染色质免疫共沉淀（Ch IP）实验以验证在HSC中转录因子NF-κB可与ACSL1的启动子片段结合;在LX-2中明确转化生长因子-β1（transforming growth factor beta-1,TGF-β1）通路对ACSL1/NF-κB p65的调控,验证NF-κB p65与ACSL1表达的关系及检测分析NF-κB通路对肝纤维化的发生发展的影响。研究结果:（1）免疫组化结果显示:在人肝组织样本中随着HSC的活化ACSL1在HSC中的表达减弱;在HSC体外实验中,经TGF-β1刺激后,与Blank组相比,肝纤维化相关指标?型胶原（type?collagen alpha 1,Col1a1）和α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）表达分别升高而ACSL1表达下降,Col1a1的表达随TGF-β1浓度增加而增加、ACSL1表达随该浓度增加而下降;（2）获得ACSL1过表达慢病毒,加入含有puromycin的培养基感染细胞后进行筛选,稳转株筛选成功可进入后续实验;获得ACSL1干扰慢病毒,通过q RT-PCR检测ACSL1的敲减效率,选用敲减效率最高的KD1感染细胞,进行后续功能学和下游肝纤维化指标检测等实验;（3）过表达ACSL1抑制HSC胶原合成;干扰ACSL1后促进HSC胶原合成;（4）在LX-2中干扰ACSL1后细胞增殖速率升高,过表达ACSL1后细胞凋亡比例升高;（5）在LX-2细胞株中过表达ACSL1后进行液相色谱与质谱串联（LC-MS/MS）靶向定量脂质组学分析发现:所有脂质分类组别中作为HSC内脂滴主要成分的甘油三酯（triglyceride,TG）的数量最多;转染ACSL1过表达慢病毒后HSC内脂质组成无明显变化;（6）过表达ACSL1后游离脂肪酸（free fat acid,FFA）和TG相对于对照组含量有不同程度的增加（仅有例外是FFA中含量较高的脂质之一花生四烯酸<arachidonic acid,AA>的含量有所下降）;通过主成分分析（PCA）,与对照组相比两个转染病毒组的HSC内的脂质谱均发生了较明显改变;经正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）对脂代谢数据进行校正,并用OPLS-DA的S-plot图观测到了对照病毒（CON）组与ACSL1过表达（OE）组差异脂质代谢物的分布情况;（7）经过差异代谢物筛选,发现过表达ACSL1后HSC内TG差异倍数最大,TG可能和HSC的稳态密切相关;（8）ACSL1过表达后不饱和度为0时（即为饱和脂肪酸）脂质含量最高,且不饱和度较小的脂质含量增加,可能使HSC内脂质更加稳定;过表达ACSL1后,HSC内的脂质过氧化水平受到抑制,进一步提示ACSL1抑制纤维化的发生发展可能是和HSC内脂质过氧化含量有关;（9）在HSC内大豆磷脂酰胆碱（soy phosphatidylcholine,SPC）可抑制肝纤维化相关指标α-SMA的表达并影响了Col1a1的含量;而AA可促进肝纤维化相关指标Col1a1、Ⅲ型胶原（typeⅢcollagen alpha1,Col3a1）的表达;（10）NF-κB p65可与ACSL1启动子区域直接结合;（11）TGF-β1通路对ACSL1有一定的抑制作用并对NF-κB p65具有促进作用;（12）在HSC内NF-κB p65可抑制ACSL1蛋白的表达、NF-κB通路可促进肝纤维化的发生发展。结论:（1）临床肝组织样本检测及体外细胞实验发现:ACSL1具有抑制HSC增殖/抑肝纤维化的功能;（2）ACSL1可通过影响HSC内脂质代谢变化影响肝纤维化的进程;（3）在HSC内NF-κB通路可抑制ACSL1表达、促进肝纤维化发生发展,这一途径可能受TGF-β1调控。
安至超[9]（2021）在《基于肝肾同源探讨芪地糖肾方干预DN小鼠纤维化及胆汁酸的研究》文中研究指明研究背景和目的糖尿病肾脏病是临床上常见的疾病之一,给社会造成了沉重的经济负担。肾脏纤维化是糖尿病肾脏病重要的病理表现之一。既往的研究认为,胆汁酸与糖脂代谢之间存在着密切的关系,但是在近几年的研究中,学者发现肾脏中也存在着丰富的胆汁酸受体,有证据显示胆汁酸通路与纤维化之间存在着一定的联系。肝肾同源是重要的中医学概念,对于糖尿病肾脏病的治疗具有重要的指导意义。“胆汁酸——肾脏纤维化”通路与中医肝肾同源之间到底有什么样的关系,现在还不甚清楚。本研究的目的是通过分析胆汁酸和肾脏纤维化指标的水平与肝肾同源相关证素之间的相关性,进而阐释肝肾同源的物质基础,以丰富肝肾同源的科学内涵。蛋白尿是糖尿病肾脏病重要的临床表现之一,前期研究认为芪地糖肾方能够降低糖尿病肾病大鼠模型的蛋白尿水平但是具体机制仍有待进一步研究。芪地糖肾方是否通过胆汁酸途径降低糖尿病肾病的肾脏纤维化状态和糖尿病肾脏病蛋白尿的问题未见报道。本研究拟通过芪地糖肾方干预db/db糖尿病肾脏病小鼠模型,揭示了该组方治疗糖尿病肾病蛋白尿的作用机制。研究方法临床部分通过收集北京中医药大学东直门医院门诊和住院患者以及附近社区体检中的糖尿病肾脏病和糖尿病患者83例,收集患者的一般基础资料和尿液、血清标本,根据本团队的中医证素量表对收集的患者进行相关症状采集和评分,根据尿微量白蛋白/尿肌酐（ACR）值将入组患者分为单纯糖尿病（DM）组和糖尿病肾脏病（DKD）组,用Elisa方法检测上述患者的尿液胆汁酸、P-ⅢCOL、Ⅳ-COL、LN、HA和血清中TGF-β 1。分别比较DM组和DKD组患者肝虚证和肾虚证相关证素和胆汁酸、P-ⅢCOL、Ⅳ-COL、LN、HA和血清中TGF-β 1表达水平的差异;探讨胆汁酸、P-ⅢCOL、Ⅳ-COL、LN、HA和TGF-β1的表达水平与患者肝虚证和肾虚证相关证素和症状的相关性。实验部分通过饲养8周龄肥胖自发性2型糖尿病db/db雄性小鼠（SPF级）以制备糖尿病肾病模型,同时购买30只8周龄的C57BL/6J雄性小鼠做为对照组。将14周龄的小鼠进行分组,按随机分组法分为正常组20只、造模组45只。其中正常鼠分为正常组和正常给药组,造模组分为模型组、西药组、中药组,各组用生理盐水配制具体药物药灌胃,每天1次,灌胃液体积相等,具体药量依据前期研究有效剂量。给药期间所有小鼠每2周称重,每2周尾尖采血测血糖,每4周放入代谢笼中收集8小时尿液。于给药后的第12周末取材,检测各组小鼠血肌酐、甘油三酯、胆固醇、谷丙转氨酶、谷草转氨酶。HE和Masson染色光镜观察肾脏结构和纤维化染色改变,电镜观察肾脏超微病理结构表现,免疫组化观察肾脏纤维化指标变化,采用超高效液相色谱-串联质谱检测小鼠血清胆汁酸谱,分析胆汁酸谱与肾脏纤维化的相关性。在此基础之上,通过Western-Blot方法检测小鼠肾组织FXR表达,初步探究胆汁酸调节肾脏纤维化的机制。结果临床部分与糖尿病组相比,糖尿病肾脏病组ALT、AST、尿素氮、eGFR、肌酐、总胆固醇值比较有统计学意义（P<0.05）,其余指标比较无统计学差异（P>0.05）。与糖尿病组比较,糖尿病肾脏病组肝纤维化四项、胆汁酸和TGF-β 1比较无统计学差异（P>0.05）。与糖尿病组相比,糖尿病肾脏病组患者肝血虚评分明显升高,有统计学意义（P<0.05）,其它证候评分未见明显统计学意义。糖尿病肾脏病患者胆汁酸、TGF-β 1、P-ⅢCOL、Ⅳ-COL、LN、HA分别与肝虚、肾虚、肝血虚、肝阴虚、肾阴虚、肾阳虚、肾精亏虚和肝肾亏虚评分及相关症状进行相关分析,结果发现胆汁酸与肝血虚评分呈正相关,差异具有统计学意义;HA与肾精亏虚评分以及肝肾亏虚评分呈正相关,差异具有统计学意义,胶原3与肾精亏虚评分和肝肾亏虚评分呈现正相关,有统计学意义,LN与视物昏花评分呈现负相关（P<0.05）,TGF-β 1与视物昏花评分呈现正相关（P<0.05）,胆汁酸与视物昏花评分呈现负相关（P<0.05）,LN与腰膝冷痛评分呈现负相关（P<0.05）,HA与耳轮干枯萎缩评分呈正相关（P<0.05）,HA与小便短赤、腰膝冷痛评分呈负相关（P<0.05）,胆汁酸与精神萎靡评分呈现正相关（P<0.05）。实验部分与正常组相比,正常给药组生化指标之间变化无差异（P>0.05）,西药组谷草转氨酶下降有统计学意义（P<0.05）。与模型组相比,西药组谷草转氨酶下降有统计学意义（P<0.05）,中药组谷丙转氨酶下降有统计学意义（P<0.05）。与正常组相比,正常给药组血糖和体重变化无差异（P>0.05）,模型组、西药组和中药组变化均有统计学差异（P<0.05）。与模型组相比,西药组和中药组血糖和体重变化均无统计学差异（P>0.05）。与正常组相比,灌胃前模型组、西药组和中药组尿微量白蛋白水平均升高,之后三次也升高,差异有统计学差异（P<0.05）。与模型组相比,灌胃前西药组和中药组无差异,灌胃后三次检测均有降低,差异有统计学差异（P<0.05）。与正常组相比,模型组TGF-β 1、Smad2、Smad3和α-SMA水平变化有统计学差异（P<0.05）,与模型组相比,西药组和中药组TGF-β 1、Smad2、Smad3和α-SMA水平变化有统计学差异（P<0.05）。Masson染色显示,与正常组相比,其间质纤维化增生改变更为明显,而对于西药组和中药组来说,肾小球系膜基质增生并不明显,肾小球基底膜也未见明显增厚,尤其是肾间质纤维蛋白沉积与模型组相比有明显好转。在胆汁酸成分分析中发现,与正常组相比,模型组TCA、Tβ-MCA水平升高,差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组相比,中药组β-MCA、T β-MCA和TCA水平降低,差异有统计学意义（P<0.05）。其余指标变化无统计学差异。WB方法检测肾脏FXR水平发现,各组水平变化之间无明显统计学差异。各胆汁酸成分与纤维化因子的相关性分析显示,TBAs、CDCA、α-MCA、TCDCA、Tβ-MCA 与 Smad3 呈正相关,T β-MCA 与 TGF-β 1呈正相关,T β-MCA和TCA与Smad2呈正相关。结论对于糖尿病肾脏病患者而言,胆汁酸和纤维化因子与肝虚证和肾虚证之间存在着相关性,丰富了肝肾同源理论的科学内涵。芪地糖肾方可以调节胆汁酸的分泌,进而改善肾脏的纤维化,也可以降低糖尿病肾病蛋白尿。
毛李翠[10]（2021）在《转染HGF的人脐带间充质干细胞对大鼠肝纤维化NF-κB信号通路的影响》文中认为目的:本研究旨在将转染HGF的hUCMSCs经尾静脉移植到CCl4诱导的肝纤维化大鼠体内,研究其对大鼠肝纤维化及NF-κB信号通路的影响,探讨其抑制肝纤维化的作用机制,为抗肝纤维化的治疗带来新的思路。方法:hUCMSCs通过组织块贴壁法获得,转染HGF和LV5-NC的hUCMSCs为实验室留存。采用腹腔注射CCl4联合高脂饮食8w法建立大鼠肝纤维化模型。期间观察大鼠饮食、活动等情况并记录体重等指标,造模结束后检测大鼠血清生化指标AST、ALT、ALP、ALB和肝脏病理变化以验证模型是否成功。建模成功的大鼠随机分为CCl4组、hUCMSC组、LV5-NC组和HGF组,并进行尾静脉移植。每只鼠移植细胞量为1×106/0.5ml,1次/w,共4w。移植结束后,用血清自动生化分析仪检测大鼠血清中PⅢNP和HA的含量,ELISA法检测大鼠肝脏和血清中IL-1和TNF-α的表达;通过HE、Masson染色检测大鼠肝脏病理变化;运用IHC检测大鼠肝脏中α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ和p65的阳性表达;Wb检测大鼠肝脏中α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ、p65、IκBα和p-IκBα的蛋白表达;RT-q PCR检测大鼠肝脏中CollagenⅠ、CollagenⅢ和p65的m RNA表达。结果:1、通过组织块贴壁法获得了hUCMSCs。与hUCMSC相比,转染HGF和LV5-NC的hUCMSCs形态无明显变化。2、腹腔注射CCl4联合高脂饮食8w后,与对照组相比,模型组大鼠血清中AST、ALT和ALP水平显着升高（P<0.05）,而ALB水平显着下降（P<0.01）。肝脏HE、Masson染色结果显示:对照组肝小叶结构完整,肝细胞形态正常,以中央静脉为中心呈放射状排列,肝血窦结构正常,汇管区未见炎症细胞浸润,仅可见少量胶原纤维;模型组肝小叶结构被破坏,肝细胞排列紊乱,出现脂肪变性和炎细胞浸润、胶原纤维明显增生,甚至形成假小叶。结果表明本实验成功构建大鼠肝纤维化模型。3、细胞移植后,与CCl4组相比,hUCMSC、LV5-NC和HGF组血清中PⅢNP和HA均显着下降（P<0.05）;与hUCMSC和LV5-NC组相比,HGF组明显下降（P<0.05）;hUCMSC组与LV5-NC组无明显差异（P>0.05）。ELISA结果显示,hUCMSC、LV5-NC及HGF组肝脏和血清中IL-1、TNF-α水平与CCl4组相比,均明显下降（P<0.05）;HGF组与hUCMSC、LV5-NC组相比,也显着降低（P<0.01）;hUCMSC组与LV5-NC组无明显差异（P>0.05）。HE、Masson染色结果显示,与CCl4组相比,hUCMSC、LV5-NC和HGF组肝细胞坏死与脂肪变性明显减少,炎细胞浸润和纤维化程度明显减轻;与hUCMSC和LV5-NC组相比,HGF组纤维化程度明显减轻;hUCMSC组与LV5-NC组无明显差异（P>0.05）。IHC结果显示,hUCMSC、LV5-NC和HGF组α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ和p65的阳性表达与CCl4组相比,均明显下降（P<0.05）;HGF组与hUCMSC、LV5-NC组相比,也显着下降（P<0.05）;hUCMSC组与LV5-NC组无明显差异（P>0.05）。Wb结果表明,与CCl4组相比,hUCMSC、LV5-NC和HGF组α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ、p65和p-IκBα的蛋白表达显着下降（P<0.05）,而IκBα蛋白表达显着升高（P<0.05）;与hUCMSC和LV5-NC组相比,HGF组除IκBα蛋白表达水平明显升高（P<0.05）外,其余指标均明显下降（P<0.05）;hUCMSC组与LV5-NC组无明显差异（P>0.05）。RT-q PCR结果显示,hUCMSC、LV5-NC和HGF组CollagenⅠ、CollagenⅢ和p65的m RNA表达与CCl4组相比,均显着下降（P<0.05）;HGF组与hUCMSC、LV5-NC组相比也明显下降（P<0.05）;而hUCMSC组与LV5-NC组无明显差异（P>0.05）。结论:转染HGF的hUCMSCs能够抑制肝纤维化时HSCs的活化,减少胶原沉积,减轻炎症反应,进而减轻大鼠肝纤维化,其作用机制可能与抑制NF-κB信号通路激活相关。
二、肝纤维化形成机制的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肝纤维化形成机制的研究进展（论文提纲范文）
（1）Gremlin1、VEGFR2、CD31及vWF在CCL4小鼠肝纤维化组织中表达相关性的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 Gremlin促血管生成作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）芪术颗粒治疗早期肝硬化临床疗效观察及其抗肝纤维化血管新生的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 肝纤维化/肝硬化诊断技术研究进展 |
| 1. 肝穿活检病理学 |
| 2. 影像学检查 |
| 3. 血清学 |
| 4. 肝静脉压力梯度 |
| 5. 展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 肝窦毛细血管化与肝纤维化研究进展 |
| 1. 肝脏的结构 |
| 2. 肝窦内皮的结构与功能 |
| 3. 肝窦内皮毛细血管化与肝纤维化 |
| 4. 肝窦内皮毛细血管化的调控机制 |
| 5. 肝窦内皮毛细血管化治疗 |
| 6. 展望 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 芪术颗粒治疗早期肝硬化临床疗效观察 |
| 1. 资料与方法 |
| 2. 统计方法 |
| 3. 试验结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 芪术颗粒对肝窦内皮细胞毛细血管化的影响及其机制研究 |
| 实验一 芪术颗粒对大鼠肝纤维化的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 统计方法 |
| 4. 实验结果 |
| 5. 讨论 |
| 实验二 芪术颗粒对肝纤维化过程中血管新生的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 统计方法 |
| 4. 实验结果 |
| 5. 讨论 |
| 实验三 芪术颗粒对肝窦内皮细胞毛细血管化的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 统计方法 |
| 4. 实验结果 |
| 5. 讨论 |
| 实验四 芪术颗粒对肝纤维化大鼠肝窦内皮细胞整合素αVβ3-FAK-Ras/MAPK信号通路的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 统计方法 |
| 4. 实验结果 |
| 5. 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 创新性 |
| 不足 |
| 展望 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附件 |
（3）活血软坚扶正方干预乙肝后肝纤维化的临床疗效研究及机制探索（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语 |
| 文献综述 TGF-β1相关通路在乙肝后肝纤维化方面研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一章 网络药理学研究 |
| 第一节 资料与方法 |
| 1 活血软坚扶正方活性化学成分与作用靶点的获取和筛选 |
| 2 乙肝后肝纤维化相关作用靶点的筛选 |
| 3 药物-活性成分-疾病相关靶点网络的构建 |
| 4 蛋白相互作用网络的构建与核心靶标筛选 |
| 5 生物过程与信号通路富集分析 |
| 第二节 活血软坚扶正方网络药理学研究结果 |
| 1 活血软坚扶正方活性成分的筛选 |
| 2 疾病相关靶点预测 |
| 3 药物-活性成分-疾病相关靶点网络构建 |
| 4 蛋白相互作用网络的构建与核心靶标筛选 |
| 5 GO基因功能富集分析 |
| 6 KEGG通路富集分析 |
| 第三节 小结与讨论 |
| 1 活血软坚扶正方有效活性成分讨论 |
| 2 活血软坚扶正方抗乙肝后肝纤维化相关靶标蛋白讨论 |
| 3 活血软坚扶正方抗乙肝后肝纤维化相关信号通路讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 临床研究 |
| 第一节 资料与方法 |
| 1 一般资料 |
| 2 诊断标准 |
| 3 纳入标准 |
| 4 排除标准 |
| 5 退出标准 |
| 6 剔除标准 |
| 7 中止标准 |
| 8 治疗方法 |
| 9 观察指标 |
| 10 统计学方法 |
| 第二节 研究结果 |
| 1 基线情况 |
| 2 疗效比较 |
| 3 安全性指标检测 |
| 4 脱落病例分析 |
| 第三节 小结与讨论 |
| 1 讨论 |
| 2 小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间主要研究成果 |
（4）柴芪益肝方治疗肝纤维化的临床和实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 中西医治疗肝纤维化的研究进展 |
| 第一节 西医诊断和治疗肝纤维化的研究进展 |
| 第二节 中医药治疗肝纤维化的研究进展 |
| 第二章 柴芪益肝方治疗肝郁脾虚型慢性乙型肝炎肝纤维化的临床回顾性研究 |
| 前言 |
| 第一节 临床资料 |
| 第二节 分组与治疗 |
| 第三节 结果分析 |
| 第四节 讨论与小结 |
| 第三章 基于网络药理学探讨柴芪益肝方治疗肝纤维化的作用机制 |
| 前言 |
| 第一节 资料与方法 |
| 第二节 结果 |
| 第三节 讨论与小结 |
| 第四章 柴芪益肝方对四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 第一节 材料与研究方法 |
| 第二节 指标检测 |
| 第三节 结果 |
| 第四节 讨论与小结 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（5）基于核受体探讨人参皂苷25-OCH3-PPD和M4调控肝纤维化的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词语注释表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 肝纤维化的形成 |
| 1.2 肝纤维化的诱因 |
| 1.2.1 酒精性肝损伤 |
| 1.2.2 非酒精性脂肪性肝损伤 |
| 1.2.3 病毒性肝炎 |
| 1.3 多种病理机制参与肝纤维化进程 |
| 1.3.1 肝内巨噬细胞活化影响肝纤维化进程 |
| 1.3.2 氧化应激加速肝纤维化进程 |
| 1.3.3 肝脏炎症加速肝纤维化进程 |
| 1.4 调控肝纤维化的信号转导途径 |
| 1.4.1 FXR在肝纤维化进程中的作用 |
| 1.4.2 LXRs在肝纤维化进程中的作用 |
| 1.4.3 TGF-β信号通路在肝纤维化进程中的作用 |
| 1.4.4 P2X7r-NLRP3信号通路在肝纤维化进程中的作用 |
| 1.4.5 PI3K-Akt信号通路在肝纤维化进程中的作用 |
| 1.5 .肝纤维化治疗药物研究 |
| 1.5.1 中药治疗肝纤维化 |
| 1.5.2 西药治疗肝纤维化 |
| 1.6 人参的肝保护作用 |
| 1.7 本课题研究思路 |
| 第二章 人参皂苷25-OCH_3-PPD促进LXRs的活性改善P2X7r介导的NLRP3炎症小体在肝纤维化进程中的作用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 动物给药方案 |
| 2.2.4 细胞培养与药物处理 |
| 2.2.5 血清生化分析 |
| 2.2.6 组织石蜡包埋 |
| 2.2.7 H&E染色 |
| 2.2.8 Masson三色胶原染色 |
| 2.2.9 Sirius Red染色 |
| 2.2.10 免疫荧光染色 |
| 2.2.11 免疫组织化学染色 |
| 2.2.12 TUNEL检测 |
| 2.2.13 蛋白印迹实验 |
| 2.2.14 RT-PCR实验分析 |
| 2.2.15 统计学处理 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 25-OCH_3-PPD改善TAA诱导的肝损伤 |
| 2.3.2 25-OCH_3-PPD减弱与肝星状细胞激活相关的促纤维化细胞因子的转录 |
| 2.3.3 25-OCH_3-PPD可降低肝组织中炎症因子水平 |
| 2.3.4 25-OCH_3-PPD抑制P2X7r调节NLRP3炎症小体 |
| 2.3.5 25-OCH_3-PPD调节PI3K/Akt磷酸化改善TAA诱导的肝纤维化 |
| 2.3.6 25-OCH_3-PPD调节LKB1/AMPK-SIRT1信号通路改善TAA诱导的肝纤维化 |
| 2.3.7 25-OCH_3-PPD促进LXRs和FXR活性改善TAA诱导的肝纤维化 |
| 2.3.8 25-OCH_3-PPD阻断TAA诱导的小鼠肝细胞凋亡 |
| 2.3.9 25-OCH_3-PPD通过调节P2X7r-NLRP3抑制肝星状细胞的活化 |
| 2.3.10 25-OCH_3-PPD调节活化的肝星状细胞中LXRs与磷酸化PI3K/Akt的表达 |
| 2.3.11 抑制活化的HSCs中炎症因子表达是25-OCH_3-PPD改善肝纤维的关键 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 20S-原人参三醇通过调FXR-P2X7r信号通路改善肝纤维化进程的研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 动物给药方案 |
| 3.2.4 细胞存活率 |
| 3.2.5 细胞培养与药物处理 |
| 3.2.6 血清生化分析 |
| 3.2.7 组织石蜡包埋 |
| 3.2.8 H&E染色 |
| 3.2.9 免疫荧光染色 |
| 3.2.10 蛋白印迹实验 |
| 3.2.11 RT-PCR实验分析 |
| 3.2.12 统计学处理 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 M4能够抑制肝星状细胞的活性与增殖 |
| 3.3.2 M4调节活化HSC中ECM的平衡 |
| 3.3.3 M4增加活化的HSC中FXR的表达并与P2X7r抑制有关 |
| 3.3.4 M4抑制活化的HSC中促炎细胞因子的表达 |
| 3.3.5 FXR是M4阻断P2X7r进一步改善肝纤维化和炎症的重要靶点 |
| 3.3.6 M4改善TAA诱导小鼠肝损伤 |
| 3.3.7 M4对TAA诱导小鼠肝纤维化的改善作用 |
| 3.3.8 M4通过FXR/P2X7r信号通路改善TAA诱导的肝纤维化 |
| 3.3.9 M4降低TAA诱导的小鼠肝纤维化肝脏中促炎细胞因子水平 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 1 发表论文目录 |
| 致谢 |
（6）滇产铁皮石斛对CCl4诱导大鼠肝纤维化的保护作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词中英对照表 |
| 前言 |
| 实验技术路线 |
| 第一章 不同剂型铁皮石斛对CCl_4诱导肝纤维化大鼠的影响 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 药物与试剂 |
| 1.1.3 主要仪器及器械 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 分组与模型制备 |
| 1.2.2 大鼠死亡率 |
| 1.2.3 标本采集和留取 |
| 1.2.4 指标检测 |
| 1.2.5 统计学处理 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 大鼠肝纤维化模型建立的分析 |
| 1.3.2 两种剂型药物干扰后肝脏指数的变化 |
| 1.3.3 肝组织形态学变化 |
| 1.3.4 TGF-β1表达水平 |
| 1.3.5 大鼠肝功能和肝纤维指标的变化 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 CCl_4诱导的肝纤维化模型可成功复制 |
| 1.4.2 铁皮石斛干预SD大鼠肝纤维化的疗效分析 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 铁皮石斛多糖对活化肝星状细胞LX2的影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞种类 |
| 2.1.2 药物与试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 细胞实验耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 DCP溶液制备 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 采用细胞划痕实验检测DCP对HSC-LX2迁移率的影响 |
| 2.2.4 采用MTT法检测DCP对HSC-LX2增殖抑制率的影响 |
| 2.2.5 采用流式细胞术检测DCP对HSC-LX2细胞凋亡率的影响 |
| 2.2.6 统计学处理 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 HSC-LX-2一般情况 |
| 2.3.2 DCP对细胞迁徙率的影响 |
| 2.3.3 DCP对HSC-LX2增殖的影响 |
| 2.3.4 DCP对HSC-LX2凋亡率的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 Hedgehog信号通路与肝纤维化研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（7）基于弹性蛋白合成及降解探讨益肝消积方干预早期肝硬化的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 中医药防治肝硬化的研究现状 |
| 1 肝硬化病名渊源 |
| 2 中医对肝硬化病因病机的认识 |
| 3 中医治疗肝硬化思路 |
| 4 导师论治肝硬化的经验 |
| 5 中医药防治肝硬化的机制探讨 |
| 6 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 弹性蛋白及其调控因子在早期肝硬化中的作用 |
| 1 流行病学 |
| 2 肝硬化现代研究进展 |
| 3 弹性蛋白在肝硬化发生中的作用 |
| 4 调控弹性蛋白合成的细胞因子 |
| 5 调控弹性蛋白降解的细胞因子 |
| 6 小结 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 实验研究 |
| 研究一 益肝消积方对早期肝硬化的干预作用 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 研究二 益肝消积方调控弹性蛋白合成干预早期肝硬化的机制研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 研究三 益肝消积方调控弹性蛋白降解干预早期肝硬化的机制研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简历 |
（8）ACSL1在HSC/肝纤维化中的功能及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分 ACSL1在HSC活化/肝纤维化中的作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第一部分小结 |
| 第二部分 ACSL1 调控HSC的脂代谢而抑制肝纤维化进程 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分小结 |
| 第三部分 NF-κB通过调控ACSL1 的表达影响纤维化进程 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第三部分小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 NF-κB 对肝纤维化调控进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况 |
| 致谢 |
（9）基于肝肾同源探讨芪地糖肾方干预DN小鼠纤维化及胆汁酸的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 糖尿病肾脏病与肝、肾关系的西医研究进展 |
| 1 糖尿病与肝脏的关系 |
| 2 胆汁酸和FXR的研究进展 |
| 3 纤维化与胆汁酸及糖尿病肾病关系的研究 |
| 参考文献 |
| 综述二 糖尿病肾病与肝肾相关中医研究进展 |
| 1 古代文献对“肝”、“肾”相关以及和消渴病肾病关系的论述 |
| 2 现代中医学肝肾相关研究及其在糖尿病肾脏病中的应用 |
| 3 胆汁酸和FXR与中医相关研究进展 |
| 4 纤维化与中医相关研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 临床研究 基于肝肾同源理论探讨糖尿病肾脏病胆汁酸及纤维化因子与中医证素的相关性研究 |
| 1 研究对象 |
| 2 研究方法 |
| 3 研究结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 实验研究 |
| 实验一 芪地糖肾方对db/db糖尿病肾病小鼠模型肾脏纤维化因子的干预研究 |
| 1 实验方案 |
| 2 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 芪地糖肾方对db/db糖尿病肾病小鼠模型胆汁酸通路影响的研究 |
| 1 实验方案 |
| 2 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三 db/db糖尿病肾病小鼠模型胆汁酸成分与纤维化因子相关性的研究 |
| 1 实验方案 |
| 2 实验结果 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 中医证候评定表 |
| 个人简介 |
（10）转染HGF的人脐带间充质干细胞对大鼠肝纤维化NF-κB信号通路的影响（论文提纲范文）
| 前言 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第1章 文献综述 间充质干细胞缓解肝纤维化的研究进展 |
| 1.1 肝纤维化 |
| 1.1.1 HSCs的激活 |
| 1.1.2 NF-κB信号通路 |
| 1.2 MSCs的生物学特点 |
| 1.2.1 组织来源 |
| 1.2.2 MSCs的特性和功能 |
| 1.3 MSCs缓解肝纤维化的作用机制 |
| 1.3.1 MSCs的旁分泌作用 |
| 1.3.2 MSCs的免疫调节作用 |
| 1.3.3 MSCs的迁移、归巢和肝细胞样细胞分化作用 |
| 1.4 前景展望 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 主要实验材料、仪器与试剂 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 获得转染HGF的hUCMSCs |
| 2.2.2 制备大鼠肝纤维化模型 |
| 2.2.3 移植转染HGF的hUCMSCs |
| 2.2.4 检测移植转染HGF的hUCMSCs对大鼠肝纤维化的影响 |
| 2.3 统计学方法 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 转染HGF的hUCMSCs形态 |
| 3.1.1 hUCMSCs的分离与传代培养 |
| 3.1.2 转染HGF的hUCMSCs形态 |
| 3.2 大鼠肝纤维化模型检测 |
| 3.2.1 大鼠一般状态观察 |
| 3.2.2 大鼠肝功能检测 |
| 3.2.3 大鼠肝脏病理变化 |
| 3.3 移植转染HGF的hUCMSCs对大鼠肝纤维化的影响 |
| 3.3.1 移植转染HGF的hUCMSCs对血清PⅢNP和HA的影响 |
| 3.3.2 ELISA检测移植转染HGF的hUCMSCs对肝脏和血清IL-1 和TNF-α 的影响 |
| 3.3.3 移植转染HGF的hUCMSCs对肝脏结构的影响 |
| 3.3.4 免疫组织化学检测移植转染HGF的hUCMSCs对肝脏α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和p65的影响 |
| 3.3.5 Western blotting检测移植转染HGF的hUCMSCs对大鼠肝纤维化NF-κB信号通路的影响 |
| 3.3.6 RT-qPCR检测移植转染HGF的hUCMSCs对肝脏Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和p65的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
四、肝纤维化形成机制的研究进展（论文参考文献）
- [1]Gremlin1、VEGFR2、CD31及vWF在CCL4小鼠肝纤维化组织中表达相关性的研究[D]. 谢宇欣. 遵义医科大学, 2021(01)
- [2]芪术颗粒治疗早期肝硬化临床疗效观察及其抗肝纤维化血管新生的机制研究[D]. 张荣. 中国中医科学院, 2021
- [3]活血软坚扶正方干预乙肝后肝纤维化的临床疗效研究及机制探索[D]. 田园硕. 北京中医药大学, 2021(08)
- [4]柴芪益肝方治疗肝纤维化的临床和实验研究[D]. 周怡驰. 北京中医药大学, 2021(01)
- [5]基于核受体探讨人参皂苷25-OCH3-PPD和M4调控肝纤维化的作用机制研究[D]. 宋健. 延边大学, 2021
- [6]滇产铁皮石斛对CCl4诱导大鼠肝纤维化的保护作用[D]. 于亚男. 大理大学, 2021(09)
- [7]基于弹性蛋白合成及降解探讨益肝消积方干预早期肝硬化的机制研究[D]. 张嘉鑫. 北京中医药大学, 2021(01)
- [8]ACSL1在HSC/肝纤维化中的功能及机制研究[D]. 刘佳萱. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [9]基于肝肾同源探讨芪地糖肾方干预DN小鼠纤维化及胆汁酸的研究[D]. 安至超. 北京中医药大学, 2021(01)
- [10]转染HGF的人脐带间充质干细胞对大鼠肝纤维化NF-κB信号通路的影响[D]. 毛李翠. 吉林大学, 2021(01)
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