一、重组人肝增强因子的纯化及鉴定（论文文献综述）
黄文祺[1]（2020）在《15KD-肝再生增强因子单克隆抗体制备及其对骨髓瘤影响的研究》文中研究表明背景:多发性骨髓瘤是常见的血液系统恶性肿瘤,虽然近年对多发性骨髓瘤的治疗取得到较大的进展,但MM仍然是无法治愈的疾病,大多数患者会出现复发并需要进一步的治疗,而此时的由于药物的不良反应以及耐药问题会使得复发的多发性骨髓瘤疗效不佳,因此需要寻找新的药物和靶点对多发性骨髓瘤进行治疗。单克隆抗体是由B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体,目前已广泛用于疾病的诊断、预防、治疗以及免疫机制的研究。肝再生增增强因子（ALR）,也称为GFER,是参与各种生命过程的重要蛋白质。ALR有两种亚型,分子量分别为23 k D和15 k D,23KDALR主要定位于细胞线粒体,参与氧化磷酸化等能量代谢等,是细胞存活所必须的。15KDALR主要分泌到细胞外,与细胞生长、增殖相关。课题组在前期实验发现骨髓瘤细胞中ALR高表达,对骨髓瘤细胞有保护作用,但是具体机制还不清楚。但是采用过表达或沉默方式从基因层面进行干预会同时影响到23KDALR和15KDALR,无法区分究竟是哪种亚型ALR发挥作用。而且从基因层面上干预还会影响到正常组织中的23KDALR。利用单克隆抗体抗体特异结合细胞外的15KDALR则不会影响到存在于线粒体中的23KDALR,有利于单独研究15KDALR的作用,还减少了对正常组织的影响。因此我们拟通过使用单克隆抗体阻断分泌到细胞外的ALR以研究15KDALR在骨髓瘤中的作用,并探讨相应机制,希望为多发性骨髓瘤的治疗提供新的思路和靶点。方法:课题组前期合成了15KDALR重组蛋白,运用杂交瘤技术制备15KDALR单克隆抗体,应用ELISA和western blot方法对制备的单克隆抗体进行验证。在骨髓瘤细胞系中加入15KDALR单克隆抗体,以阴性杂交瘤腹水和PBS作为对照,采用细胞计数、CCK8方式观察细胞存活率以明确单克隆抗体是否对骨髓瘤细胞有影响,采用流式检测凋亡,western blot检测凋亡相关蛋白,采用edu方式检测细胞增殖情况以明确单克隆抗体是从增殖方面还是凋亡方面影响骨髓瘤细胞。在体内实验方面,建立小鼠皮下移植瘤模型,分为单克隆抗体治疗组,阴性腹水治疗组和PBS组,分别在肿瘤中心后周围皮下注射15KDALR单克隆抗体腹水、阴性腹水和PBS,观察肿瘤的生长速度,治疗结束后观察肿瘤的体积、质量。为了进一步研究15KDALR单克隆抗体对骨髓瘤影响的机制,采用RNA-seq技术分析15KDALR单克隆抗体处理骨髓瘤细胞后与阴性腹水处理骨髓瘤细胞后的基因表达的差异,将差异基因与数据库中已注释功能的基因,可以分别从功能、参与的生物途径及细胞中的定位对差异基因进行简单注释,了解差异基因富集在哪些生物学功能、途径或者细胞定位。通过KEGG数据库功能注释可以寻找差异基因富集的信号通路,寻找15KDALR单克隆抗体影响骨髓瘤细胞的可能机制。在RNA-seq分析的基础上采用RT-PCR、western blot、细胞周期检测方式对RNA-seq的结果进行验证,进一步证实单克隆抗体影响骨髓瘤的机制。结果:在使用15KD重组人肝再生增强因子免疫小鼠后,通过ELISA检测小鼠血清中的抗体效价达到104,经过细胞融合及多次检测,对筛选出的阳性杂交瘤细胞进行有限稀释单克隆培养,最终成功筛选出2株能稳定分泌15KDALR单克隆抗体的杂交瘤细胞,将杂交瘤注射到小鼠腹腔产生含有单克隆抗体的腹水,经ELISA验证腹水中抗体效价106,western blot证实了单克隆抗体能特异结合15KDALR重组蛋白,经单克隆抗体亚型鉴定制备单克隆抗体亚型为Ig M。通过western blot检测发现在3种人多发性骨髓瘤细胞系中U266细胞系的15KDALR的表达量最高,因此选取U266细胞系作为后续实验细胞系。在U266细胞中加入15KDALR单克隆抗体处理,以阴性杂交瘤产生的腹水和PBS作为对照,CCK8结果表明15KDALR单克隆抗体能抑制U266细胞的活性,抑制程度与抗体浓度和作用时间呈正相关,在腹水与培养基比例为1:10,作用时间为72h时,细胞活性将至正常对照的50%,因此选用腹水浓度为1:10,作用时间72h为后续实验条件。在此条件下进行流式凋亡检测,与阴性腹水组和PBS组相比,单克隆抗体腹水组的凋亡率并未明显增加,差异无统计学意义。行western blot检测凋亡相关蛋白,Bax/Bcl-2比例,Caspase3和Cleaved-Caspase3的表达量也无显着差异。但是在使用15KDALR单抗抗体处理的同时加入表阿霉素刺激细胞诱导凋亡后,15KDALR单克隆抗体腹水组的凋亡率较阴性腹水组和PBS组明显升高,差异有统计学意义。使用小鼠骨髓瘤SP2/0细胞建立Balb/c普通鼠皮下移植瘤模型后,用15KDALR单克隆抗体腹水治疗组的肿瘤生长速度与阴性腹水和PBS组相比明显延缓,治疗结束后单克隆抗体腹水治疗组的肿瘤体积和质量也明显小于对照组。运用RNA-Seq技术对15KDALR单克隆抗体腹水治疗组和阴性腹水对照的U266细胞进行转录组测序,通过对差异基因进行分析,共发现289个显着上调和138显着下调的基因。基因富集分析结果显示生物进程方面差异基因主要集中在核有丝分裂、细胞周期、细胞分裂方面。分子功能部分差异基因主要集中在核酸结合、DNA结合方面,细胞定位部分差异基因主要分布在中心体,细胞内。对差异基因表达的蛋白进行了蛋白质-蛋白质相互作用网络分析筛选出的10个hub genes分别是CDK1,SMC3,KIF11,SMC4,NDC80,NCAPG,TTK,CENPE,NUF2和CENPU。这些基因均与细胞周期有关。Pathway分析发现在显着性信号通路中,MAPK通路,Jak-STAT信号通路和cell cycle信号通路在这处于相对核心的地位。运用PCR验证了15KDALR单克隆抗体治疗组、阴性腹水组和PBS组中10个hub genes,结果表明hub genes的变化情况与RNA-Seq分析结果趋势一致,但是TTK和CENPU的变化在不具有统计学差异。Western blot验证了MAPK、Jak-STAT和cell cycle信号通路中的关键蛋白,结果与阴性腹水组和PBS组相比,单克隆抗体腹水治疗组p44/42和p-p44/42的表达下调,p38和p-p38的表达无显着差异。单克隆抗体腹水治疗组JNK表达下调,而p-JNK表达上调STAT3的表达轻微下调,而p-STAT3则显着下调,细胞周期相关蛋白CDK1和cyclin D1表达下调。结果表明ERK1/2、JNK、STAT3和Cell Cycle是15KDALR单克隆抗体影响U266细胞的主要通路。结论:15KDALR单克隆抗体通过阻断分泌到细胞外的ALR能抑制骨髓瘤U266细胞活性,阻断ALR后主要是抑制增殖的作用,而在合并有其他导致细胞损伤因素的情况下,阻断ALR能增加U266细胞的凋亡。15KDALR单克隆抗体能抑制Balb/c普通鼠SP2/0细胞皮下移植瘤的生长。单克隆抗体阻断分泌到细胞外的ALR后,可能是通过ERK1/2,JNK,STAT3和Cell cycle通路发挥作用。
李鹏飞[2]（2017）在《重组肝再生增强因子（rALR）的50L发酵与高效分离纯化研究》文中提出肝再生增强因子（augmenter of liver regeneration,ALR）在肝脏损伤和肝再生过程中发挥着重要的作用,是一种潜在的肝脏疾病靶向药物。目前国内外研究主要针对其作用机理进行研究,利用生物工程制备重组ALR（recombinant augmenter of live regeneration,rALR）也停留在实验室规模,尚未大规模应用。本论文选用毕赤酵母为表达宿主,并针对rALR的高效表达、规模放大和纯化等过程中的关键技术进行了研究,并在纯化过程中首次引入双水相萃取技术,最终获得了高表达量、高纯度和高活性的rALR。主要研究内容包括:（1）rALR的高效表达工程菌的构建及筛选:优化ALR基因序列并构建至3种毕赤酵母表达载体（pPIC9、pPIC9K、pPICZα-A）,分别转入3种宿主菌（X-33、GS115和SMD1168）,对得到的7种载体-宿主组合进行鉴定、诱导表达,最终筛选得到rALR的高效表达菌株。结果表明,pPICZα-A/X-33组合的表达量高于pPIC9/GS115、pPIC9K/GS115、pPICZα-A/GS115组合,显着高于pPIC9/SMD1168、pPIC9K/SMD1168、pPICZα-A/SMD1168组合。（2）rALR的表达条件优化和规模放大:本研究对表达过程中的关键因素进行了优化和规模放大,包括pH、诱导温度、甲醇浓度、溶氧条件等,结果表明rALR在pH=5.5,诱导温度26℃,诱导甲醇浓度0.25%,溶氧20%的最佳条件下时,诱导6d的表达量达到最高,且发酵规模成功放大至50L中试规模。（3）rALR的分离纯化条件优化及纯化体系放大:以rALR 50L规模的发酵液为研究对象,进行分离纯化条件摸索。结果表明,双水相萃取技术具有显着的纯化效果,经双水相偶联离子交换层析两步纯化,获得了纯度高于95%,收率高于85%的rALR。（4）rALR的生物学活性测定:主要对rALR的体外、体内生物学活性进行测定。首先测定了rALR的巯基氧化酶酶活性,同时用MTT法测定rALR对HepG2细胞的活性影响,结果表明rALR具有较好的酶学活性,并能够促进肝癌细胞系HepG2的增殖;其次利用CCl4急性肝衰竭模型对rALR的作用进行测定,结果发现,rALR对于肝损伤具有明显的促进和修复作用,说明rALR具有良好的生物学活性。结论:本文建立了rALR的中试规模高效表达及纯化生产工艺。其中,rALR在50L规模下表达量达到545mg/L,较现有水平[1]（424mg/L）提高了28.5%,建立了相应规模的纯化工艺,获得了纯度大于95%,收率高于85%且具有良好的生物学活性的rALR。为阐明ALR的作用机制、临床研究以及产业化奠定了良好的基础。
颜如玉[3]（2015）在《1.23KD rhALR表达、纯化、单克隆抗体制备及功能初步探索 2.rhALR对人肾小管上皮细胞缺氧复氧炎症反应干预及机制研究》文中研究说明背景与目的肝再生增强因子（Augmenter of liver regeneration, ALR）是一种广泛存在于真核细胞的生长因子,不仅表达于肝脏,在肾脏也有表达。ALR含有两个亚型,分子量为15KD和23KD,分别存在于细胞浆和线粒体中。两种亚型含有共同的终止密码,不同的起始密码。23KD ALR存在于线粒体,参与细胞的能量代谢。目前对于ALR的生物学研究大多集中在15KD亚型上,但是对于23KD ALR的功能研究很少。本课题组前期研究发现15KD ALR在大鼠急性肾损伤后6h在髓质肾小管区开始升高,72h恢复正常水平；体外能够抑制肾小管上皮细胞凋亡及促进其增殖,提示15KD ALR在维持正常肾小管功能上发挥重要作用。由于急性肾损伤发生早期,常伴有线粒体功能紊乱,而且23KDALR与15KD ALR在序列上具有极高的相似性,因此我们推测23KDALR与15KD ALR是否存在同样抗凋亡、促增殖的作用。本研究中,我们拟通过生物工程学技术,构建、表达23KD rhALR,并制备单克隆抗体。为研究23KD ALR生物学功能提供实验基础,并初步比较与15KD ALR生物学功能差异。方法1.构建重组质粒pET28a-hALR:选取带有6-His标签的原核表达质粒pET28a,提取HepG2细胞总RNA,逆转录为cDNA,应用PCR方法,按照设计的引物扩增出含有BamH I/XhoI酶切位点的目的基因片段。通过双酶切目的片段和载体,在T4连接酶的作用下进行目的基因片段与载体连接。构建的重组质粒经过PCR、双酶切及基因测序方法鉴定。2.重组蛋白表达：选取最适时间点和最适IPTG浓度,诱导大肠杆菌BL21表达23KDrhALR蛋白,通过亲和层析技术获得纯化的目的蛋白。并对表达的蛋白进行Western blot检测。收集纯化的蛋白,将蛋白置于透析袋中,4℃进行透析。3.选取雌性Balb/c小鼠作为免疫动物。通过动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞筛选,获取能产生高滴度单抗的细胞株。将该细胞株注射入经降植烷预处理的小鼠腹腔,收集腹水得到相应单克隆抗体。应用ELISA、Western blot、快速定性试纸检测方法检测抗体的效价及Ig亚型。4.比较15KD 和 23KD rhALR对肝癌细胞增殖作用的影响。并在课题组前期研究的基础上,采用顺铂诱导HepG2凋亡,给予15KD和23KD rhALR后,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。5.收集正常人和AKI患者的血液和尿液,应用间接ELISA方法检测其中23KD ALR的含量。结果1.成功构建pET28a-hALR重组质粒。将pET28a和pET28a-hALR同时进行PCR和双酶切鉴定。结果空质粒经PCR扩增和双酶切后未见目的条带,而重组质粒均有与预期大小相符的目的条带。重组质粒基因测序结果与pubme d数据库进行Blast比对,未发现目的片段基因有碱基缺失、插入和移位等改变。2.将重组质粒转化入BL21大肠杆菌中,以不同浓度IPTG和不同时间点诱导表达,用SDS-PAGE和Western blot检测蛋白表达情况。结果显示在IPTG浓度为0.6mM,诱导时间为5h时重组蛋白产量最高。3.收集诱导表达5h菌体,重悬于含溶菌酶的Binding buffer中,进行超声碎菌。收集上清进行亲和层析纯化目的蛋白。收集最后洗脱液,进行透析复性。4.通过免疫动物,获得致敏小鼠脾细胞,与预先用8-AG筛选好的Sp2/0细胞进行细胞融合获得杂交瘤细胞。杂交瘤细胞经过HAT、HT培养基筛选及有限稀释法培养后,获得特异性、稳定性杂交瘤细胞株2C11。将该细胞株注射入经降植烷预处理小鼠腹腔内,小鼠产生腹水。腹水效价为10-5；抗体亚类重链为IgG1,轻链kappa链。间接ELISA和Western blot结果显示2C11分泌的单抗特异性良好。5.15KD rhALR能够促进肝癌细胞增殖,而23KD rhALR对肝癌细胞增殖无影响；15KD rhALR能够抑制顺铂引起的HepG2细胞凋亡,23KD rhALR对凋亡无影响。6.采用间接ELISA法检测正常人和AKI患者血液以及尿液,结果均为阴性。结论1.成功构建了23KD hALR原核表达质粒pET28a-hALR。2.成功诱导23KD rhALR表达,并通过亲和层析技术获得纯化的目的蛋白,为抗体制备提供了基础。3.通过单克隆抗体制备技术,获得稳定分泌23KD rhALR单克隆抗体细胞株2C11一株,为研究23KD ALR生物学功能提供了实验基础。4.外源性23KD rhALR不能促进肝癌细胞增殖,同时也不能抑制顺铂诱导的肝癌细胞凋亡。提示15KD ALR和23KD ALR存在功能差异；5.采用间接ELISA法检测正常人和急性肾损伤患者体液中23KDALR表达情况,均为阴性结果。背景与目的急性肾损伤是一种高发病率、高致死率的综合征。临床上多种因素均可引起急性肾损伤,包括感染、肾毒性药物、手术、失血等。虽然避免发病原因,可以较大程度上避免疾病的发生,但是目前对于急性肾损伤仍然缺乏相应的治疗手段,一旦疾病发生常常会导致无法换回的结果。肾脏缺血再灌注损伤是急性肾损伤最常见的原因之一,实验已经证实,肾脏发生缺血再灌注后,肾小管上皮细胞出现明显的凋亡、坏死；肾实质常伴有炎症细胞的明显浸润；实验动物在肾脏发生缺血再灌注损伤后往往也处于炎症反应状态。、因此缺血再灌注损伤中,炎症反应是疾病发生发展的中心环节。丝裂原活化蛋白激酶信号通路参与多种细胞生理、病理反应,也是参与炎症调节的重要信号通路。ERK,p38,JNK是该通路主要调控分子,它们与NF-κB一起组成调节机体炎症平衡的主要途径。肝再生增强因子是一种生长因子。前期研究己发现,15KD肝再生增强因子在缺血再灌注大鼠中表现出肾保护作用；在对体外经缺氧复氧处理后的大鼠肾小管上皮细胞也具有下调NF-κB表达,抑制炎症反应的作用。本研究为进一步探讨15KD ALR对人肾小管上皮细胞缺氧复氧反应及机制,我们拟通过对缺氧复氧模型细胞外源性加入15KD rhALR,并用其抗体阻断以及shRNA内源性干扰的方式观察细胞ALR表达、缺氧复氧后炎症因子的表达及ERK, p38, JNK信号通路和NF-κB核转位的变化情况,深入了解ALR在细胞缺氧复氧导致的炎症反应中的抗炎作用及机制。方法1.人肾小管上皮细胞（HK-2）为研究对象,以shRNA转染HK-2细胞72h作为内源性干扰ALR表达的实验方法。下一步实验将HK-2细胞随机分为A、B两组。A组：正常组,模型组,15KD rhALR处理组,15KD rhALR+15KD ALR抗体组；B组：正常组,模型组,shRNA/control组,shRNA/ALR组。所有细胞在缺氧复氧前,均经过无血清同步化处理24h,同步化后换为完全培养基；在前期研究的基础上,除正常组细胞外的其他细胞均进行缺氧6h,复氧12h处理。2.为研究外源性与内源性ALR的联系,将HK-2细胞分为正常组,15KD rhALR处理组（25μg/ml,50μg/ml）。外源性15KD rhALR处理24h后应用Real-time PCR 和 Western blot观察内源性ALR的变化。3.MTS方法检测转染shRNA后,HK-2细胞增殖率变化情况。4. ELISA和Real time PCR检测TNF-α、IL-6、MCP-1的蛋白和基因表达水平。5. Western blot检测pERK/ERK, pp38/p38, pJNK/JNK, NF-κB p65表达情况。6.激光共聚焦观察NF-κB p65的核转位。结果1. shRNA/ALR干扰HK-2细胞内源性ALR表达,荧光显微镜下观察,可见转染效率大于80%. Real time PCR和Western blot结果显示与正常HK-2细胞比较,shRNA/ALR组ALR基因和蛋白水平明显下调（P<0.05）, shRNA/control组中ALR的表达无显着改变（P>0.05）。2.外源性加入15KD rhALR和shRNA转染后,对HK-2细胞增殖无明显影响。3.与模型组相比,15KD rhALR处理组TNF-α、IL-6、MCP-1蛋白和基因表达水平明显降低（P<0.05）。 与15KD rhALR处理组比较,15KD rhALR+15KD ALR抗体组TNF-α、IL-6、MCP-1蛋白和基因表达水平明显升高（P<0.05）。4.与模型组相比,15KD rhALR处理组ERK,p38,JNK磷酸化水平降低（P<0.05）。与15KD rhALR处理组比较,15KD rhALR+15KD ALR抗体组ERK, p38, JNK磷酸化水平增加（P<0.05）。NF-κB p65细胞核内表达情况,与模型组相比,15KD rhALR处理组细胞核中NF-κB p65表达水平降低（P<0.05）。与15KD rhALR处理组相比,15KD rhALR +15KD ALR抗体组细胞核中NF-κB p65表达水平增加（P<0.05）。5.与shRNA/control组比较,shRNA/ALR 组 TNF-α IL-6、MCP-1蛋白和基因表达水平明显降低（P<0.05）。6.与shRNA/control组比较,shRNA/ALR组ERK, p38, JNK磷酸化水平明显下降（P<0.05）。shRNA/ALR组细胞核中TNF-κB p65表达水平较shRNA/control组明显下降（P<0.05）。应用激光共聚焦方法观察NF-κB p65核转位情况,其结果与Western b lot结果一致。7.与正常组比较,HK-2细胞经过缺氧复氧后,内源性ALR在蛋白和基因水平,表达均增加（P<0.05）。外源性加入15KD rhALR（25μg/ml, 50μg/ml）处理细胞后,其内源性ALR的表达水平呈现随外源性ALR的浓度增加而减少的趋势（P<0.05）。结论1.外源性15KD rhALR可一定程度上降低正常情况培养下HK-2细胞内源性ALR的表达。2.缺氧复氧能够导致HK-2细胞炎症反应；外源性加入15KD rhALR能够减轻炎症因子的产生。外源性15KD rhALR被其抗体阻断后,可部分抵消其抑制炎症的作用。3.外源性15KD rhALR降低MAPKs通路中ERK, p38, JNK的磷酸化,减少NF-KB核转位,从而减少下游炎症因子的产生。4. shRNA/ALR能够显着干扰内源性ALR的表达。干扰内源性ALR可减轻缺氧复氧导致的HK-2细胞炎症反应。5.干扰内源性ALR表达能够抑制MAPKs通路中ERK, p38, JNK的磷酸化, NF-κB核转位减少,减轻HK-2细胞炎症反应。
俞海英[4]（2014）在《人肝再生增强子的克隆、表达及其在肝衰竭患者中表达水平的研究》文中研究说明研究背景在我国,病毒性肝炎尤其是慢性乙型肝炎感染率及发病率高,肝衰竭成为慢性肝病患者的主要死亡原因之一。肝衰竭的发生、发展及预后的差异性与肝细胞的凋亡及再生相关,一系列的复杂因素包括大量肝细胞坏死、凋亡及退化参与其中。肝再生是一个十分复杂的过程,一系列细胞因子包括肝细胞生长因子、表皮生长因子、转移生长因子及胰岛素等。但上述细胞因子均无法解释器官特异性肝细胞再生。人肝再生增强因子（hALR）是最新发现的一种与肝再生密切相关的细胞因子,研究表明hALR是目前已知唯一对肝源性细胞有特异性增殖刺激活性的因子,能显着促进肝细胞再生。在非激活状态下ALR在肝细胞中低水平持续表达,而当肝细胞收到损伤肝再生过程启动时,ALR表达量大大增加并从肝细胞内释放入血。有动物实验发现在肝再生早期外周血ALI泳平即有明显上升且较其它肝再生相关的细胞因子早,血清ALR水平良好反映肝脏ALR表达水平及肝脏再生情况。本研究通过重组克隆制备获得高纯度hALR蛋白及抗hALR单克隆抗体,通过免疫组化、定量PCR及ELISA等方法比较不同类型及不同预后慢性肝病（包括肝衰竭、肝癌、慢性乙型肝炎等）患者肝组织hALR分布、mRNA表达水平及血清hALR表达水平差异,以及同一肝衰竭患者不同疾病发展阶段hALR水平变化,进一步阐明hALR在肝细胞再生中的可能作用机制,探讨hALR在肝衰竭发生、发展及转归中的地位及意义。方法以肝移植正常人供肝总mRNA为模板,以RT-PCR获取全长hALR cDNA,构建合成蛋白标签、蛋白酶切位点及分泌信号肽序列,然后将hALR.蛋白标签、蛋白酶切位点及原核表达用分泌信号肽以一定的连接顺序同时克隆到E.coli表达载体pET28a（+）中,转化E.coli BL21,制备工程菌,摸索诱导表达条件,避免形成大量包涵体,使hALR以分泌蛋白的形式在大肠杆菌中得以高表达,然后利用阴离子交换层析、阳离子交换层析和分子筛等技术,纯化重组hALR,使制备的重组hALR纯度在98%以上。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（Western-Blot）等方法,利用重组蛋白上带有的蛋白标签,鉴定特异性目的蛋白的表达。用相应的蛋白酶切去蛋白重组多肽后获取天然结构hALR蛋白,利用免疫共沉淀和质谱技术,对重组hALR的分子量、等电点等生物学性状进行鉴定。以hALR蛋白为抗原腹腔注射免疫Balb/c小鼠,以Balb/c小鼠腹腔巨噬细胞作为滋养细胞,将小鼠脾细胞与SP2/O细胞混合接种,采用间接ELISA筛选分泌抗hALR抗体的阳性杂交瘤细胞株,将杂家瘤细胞腹腔接种于腹水小鼠,抽取腹水-20。C保存。用hALR蛋白以western-b1ot的方法鉴定与单克隆抗体的特异性结合。以不同细胞因子包被进行间接ELISA检测,排除单克隆抗体的交叉反应。入选临床病例,获得知情同意后用肝穿刺活检的方法获取肝组织,部分接受原位肝移植的肝衰竭患者可获取其肝组织分切成小块,固定后腊块包埋保存,部分冻存于液氮罐。同时在其疾病的第1、3、7、14及21天抽取外周血,离心后将上清分别冻存于-20℃。将hALR蛋白稀释成一系列浓度,与hALR单克隆抗体以Elisa方法制作hALR浓度与吸光值的标准曲线,参照标准曲线,以ELISA的方法检测外周血hALR水平,将腊块包埋的肝组织切片,常规制片后脱蜡,羊血清封闭,一抗为抗hALR抗体,二抗为HRP标记兔抗鼠IgG,DAB显色,苏木素复染,显微镜下观察并拍照,同时设立阴性对照制片,观察hALR在肝组织内分布情况。用real-time PCR的方法检测肝组织内ALRmRNA表达水平,β-actin mRNA水平被用来衡量不同批次nRNA的cDNA合成及逆转录效率。结果获取全长375kb的ALR cDNA并成功克隆于pET-28a （+）,表达、纯化、鉴定hALR蛋白,纯化的ALR质谱法检测ALR分子量24.712KD,等电点为4.63,并成功获取抗hALR单克隆抗体。定量PCR结果显示ALR mRNA在肝癌组织中高表达（10E6.24（1.74×106） copies/μl）,在肝衰竭恶化接受肝移植组低表达（10E3.45（2.82×103） copies/μl）,在正常人肝组织中低表达（10E4.31（2.04×104） copies/μl）. Elisa研究血清ALR表达水平结果显示：血清ALR水平肝衰竭肝功能好转组（1613.5±369.6pmol/ml）显着高于肝衰竭肝功能恶化组（462.3±235.8pmol/ml）.原发性肝癌组（917.9±332.7pmol/ml）、慢性乙型肝炎组（969.2±332.5pmol/ml）及正常人对照组（806.9±240.8pmol/ml）血清AL＆水平接近,差异无统计学意义。结论在肝衰竭患者中,血清ALR水平的高低反映了肝脏再生程度的高低。高的血清ALR水平提示肝脏再生活跃而预后较好。低的血清ALR水平提升肝脏再生差而导致死亡或必须接受肝移植。
陈罡[5]（2009）在《人肝再生增强因子生物活性的研究》文中认为人肝再生增强因子（human augmenter of liver regeneration, hALR）是从人胎肝组织中克隆到的一种新型的促肝细胞增殖因子,除促进肝细胞增殖外,还能保护肝脏,预防肝纤维化。本实验的目的是克隆人肝再生增强因子ALR205基因并研究其对大鼠急性肝损伤的治疗作用。方法利用RT-PCR技术从人肝癌细胞HepG2中扩增ALR205基因编码区,构建真核表达载体pCDNA3.1-ALR205。将重组质粒以200μg/kg剂量尾静脉注射给CCL4致急性肝损伤大鼠,检测血清AST、ALT水平,肝组织病理学变化、肝组织增殖细胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen PCNA）并对照pCDNA3.1-ALR125基因治疗来观察ALR205基因对急性肝损伤的疗效。结合RT-PCR检测肝组织ALR205 mRNA表达情况。结果克隆出ALR205基因,测序结果与文献报道一致。两种重组质粒用于急性肝损伤大鼠后,血清酶学检查结果表明外周血AST（谷草转氨酶）、ALT（谷丙转氨酶）水平显着降低（P<0.01）,肝组织病理损害情况大幅度减轻,治疗组肝PCNA指数均明显高于其它组（P<0.01）且ALR205比ALR125在促肝细胞增殖方面有明显差异（P<0.05）,只有ALR205基因治疗组检测出阳性条带。结论。ALR205重组质粒体内表达产物通过促进肝细胞增殖,降低血清AST、ALT水平发挥抗急性肝损伤作用。
陈俊杰,孔祥平,佟明华,李茹冰,杨联萍,游松[6]（2007）在《人肝再生增强因子在毕赤酵母中的表达、纯化和生物学活性的研究》文中研究表明肝再生增强因子（ALR）是一类胞源性肝细胞生长因子。为在毕赤酵母中分泌表达人肝再生增强因子（rhALR）,以色谱法分离纯化后进行体外活性研究,构建表达载体pPICZαA-ALR,经电穿孔转入毕赤酵母中,用0.5%甲醇诱导表达;重组酵母培养上清经SDS-PAGE电泳和western blot鉴定后表明,rhALR以分子量为30kDa的二聚体为主;定量分析结果表明,重组酵母培养上清中rhALR约占总蛋白的66%,表达量约为40mg/L;经DEAE柱和G75柱纯化后,获得的rhALR纯度大于95%,得率为52%;体外生物学活性实验表明,rhALR能明显促进HepG2、SMMC-7721和NIH-3T3细胞的增殖。
陈俊杰[7]（2007）在《重组人肝再生增强因子的表达和活性研究》文中研究说明人肝再生增强因子（human augmenter of liver regeneration，hALR）是从人胎肝组织中克隆到的一种新型的促肝细胞增殖因子，除促进肝细胞增殖外，还能保护肝脏，预防肝纤维化。本实验采用毕赤酵母表达系统，以分泌方式高效表达重组hALR（rhALR），通过色谱法分离纯化获得高纯度rhALR，并对rhALR的生物学活性进行了研究。设计引物从pBV220-hALR上扩增hALR基因片断，构建重组酵母表达质粒pPICZαA-hALR；经验证正确后，表达质粒pPICZαA-hALR线形化浓缩，转化P．pastoris GS115形成重组转化子；重组酵母菌经PCR鉴定、高浓度Zeocin抗性筛选得多拷贝子，经0.5％甲醇诱导培养后，在培养上清中发现rhALR；Western-blot分析表明，在酵母培养上清中rhALR以二聚体形式存在，分子量为30kD；扫描分析结果表明，酵母培养上清中rhALR占总蛋白的66％，总量约为100mg／L。酵母培养上清经70％饱和硫酸铵沉淀、Sephadex G25柱脱盐和低盐透析两种方法处理，用Sepharose DEAE Fast Flow柱和Sephadex G75柱两步纯化，可得纯度约为90％的rhALR，回收率约为26％。体外细胞活性实验表明，rhALR能明显促进HepG2、SMMC-7721和NIH-3T3细胞增殖；在大鼠1／3肝切模型中，rhALR明显促进肝细胞再生，使有丝分裂指数（MI）、细胞增殖核抗原（PCNA）增多；在大鼠D-氨基半乳糖急性肝损伤模型中，100μg／L rhALR能提高D-氨基半乳糖所致肝损伤大鼠的存活率。通过上述实验，成功构建了人肝再生增强因子重组毕赤酵母表达菌，并获得高纯度有活性的rhALR。
邓建川[8]（2006）在《人肝再生增强因子相互作用蛋白的研究》文中研究表明目的:肝再生增强因子（augmenter of liver regeneration, ALR）是近年来发现的一种促肝细胞再生的细胞因子。ALR的生物学作用主要表现在直接刺激肝细胞增殖和再生、对肝脏的保护作用、参与组织器官的形成与发育、免疫调控作用以及促肝癌细胞增殖等效应。尽管有上述重要生物学作用,但ALR究竟如何发挥生物学作用目前仍知之较少。如果能获得与ALR发生相互作用的蛋白,并且鉴定出ALR受体,将有助于深刻理解ALR的生物学功能,特别是为深入了解ALR与肝癌发生、发展的关系奠定基础。本实验拟从人肝癌细胞的cDNA噬菌体表面展示文库中筛选与人肝再生增强因子（human augmenter of liver regeneration, hALR）相互作用的特异噬菌体克隆,通过序列分析及生物学活性检测确认hALR相互作用蛋白,构建原核表达载体,为进一步鉴定ALR受体提供实验基础。方法:1.以hALR为靶蛋白,从人肝癌细胞cDNA噬菌体展示文库中筛选与hALR相互作用的特异噬菌体克隆;对获得的特异噬菌体克隆cDNA插入片段进行序列测序及生物信息学分析;利用3H-TdR掺入法测定hALR联合阳性噬菌体展示肽及单独阳性噬菌体展示肽对QGY肝癌细胞株的增殖效应。
王娜[9]（2006）在《肝再生增强因子竞争抑制检测方法的建立及临床初步应用》文中进行了进一步梳理目的:肝再生增强因子（Augmenter of liver regeneration, ALR）是Hagiya等于1994年对肝刺激因子（Hepatic stimulatory substance,HSS）的研究中发现的一种非特异性、具有热稳定性、不同于肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor , HGF）的促肝细胞再生因子。为进一步了解血清中人肝再生增强因子（ Human augmenter of liver regeneration,hALR）的含量,研究hALR与不同程度肝病,尤其是与乙型肝炎不同阶段的关系,依据经典免疫学理论,我们拟建立一种不同于以往双抗体夹心法或间接ELISA方法的、适用于检测hALR这种小分子蛋白质的可靠检测方法。本研究拟采用直接竞争的反应模式来建立hALR的血清检测方法。通过制备hALR的原核表达纯品,用辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase,HRP）及铕元素（Europium,Eu）标记,为竞争抑制检测方法的建立提供抗原;利用抗hALR的单克隆杂交瘤细胞株,制备并扩增小鼠抗hALR的单克隆抗体（Monoclonal antibody,McAb）;进而建立血清hALR直接竞争的检测方法,了解不同肝病患者血清中hALR的含量及意义。方法:1.抗原及标记抗原的制备
郝爱鱼,董爱华,赵广荣,周兴军,宋欣,任乐民,暴娜,高文利,贾茜[10]（2006）在《大肠杆菌分泌表达重组人肝再生增强因子的纯化、鉴定与活性研究》文中研究指明目的建立一种大肠杆菌分泌表达型重组人肝再生增强因子（rhALR）的纯化工艺,并对产品进行鉴定和活性研究。方法通过沉淀、色谱等方法的条件优化,建立纯化工艺,通过电泳、HPLC、N-末端氨基酸测序、免疫杂交、同位素掺入、全波长扫描等方法对纯化产品进行鉴定和活性测定。结果建立了rhALR的纯化工艺路线,40%（NH4）2SO4沉淀,Butyl-S FF疏水色谱,CM-S FF离子交换色谱,Superdex-75分子筛色谱纯化,重组蛋白质的纯度大于95%。该蛋白质稳定存在的形式为二聚体,其单体的相对分子质量为15 000。该蛋白质结合辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）,对损伤后的肝细胞具有明显的促进作用,明显优于以包涵体形式表达的rhALR。结论从大肠杆菌分泌表达体系能分离纯化得到高纯度、具有生物学功能和活性的rhALR,是潜在的临床治疗肝病药物。
二、重组人肝增强因子的纯化及鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、重组人肝增强因子的纯化及鉴定（论文提纲范文）
（1）15KD-肝再生增强因子单克隆抗体制备及其对骨髓瘤影响的研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 15KD肝再生增强因子单克隆抗体制备 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法与步骤 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 15KD肝再生增强因子单克隆抗体对骨髓瘤的影响 |
| 前言 |
| 实验一 15KD肝再生增强因子单克隆抗体对人多发性骨髓瘤细胞的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验方法和步骤 |
| 3 结果 |
| 实验二 15KD肝再生增强因子单克隆抗体对小鼠多发性骨髓瘤的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法和步骤 |
| 3 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 15KD肝再生增强因子单克隆抗体影响骨髓瘤的机制研究 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法和步骤 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述:肝再生增强因子在肿瘤中的作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
（2）重组肝再生增强因子（rALR）的50L发酵与高效分离纯化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 肝再生增强因子（ALR） |
| 1.1.1 ALR的发现 |
| 1.1.2 ALR的分子结构和理化性质 |
| 1.1.3 ALR的生物学功能 |
| 1.1.4 ALR与疾病 |
| 1.2 毕赤酵母表达系统 |
| 1.2.1 毕赤酵母表达系统 |
| 1.2.2 影响外源蛋白的表达因素 |
| 1.3 重组蛋白的分离纯化 |
| 1.4 本文的目的与意义 |
| 1.4.1 目的 |
| 1.4.2 意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验器材 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 实验材料 |
| 2.1.3 常用试剂配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 rALR基因序列的设计、载体构建及鉴定 |
| 2.2.2 转化毕赤酵母X-33、GS115及SMD1168及阳性克隆鉴定 |
| 2.2.3 摇瓶中的最佳表达条件试验 |
| 2.2.4 中试规模诱导表达 |
| 2.2.5 分离纯化条件优化 |
| 2.2.6 ALR的双向电泳（IEF/SDS-PAGE，2D） |
| 2.2.7 ALR的 2D/MS定性： |
| 2.2.8 rALR巯基氧化酶活性检测 |
| 2.2.9 体外活性测定 |
| 2.2.10 体内活性测 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 rALR表达质粒的鉴定结果 |
| 3.2 阳性克隆的筛选、诱导表达及鉴定 |
| 3.3 rALR的摇瓶表达条件优化 |
| 3.4 rALR的3L规模发酵 |
| 3.4.1 不同起始诱导菌体密度优化 |
| 3.4.2 溶氧体积分数优化 |
| 3.4.3 甲醇浓度优化 |
| 3.4.4 诱导时间优化 |
| 3.5 10L和50L中试结果 |
| 3.6 rALR分离纯化条件优化 |
| 3.6.150mL双水相优化结果 |
| 3.6.2 双水相体系放大 |
| 3.6.3 rALR分离纯化结果 |
| 3.6.4 质谱鉴定结果 |
| 3.7 rALR蛋白巯基氧化酶活性 |
| 3.7.1 体外活性 |
| 3.7.2 体内活性 |
| 第四章 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间参加的科研项目及已发表的论文 |
（3）1.23KD rhALR表达、纯化、单克隆抗体制备及功能初步探索 2.rhALR对人肾小管上皮细胞缺氧复氧炎症反应干预及机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分：23KD rhALR表达、纯化、单克隆抗体制备及功能初步探索 |
| 前言 |
| 实验一 23KD重组人肝再生增强因子的构建、表达及纯化 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 实验二 23KD重组人肝再生增强因子单克隆抗体制备 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 实验三 23KD重组人肝再生增强因子功能初步探索 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 rhALR在人肾小管上皮细胞缺氧复氧中炎症反应干预及机制研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述一 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
（4）人肝再生增强子的克隆、表达及其在肝衰竭患者中表达水平的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩写、符号清单和术语表 |
| 引言 |
| 1. 人肝再生增强子的克隆、表达、纯化及鉴定 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 2. 抗ALR单克隆抗体的制备及效价研究 |
| 2.1 鼠单克隆抗体的制备(委托杭州华安生物技术有限公司) |
| 2.2 单克隆抗体效价研究 |
| 2.3 结论 |
| 3. 人肝再生增强子在不同性质肝脏疾病患者血清中表达水平的差异 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 资料和方法 |
| 3.3 分组与统计 |
| 3.4 结果 |
| 3.5 讨论 |
| 4 人肝再生增强子在肝衰竭患者中的表达水平及意义 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 资料和方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 (与ALR研究相关的文章) |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（5）人肝再生增强因子生物活性的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 特异性刺激肝细胞增殖因子的发现 |
| 1.2 人肝再生增强因子(ALR205)的克隆 |
| 1.3 ALR125的基因结构 |
| 1.4 ALR205的组织表达定位 |
| 1.5 ALR205的生物学活性和作用机制 |
| 1.6 本研究的意义和主要内容 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 引物 |
| 2.1.3 试验动物与细胞株 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要仪器和设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 ALR205基因的克隆 |
| 2.2.2 酵母高表达ALR125蛋白工程菌最佳表达时间的确定 |
| 2.2.3 ALR125的纯化 |
| 2.2.4 pCDNA3.1-ALR205与pCDNA3.1(+)-ALR125重组质粒的大量提取 |
| 2.2.5 ALR125活性检测 |
| 2.2.6 肝再生增强因子基因治疗及纯化蛋白的体内活性检测 |
| 第三章 实验结果及分析 |
| 3.1 ALR205基因片段的扩增、克隆及序列分析 |
| 3.1.1 ALR205基因的PCR扩增结果 |
| 3.1.2 重组载体pCDNA3.1(+)-ALR205的酶切和PCR鉴定结果 |
| 3.1.3 DNA序列测定 |
| 3.1.4 高表达工程菌ALR125最佳表达时间的确定 |
| 3.2 ALR125的纯化 |
| 3.2.1 (NH_4)_2SO_4沉淀法处理重组酵母工程菌发酵液上清 |
| 3.2.2 Sepharose DEAE Fast Flow纯化ALR125 |
| 3.2.3 sephadex G-75凝胶层析精制ALR125 |
| 3.3 ALR125活性实验结果 |
| 3.3.1 ALR125体外促进细胞增殖的活性 |
| 3.3.2 大鼠的一般情况 |
| 3.3.3 肝组织形态学改变 |
| 3.3.4 肝组织PCNA指数 |
| 3.3.5 ALR205基因在大鼠肝组织中的表达情况 |
| 3.3.6 血清ALT和AST水平变化 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（6）人肝再生增强因子在毕赤酵母中的表达、纯化和生物学活性的研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材 料 |
| 1.2 重组载体的构建 |
| 1.3 构建酵母表达菌 |
| 1.4 重组蛋白的表达及鉴定 |
| 1.5 rhALR的纯化 |
| 1.6 rhALR体外活性检测 |
| 2 结 果 |
| 2.1 PCR扩增及重组质粒鉴定结果 |
| 2.2 重组蛋白的表达鉴定结果 |
| 2.3 重组蛋白纯化结果 |
| 2.4 rhALR体外活性检测 |
| 3 讨 论 |
（7）重组人肝再生增强因子的表达和活性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 特异性刺激肝细胞增殖因子的发现 |
| 1.2 人肝再生增强因子(hALR)的克隆 |
| 1.3 hALR的基因结构 |
| 1.4 hALR的组织表达定位和受体的确定 |
| 1.5 hALR的生物学活性 |
| 1.6 hALR的作用机制 |
| 1.7 本研究的意义和主要内容 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 引物 |
| 2.1.3 试验动物与细胞株 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要仪器和设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 克隆载体的构建 |
| 2.2.2 表达载体的构建 |
| 2.2.3 酵母表达菌pPICZaA-hALR/GS115的构建及诱导表达 |
| 2.2.4 rhALR的纯化 |
| 2.2.5 rhALR活性检测 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 3.1 重组载体pPICZaA-hALR构建结果 |
| 3.1.1 hALR的PCR扩增结果 |
| 3.1.2 克隆载体pMD-18T-hALR的菌落PCR和酶切鉴定结果 |
| 3.1.3 表达载体pPICZaA-hALR菌落PCR和酶切鉴定结果 |
| 3.1.4 DNA测序结果 |
| 3.2 酵母表达菌pPICZaA-hALR/GS115的构建及诱导表达 |
| 3.2.1 pPICZaA-hALR电穿孔法转化毕赤酵母GS115 |
| 3.2.2 pPICZaA-hALR原生质球法转化毕赤酵母GS115 |
| 3.2.3 酵母工程菌基因组DNA的提取与PCR检测 |
| 3.2.4 酵母工程菌pPICZaA-hALR/GS115的表型鉴定 |
| 3.2.5 转化菌株诱导表达筛选检测 |
| 3.2.6 重组酵母表达上清的Westernblot分析 |
| 3.2.7 高表达工程菌rhALR最佳表达时间的确定 |
| 3.3 rhALR的纯化 |
| 3.3.1 (NH_4)_2SO_4沉淀法处理重组酵母工程菌发酵液上清 |
| 3.3.2 Sepharose DEAE Fast Flow纯化rhALR |
| 3.3.3 SephadexG-75凝胶层析精制rhALR |
| 3.4 rhALR活性实验结果 |
| 3.4.1 rhALR体外促进细胞增殖的活性 |
| 3.4.2 rhALR促进1/3肝切除大鼠肝细胞增殖 |
| 3.4.3 rhALR对D-氨基半乳糖所致肝损伤大鼠存活率的影响 |
| 3.4.4 rhALR对D-氨基半乳糖所致肝损伤大鼠肝细胞修复作用 |
| 第四章 讨论 |
| 一、hALR在毕赤酵母中的分泌表达 |
| 二、rhALR的纯化 |
| 三、rhALR的活性研究 |
| 第五章 总结 |
| 一、本论文的结果 |
| 二、论文的进一步研究设想 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（8）人肝再生增强因子相互作用蛋白的研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 论文正文：人肝再生增强因子相互作用蛋白的研究 |
| 研究背景 |
| 第一章 从人肝癌细胞CDNA 表达文库筛选HALR 相互作用蛋白及活性初步鉴定 |
| 前言 |
| 第一节 从人肝癌细胞CDNA 表达文库筛选HALR 相互作用蛋白 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 第二节 噬菌体展示HALR 相互作用肽对人肝癌细胞株QGY 增殖效应的观察 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二章 利用RACE 技术进行人肝再生增强因子相互作用肽CDNA 末端快速扩增 |
| 前言 |
| 第一节 利用3’-RACE 技术进行HALRIP CDNA 5’末端快速扩增 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 第二节 利用5’-RACE 技术进行HALRIP CDNA 5’末端快速扩增 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三章 HALR 相互作用肽－PQE30 表达载体的构建、鉴定及表达 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文小结 |
| 本课题的创新点 |
| 文献综述 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（9）肝再生增强因子竞争抑制检测方法的建立及临床初步应用（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 论文正文：肝再生增强因子竞争抑制检测方法的建立及临床初步应用 |
| 前言 |
| 第一部分 人肝再生增强因子的原核表达、纯化及标记 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 人肝再生增强因子单克隆抗体的制备 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 人肝再生增强因子血清含量的检测 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 |
四、重组人肝增强因子的纯化及鉴定（论文参考文献）
- [1]15KD-肝再生增强因子单克隆抗体制备及其对骨髓瘤影响的研究[D]. 黄文祺. 重庆医科大学, 2020(01)
- [2]重组肝再生增强因子（rALR）的50L发酵与高效分离纯化研究[D]. 李鹏飞. 河南师范大学, 2017(02)
- [3]1.23KD rhALR表达、纯化、单克隆抗体制备及功能初步探索 2.rhALR对人肾小管上皮细胞缺氧复氧炎症反应干预及机制研究[D]. 颜如玉. 重庆医科大学, 2015(12)
- [4]人肝再生增强子的克隆、表达及其在肝衰竭患者中表达水平的研究[D]. 俞海英. 浙江大学, 2014(05)
- [5]人肝再生增强因子生物活性的研究[D]. 陈罡. 沈阳药科大学, 2009(S1)
- [6]人肝再生增强因子在毕赤酵母中的表达、纯化和生物学活性的研究[J]. 陈俊杰,孔祥平,佟明华,李茹冰,杨联萍,游松. 中国生物工程杂志, 2007(06)
- [7]重组人肝再生增强因子的表达和活性研究[D]. 陈俊杰. 沈阳药科大学, 2007(05)
- [8]人肝再生增强因子相互作用蛋白的研究[D]. 邓建川. 重庆医科大学, 2006(01)
- [9]肝再生增强因子竞争抑制检测方法的建立及临床初步应用[D]. 王娜. 重庆医科大学, 2006(01)
- [10]大肠杆菌分泌表达重组人肝再生增强因子的纯化、鉴定与活性研究[J]. 郝爱鱼,董爱华,赵广荣,周兴军,宋欣,任乐民,暴娜,高文利,贾茜. 中国生化药物杂志, 2006(01)