使用噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒核心启动子结合蛋白

一、应用噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒核心启动子结合蛋白（论文文献综述）

平芳^[1]（2020）在《靶向乙型肝炎病毒核心蛋白定量检测方法的研究》文中研究说明乙型肝炎（hepatitis B）是一种由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）引起的全球范围的传染病,主要在肝脏发生病变。临床上,通过检测HBV血清标志物来辅助判断HBV感染与否、评价预后、治疗方案和药物反应等。近年来随着越来越多的研究,乙肝病毒核心蛋白（hepatitis B core protein,HBc）作为新型检测HBV手段受到广泛关注。HBc单体构成同型二聚体,进一步包裹前基因组RNA（pregenome RNA,pgRNA）和HBV聚合酶组装为正20面体的核壳体。核壳体腔内包含HBV松弛环状DNA（relax circular DNA,rcDNA）和病毒聚合酶的复合体,最终和HBV包膜蛋白（hepatitis B surface protein,HBs）相互作用形成成熟病毒颗粒。HBV感染肝脏机制的深入研究发现,HBc尤为重要。目前乙肝病毒学界的共识认为,HBc的表达量与肝细胞核内HBV共价闭合环状DNA（covalenty closed circular DNA,cccDNA）的功能活性正相关,通过定量检测HBc可以指示慢性乙肝患者体内cccDNA是否已经被清除或功能性失活。正对上述问题,我们在外源表达HBc新方法、靶向HBc特异性抗体和HBc定量检测这三方面内容开展相关研究工作。第一部分乙型肝炎病毒核心蛋白在枯草芽孢杆菌中的分泌表达目的:研究枯草芽孢杆菌中分泌表达重组HBc可行性。方法:1.HBc基因插入pBES-DNA穿梭质粒的MCS区域,获得pBES/HBc重组质粒。2.将pBES/HBc重组质粒酶切线性化后与信号肽DNA（Signal peptide library,SP DNA）库进行连接,连接产物转化stellar感受态细胞,收获全部阳性菌落并提取混合质粒。3.将混合质粒用化转的方法转入枯草芽孢杆菌RIK1285感受态细胞,检测信号肽,将包含不同信号肽的菌液进行放大培养,收集培养上清检测HBc分泌量。结果:重组HBc在枯草芽孢杆菌培养上清中存在,且有不同状态;经Western blot发现,Anti-HBc可以上清中重组HBc进行结合,具有高度特异性。结论:重组HBc在枯草芽孢杆菌中实现分泌表达,而且重组HBc蛋白表现出与天然状态类似的生物学活性。第二部分靶向乙型肝炎病毒核心蛋白的单链抗体库的构建目的:用T7噬菌体文库筛选的方法,建立靶向HBc单链抗体库。方法:1.将重组HBc/183和HBc/149作为抗原,免疫Balb/c雌性小鼠（6-8周）8周后,提取小鼠脾细胞mRNA,逆转录为cDNA。2.设计引物,cDNA作为模板,进行第一步PCR反应后,分别获得轻链可变区（VL）,重链可变区（VH）基因DNA片段,进行第二步重叠延伸PCR技术（SOE PCR）反应,将轻链和重链拼接得到单链抗体（ScFv）基因库。3.ScFv基因片段双酶切后与T7Select10-3b连接,构成原代重组T7噬菌体库。4.重组HBc/183和HBc/149作为固相抗原与重组T7噬菌体进行亲和筛选,通过3轮筛选,富集得到与HBc/183和HBc/149结合的噬菌体文库,挑选重组T7噬菌体进行ELISA检测,筛选出亲和性高的重组T7噬菌体,对ScFv进行测序。结果:通过igblast软件分析ScFv基因片段框架区（FR）和互补决定区（CDR）的氨基酸序列。高富集氨基酸序列用来制备ScFv抗体库。结论:得到与重组HBc/183和HBc/149高亲和性结合的ScFv氨基酸序列,为临床检测HBc作基础。第三部分靶向乙型肝炎病毒核心蛋白的抗体对的筛选目的:筛选出靶向HBc的抗体对,用于HBc定量检测。方法:1.制备靶向HBc不同基因片段的亲和性抗体,共23种,其中1-14号靶向HBc蛋白C端150-183氨基酸区域,23-31号靶向HBc蛋白N端1-149氨基酸区域。2.每个ELISA平板与除其自身之外的ALP标记抗体形成抗体对,采用固定在平板上的抗体-抗原-ALP标记抗体模式,检测HBc。3.PBS作为对照组,不同ng级别的HBc样本组。用化学发光的方法检测不同组合的抗体对的发光值,筛选高亲和性的抗体对。结果:进行统计学分析,从中选出亲和性较高的抗体对。结论:不同抗体组对于HBc蛋白的亲和性不同,不同抗体组对于HBc蛋白不同检测限的检测有统计学意义。

田江克^[2]（2007）在《乙型肝炎病毒截短型表面抗原中蛋白结合蛋白基因的筛选研究》文中指出乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是严重影响我国人民健康的重要传染病，可引起急、慢性病毒性肝炎，导致肝纤维化（LC），甚至肝细胞癌（HCC）。HBV感染致肝细胞损伤机制，很大程度上与病毒蛋白和宿主细胞蛋白间的相互作用相关。因此，研究HBV抗原成分与宿主细胞蛋白相互作用及其机理能在一定程度上对HBV的致病机制做出解释，为寻找有效防治HBV的方法提供新线索。HBV基因组具有4个主要的开放读码框架（ORF），分别命名为S、C、P、X区，其中S区通过三个框架（in-frame）内起始密码子（ATG）分为三个结构域：前-S1，前-S2和S结构域，由此3个ATG开始编码产生3种大小不同的表面抗原蛋白：主蛋白（SHBs），中蛋白（MHBs．前-S2+S）和大蛋白（LHBs：前-S1+前-S2+S）。完整的MHBs多肽链是由55个aa的PreS2区和226个aa的S区组成的，研究表明，羧基末端截短形式的HBV表面抗原中蛋白（MHBst）具有反式调节功能，在HBV致病（癌）过程中发挥着重要的作用，但MHBst与宿主细胞的结合蛋白目前还不十分清楚。为研究羧基末端截短形式的HBV表面抗原中蛋白的结合蛋白，本实验应用酵母双杂交技术筛选表达型cDNA白细胞文库中与MHBst的结合蛋白的基因。酵母双杂交是一种研究蛋白-蛋白间相互作用的比较快速、可靠并可大规模筛选的技术。本实验采用酵母双杂交系统-3，利用两种单倍体酵母a和α接合型可以配合形成二倍体，而其中表达的外源蛋白仍能相互作用，免去了低效率文库质粒与诱饵质粒共转染的问题，大大提高了杂交效率；在原技术基础上增加了3个报告基因，降低了假阳性率，保证实验结果的真阳性率达95％。我们首先利用多聚酶链反应（PCR）方法扩增羧基末端167位aa截短的HBV表面抗原中蛋白的基因编码序列，经酶切鉴定正确并连接入酵母表达载体pGBKT7中构建“诱饵”质粒，转化酵母细胞AH109（a型）并在其内表达，Western-blotting验证。然后与转化了人白细胞cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187（α型）进行配合。结果成功克隆出MHBst蛋白并在酵母细胞中表达，配合后选出既能在四缺（SD／-Trp-Leu-Ade-His）培养基又能在铺有X-α-半乳糖（X-α-gal）的四缺培养基上生长并变成蓝色的菌落10个。提取阳性酵母菌落的质粒，电穿孔法转化大肠杆菌，接种在氨苄青霉素-LB平板上选择并测序，经生物信息学分析，排除读码框架不正确者，最后得到9种已知基因，ADP核糖基因子2个，RAB6相互作用蛋白1个，CCR4-NOT转录复合体亚基10（CCR4-NOT-10）1个，脂多糖蛋白结合蛋白（LBP）1个，醛缩酶B（ALDOB）1个，补体成分3（C3）1个，丙酮酸脱氢酶（PDH）1个，人类细菌人工染色体（BAC）1个。为进一步确证经酵母双杂交技术筛选出的结合蛋白与诱饵蛋白间在体外也有相互作用，我们扩增出脂多糖结合蛋白（LBP）基因并克隆入酵母表达载体pGADT7，在TNT网织红细胞裂解物体外翻译，掺入同位素35S，与相应的“诱饵”蛋白进行体外免疫共沉淀反应，进一步证实LBP可以与MHBst特异性结合。本研究成功克隆出MHBst结合蛋白，为进一步研究其在HBV感染中的作用提供了新线索。

成军^[3]（2006）在《慢性肝炎病毒感染致病机制相关新基因克隆化研究策略》文中进行了进一步梳理乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）的慢性感染,与慢性病毒性肝炎、肝硬化、肝细胞癌（HCC）的发病密切相关,其发病机理涉及到很多基因的共同参与.病毒基因的复制和表达受到肝细胞中蛋白质因子的调节,肝炎病毒基因编码的蛋白与肝细胞中的蛋白能够结合,肝炎病毒蛋白在肝细胞中的表达对于肝细胞的基因表达谱产生影响,也可能是病毒性肝炎、肝硬化、肝细胞癌发病机制的重要机制.酵母单杂交技术、酵母双杂交技术、基因芯片技术、抑制性消减杂交技术、噬菌体展示技术、蛋白质分离纯化与基因克隆化的反向遗传学技术等,在肝炎病毒基因调控、肝炎病毒蛋白结合蛋白的研究、肝炎病毒蛋白反式激活靶基因的研究中都有重要的应用,是促进慢性病毒性肝炎发病机理研究,探索病毒性肝炎新型治疗技术和治疗方法的有效途径.

陈琳^[4]（2006）在《丙型肝炎病毒非结构蛋白2反式调节基因NS2TP启动子结合蛋白的研究》文中进行了进一步梳理丙型肝炎病毒（HCV）是引起慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要病原,近年来临床发现丙型肝炎的慢性化程度较其他各型病毒性肝炎更为严重。HCV表达十种蛋白质的多肽:C、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a、NS5b,目前还发现核心蛋白C的编码基因通过移框从而编码一种新的17KD的F蛋白,这些蛋白在病毒的复制和繁殖中各有不同的功能,但有些具体功能还不清楚。 其非结构蛋白基因NS2编码的NS2蛋白具有基质金属蛋白酶活性,通过抑制细胞凋亡及抑制肝脏和非肝特异性的启动子及增强子而使病毒持续感染,本课题组张黎颖等研究HCV NS2发现其可上调下调多种肝细胞蛋白,在肿瘤的发生发展中具有重要意义,可能是丙型肝炎发生发展的分子生物学机制之一。NS2TP是本课题组在国内首次发现的具有CHCH（螺旋—卷曲）结构域的新蛋白家族成员,HCV NS2可下调其在HepG2细胞中表达水平,与细胞内外源性脂肪代谢密切相关,推测其在HCV相关肝脂肪变中有重要作用。本课题组在完成NS2TP克隆化和蛋白表达的基础上,已用酵母双杂交完成其结合蛋白的筛选,发现其与细胞信号转导通路当中的多种蛋白可发生作用以外,还确实验证其可与细胞色素P4502E1结合,在免疫调节中具有不可忽视的作用。且经过现代生物信息学技术的分析,NS2TP为分泌型蛋白,定位于胞外,易与各种药物相互作用而可作为药品或药靶。 应用噬菌体展示技术,以NS2TP启动子DNA片段作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”富集过程,噬斑裂解液PCR扩增后,进行DNA序列分析和同源性生物信息学搜索。噬菌体经富集后,筛选出30个阳性克隆,成功构建了克隆载体。序列测定后经过同源性搜索,确定了和NS2TP启动子特异结合的肝细胞蛋白,共编码6种已知蛋白。用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到NS2TP启动子DNA结合蛋白,分析了这些蛋白的功能,为研究NS2TP的转录调节机制,系统阐述HCV NS2的致病机制提供依据。

高学松^[5]（2005）在《应用噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒核心启动子结合蛋白》文中指出目的:乙型肝炎病毒（HBV）是一种严重危害人类健康的致病因子。在我国,它是导致肝炎、肝硬化、肝细胞癌的主要原因。HBV 属嗜肝DNA 病毒,其基因组为3.2kb 部分双链的环状DNA。HBV 基因组的功能单位十分密集,高度压缩,重复利用。HBV 核心启动子（HBV Core promoter,CP）在HBV 的转录和复制上起重要作用,指导前基因组mRNA 和前核心mRNA 转录。由于病毒基因的表达与调控是研究病毒复制的核心问题,所以本文旨在通过研究与HBV CP 结合的肝细胞特异性蛋白质因子,进一步了解HBV CP 在病毒致病过程中的作用。方法:根据文献报道设计上下游引物,采用聚合酶链反应（Polymerase chain reaction,PCR）技术克隆了HBV CP 的基因片段,将其与氯霉素乙酰转移酶(Chloramphenicol acetyltransfe -rase,CAT 报告基因载体连接,构建了重组报告基因载体pCAT-CP,转染人肝癌细胞系HepG2,同时转染实验室保存的不同的HBV CP 变异株, 用酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）法检测氯霉素乙酰转移酶的表达,验证其活性。以此结论为基础,我们应用噬菌体展示技术筛选HBV CP结合蛋白基因,以HBV CP PCR产物作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA 文库进行4 轮“吸附-洗脱-扩增”筛选过程,将第4 轮阳性噬斑裂解液

成军^[6]（2005）在《加强肝细胞对乙型肝炎病毒调节作用机制的研究》文中认为

成军,洪源,刘妍,王琳,钟彦伟,戴久增,张玲霞,陈菊梅^[7]（2005）在《乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ结合蛋白1反式调节基因的筛选》文中提出目的 应用表达谱基因芯片技术 ,研究乙型肝炎病毒 （HBV）表面抗原基因启动子DNA结合蛋白 1（SBP1）反式调节基因 ,阐明SBP1蛋白可能的分子生物学功能。方法 设计并合成SBP1基因序列特异性的引物 ,应用聚合酶链反应 （PCR）技术扩增SBP1基因片段 ,以常规的分子生物学技术将获得的SBP1编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列测定 ,构建真核表达载体pcDNA3 .1（-） SBP1。以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2 ,提取mRNA ,逆转录为cDNA ,与转染空表达载体pcDNA3 .1（-）的HepG2细胞进行cDNA芯片分析。结果 构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定 ,证实准确无误。提取高质量的mRNA ,逆转录为cDNA ,进行cDNA芯片分析。在 115 2个基因容量的表达谱芯片的筛选中 ,发现有 12个基因表达水平显着上调 ,6个基因表达水平显着下调。结论 应用基因表达谱芯片成功筛选了SBP1转染细胞后差异表达基因 ,为进一步阐明SBP1蛋白可能的生物学功能提供依据。

高学松,成军,甄真,杨艳杰,黄燕萍,郭江,刘妍,戴久增^[8]（2004）在《β2-微球蛋白对乙型肝炎病毒核心启动子转录活性的调节作用》文中进行了进一步梳理目的:研究β2-m对核心启动子表达的调节作用方法:根据HBV核心启动子及β2-微球蛋白的序列设计引物,用聚合酶链反应（PCR）的方法分别扩增HBV核心启动子和β2-微球蛋白基因,分别构建HBV核心启动子的报告载体及β2-微球蛋白的真核表达载体,脂质体法瞬时转染HepG2细胞.结果:成功构建HBV核心启动子的报告载体及β2-微球蛋白（β2-m）的真核表达载体.脂质体法瞬时转染HepG2细胞48h后,核心启动子在β2-微球蛋白（β2-m）的影响下,其启动子活性降底2倍.结论:β2-微球蛋白（β2-m）明显HBV核心启动子的表达

高学松,成军,甄真,杨艳杰,黄燕萍,刘妍^[9]（2004）在《噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒核心启动子结合蛋白的研究》文中认为目的 :通过筛选乙型肝炎病毒 （HBV）核心启动子 （corepromoter ,CP）结合蛋白 ,为HBV复制机制和调控机制的研究探索新的途径。方法 :应用噬菌体展示技术 ,以HBV的核心启动子的聚合酶链反应 （PCR）产物作为固相筛选分子 ,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行 4轮“吸附 -洗脱 -扩增”筛选过程 ,经噬斑的PCR扩增后 ,构建克隆载体 ,最后对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索。结果 :噬菌体经富集后 ,随机筛选得到 7个阳性克隆 ,成功构建了克隆载体。序列测定后经过同源性搜索 ,确定了和HBV启动子结合的肝细胞蛋白基因序列 ,分别编码 β2微球蛋白和 3种未知功能蛋白。 结论 :用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到了与HBV核心启动子结合的蛋白 ,分析了该蛋白的编码基因 ,为进一步研究HBV与肝细胞相互作用的分子生物学机制开辟了新的途径

成军,董菁,张健,王建军,纪冬,刘妍,钟彦伟,王琳^[10]（2004）在《HBV前-S1蛋白结合蛋白大鼠同源基因的克隆化》文中提出目的:利用生物信息学（bioinformatics）技术克隆,鉴定人HBsAg前-S1蛋白结合蛋白（PS1BP）编码基因的同源基因. 方法:人PS1BP由表达型cDNA文库的噬菌体展示技术筛选获得.以人的PS1BP的cDNA序列作为参照,对于美国国立卫生研究院（MH）国立医学图书馆（NLM）生物工程信息学研究中心（NCBI）建立的核苷酸序列数据库GenBank,利用同源基因序列比对的在线分析软件BLASTn进行同源基因序列的比对,发现新的来源于大鼠的同源基因.确定大鼠PS1BP的cDNA序列之后,对于大鼠PSIBP蛋白质一级结构序列与人和小鼠的PS1BP蛋白质一级结构序列的同源性进行分析.利用在线分析软件,对于大鼠PS1BP一级结构序列中潜在的修饰和功能位点进行初步的预测分析. 结果:利用噬菌体展示技术获得了人的PS1BP的cDNA序列.以生物信息学技术确定了大鼠PS1BP的cDNA及其编码产物的序列.大鼠PS1BP的cDNA由1455 nt组成,编码产物由484 aa组成.大鼠PS1BP蛋白质一级结构与人和小鼠PS1BP蛋白质一级结构的同源性分别为80.79%（391/484）和92.98%（450/484）.利用在线分析软件,在大鼠PS1BP蛋白质一级结构中还发现了一系列潜在的蛋白质修饰结构位点. 结论:大鼠PS1BP基因及其编码产物序列被确定

二、应用噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒核心启动子结合蛋白（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、应用噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒核心启动子结合蛋白（论文提纲范文）

（1）靶向乙型肝炎病毒核心蛋白定量检测方法的研究（论文提纲范文）

（2）乙型肝炎病毒截短型表面抗原中蛋白结合蛋白基因的筛选研究（论文提纲范文）

（3）慢性肝炎病毒感染致病机制相关新基因克隆化研究策略（论文提纲范文）

（4）丙型肝炎病毒非结构蛋白2反式调节基因NS2TP启动子结合蛋白的研究（论文提纲范文）

（5）应用噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒核心启动子结合蛋白（论文提纲范文）

（9）噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒核心启动子结合蛋白的研究（论文提纲范文）

四、应用噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒核心启动子结合蛋白（论文参考文献）

• [1]靶向乙型肝炎病毒核心蛋白定量检测方法的研究[D]. 平芳. 重庆医科大学, 2020(12)
• [2]乙型肝炎病毒截短型表面抗原中蛋白结合蛋白基因的筛选研究[D]. 田江克. 中国人民解放军军事医学科学院, 2007(04)
• [3]慢性肝炎病毒感染致病机制相关新基因克隆化研究策略[J]. 成军. 大连大学学报, 2006(04)
• [4]丙型肝炎病毒非结构蛋白2反式调节基因NS2TP启动子结合蛋白的研究[D]. 陈琳. 安徽理工大学, 2006(10)
• [5]应用噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒核心启动子结合蛋白[D]. 高学松. 河北医科大学, 2005(06)
• [6]加强肝细胞对乙型肝炎病毒调节作用机制的研究[J]. 成军. 胃肠病学和肝病学杂志, 2005(01)
• [7]乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ结合蛋白1反式调节基因的筛选[J]. 成军,洪源,刘妍,王琳,钟彦伟,戴久增,张玲霞,陈菊梅. 胃肠病学和肝病学杂志, 2005(01)
• [8]β2-微球蛋白对乙型肝炎病毒核心启动子转录活性的调节作用[J]. 高学松,成军,甄真,杨艳杰,黄燕萍,郭江,刘妍,戴久增. 世界华人消化杂志, 2004(10)
• [9]噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒核心启动子结合蛋白的研究[J]. 高学松,成军,甄真,杨艳杰,黄燕萍,刘妍. 中西医结合肝病杂志, 2004(04)
• [10]HBV前-S1蛋白结合蛋白大鼠同源基因的克隆化[J]. 成军,董菁,张健,王建军,纪冬,刘妍,钟彦伟,王琳. 世界华人消化杂志, 2004(07)

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