一、单核细胞趋化蛋白-1和Ⅳ型胶原在糖尿病肾病大鼠肾组织中的表达（论文文献综述）
刘思逸[1]（2021）在《基于NLRP3炎症小体信号探讨高糖环境下大鼠肾小管上皮细胞炎症因子变化及糖尿病大鼠肾脏纤维化机制》文中进行了进一步梳理目的:研究高糖环境培养下大鼠肾小管上皮细胞和糖尿病大鼠肾脏的NLRP3炎症小体的表达及其相关炎性因子、纤维化因子的表达变化;运用NLRP3 siRNA基因沉默技术及血管紧张素受体拮抗剂（ARB类药）干预糖尿病肾病大鼠和受高糖刺激后的大鼠肾小管上皮细胞,检测上述指标的表达变化,探讨NLRP3炎症小体在糖尿病肾脏疾病的潜在作用机制,探究厄贝沙坦是否能阻断NLRP3炎症小体的作用;设计不同时间点,初步探讨高糖刺激的时间长度对NLRP3炎症小体及通路相关分子的表达变化。方法:使用脂质体转染NLRP3 siRNA,荧光显微镜下观察NRK-52E细胞转染阳性率,荧光定量PCR验证转染效率。细胞实验部分:分5组多个时间点:低糖组、高糖组、高糖+空载组、高糖+NLRP3 siRNA组、高糖+ARB组,采用Q-PCR法检测各时间点的NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）、波形蛋白（Vimentin）m RNA的表达;Western Blot检测各时间点的NLRP3、热休克蛋白47（HSP47）、核因子?B（NF-?B）P-P65、Ⅳ型胶原蛋白（Collagen IV）、波形蛋白（Vimentin）蛋白表达;ELISA法检测细胞上清液白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-ɑ（TNF-ɑ）的表达水平。动物实验部分:分5组多个时间点（4W、8W、12W）:正常对照组、高糖模型组、高糖模型+空载组、高糖模型+NLRP3 siRNA组、高糖模型+ARB组,肾组织学免疫组化观察NF-?B P-P65的变化,肾组织免疫荧光观察Vimentin、NLRP3的变化;采用Q-PCR法检测各时间点的糖尿病大鼠肾脏组织NF-?B、NLRP3、HSP47、肿瘤坏死因子受体相关蛋白6（TRAF6）、Collagen IV m RNA的表达;Western Blot检测各时间点的NLRP3、HSP47、ɑ-平滑肌肌动蛋白（ɑ-SMA）、Vimentin、p-P65蛋白的表达。结果:细胞实验:1、五组细胞干预处理48h后,与低糖组比较,高糖组及高糖+空载组NLRP3、Vimentin m RNA的表达显着增加（P<0.01）,Caspase-1 m RNA的表达明显增加（P<0.05）;NLRP3、HSP47、P-P65、Vimentin、Collagen IV蛋白的表达量显着增加（P<0.01）。与高糖组相比,高糖+NLRP3-siRNA组及高糖+ARB组的NLRP3 m RNA的表达显着下调（P<0.01）,Caspase-1、Vimentin m RNA的表达明显下调（P<0.05）,NLRP3、HSP47、P-P65、Vimenti、Collagen IV蛋白表达量显着下调（P<0.01）。高糖组与高糖+空载组以上指标之间的差异无统计学意义。2、五组细胞干预处理72h后,与低糖组比较,高糖组及高糖+空载组NLRP3、Caspase-1、Vimentin m RNA的表达显着增加（P<0.01）,NLRP3、HSP47、P-P65、Vimentin、Collagen IV蛋白的表达量显着增加（P<0.01）。与高糖组相比,高糖+NLRP3-siRNA组及高糖+ARB组的NLRP3、Vimentin m RNA的表达明显下调（P<0.05）,Caspase-1 m RNA的表达显着下调（P<0.01）,NLRP3、HSP47、P-P65、Vimenti、Collagen IV蛋白表达量显着下调（P<0.01）。高糖组与高糖+空载组上指标之间的差异无统计学意义。3、五组细胞干预处理96h后,与低糖组相比,高糖组及高糖+空载组NLRP3、HSP47、P-P65、Vimentin、Collagen IV蛋白的表达量出现显着增加（P<0.01）;与高糖组相比,高糖+NLRP3 siRNA组及高糖+ARB组NLRP3、HSP47、P-P65、Vimenti蛋白表达量显着下调（P<0.01）,Collagen IV蛋白的表达量明显下调（P<0.05）。高糖组与高糖+空载组上指标之间的差异无统计学意义。4、各时间点（24h、48h、72h）,与低糖组相比,高糖组及高糖+空载组IL-1β、TNF-α的表达量更高;与高糖组相比,高糖+NLRP3 siRNA组及高糖+ARB组IL-1β、TNF-α的表达量更低。随时间变化,24h～72h高糖组IL-1β、TNF-α的表达呈上升趋势;高糖+NLRP3 siRNA组及高糖+ARB组IL-1β、、TNF-α的亦表达呈上升趋势,但表达小于高糖组。动物实验:1、各组干预处理4W后,与Control组比较,Model组及Model+Blank组NF-?B、NLRP3、HSP47、TRAF6、Collagen IV m RNA的表达显着增加（P<0.01）,NLRP3、HSP47、α-SMA、Vimentin、P-P65蛋白的表达量增加（P<0.01）。与Model组相比,Model+NLRP3-siRNA及Model+ARB组的NF-?B、NLRP3、HSP47、TRAF6、Collagen IV m RNA的表达明显下调（P<0.05）,Model+ARB组NLRP3、HSP47蛋白表达量明显下调（P<0.05）,α-SMA、Vimentin、P-P65显着下调（P<0.01）;Model+NLRP3-siRNA组α-SMA、Vimentin、P-P65蛋白的表达量显着下调（P<0.01）,NLRP3、HSP47明显下调（P<0.05）。Model组与Model+Blank组以上指标之间差异无统计学意义。2、各组干预处理8W后,与Control组比较,Model组及Model+Blank组NF-?B、NLRP3、HSP47、TRAF6、Collagen IV m RNA的表达显着增加（P<0.01）,NLRP3、HSP47、α-SMA、Vimentin、P-P65蛋白的表达量增加（P<0.01）。与Model组相比,Model+NLRP3-siRNA及Model+ARB组的NF-?B、NLRP3、HSP47、TRAF6、Collagen IV m RNA的表达明显下调（P<0.05）,Model+ARB组NLRP3、α-SMA、Vimentin、P-P65蛋白表达量下调（P<0.01）,HSP47显着明显下调（P<0.05）,Model+NLRP3-siRNA组NLRP3、Vimentin、P-P65蛋白的表达量显着下调（P<0.01）,SP47、α-SMA明显下调（P<0.05）。Model组与Model+Blank组以上指标之间差异无统计学意义。3、各组干预处理12W后,与Control组比较,Model组及Model+Blank组NF-?B、NLRP3、HSP47、TRAF6、Collagen IV m RNA的表达显着增加（P<0.01）,NLRP3、HSP47、α-SMA、Vimentin、P-P65蛋白的表达量增加（P<0.01）。与Model组相比,Model+NLRP3-siRNA及Model+ARB组的NF-?B、NLRP3的表达显着下调（P<0.01）,HSP47、TRAF6、Collagen IV m RNA的表达明显下调（P<0.05）,NLRP3、HSP47、α-SMA、Vimentin、P-P65蛋白表达量明显下调（P<0.05）;Model+NLRP3-siRNA组NLRP3、HSP47、α-SMA、P-P65蛋白的表达量明显下调（P<0.05）。Model组与Model+Blank组以上指标之间差异无统计学意义结论:高糖可激活天然免疫受体NLRP3炎症小体表达,导致炎性因子和纤维化因子表达上调,诱导大鼠肾小管上皮细胞发生表型转换和糖尿病大鼠肾组织发生纤维化。特异性NLRP3 siRNA基因沉默及血管血管紧张素II受体拮抗剂ARB厄贝沙坦,可阻断由高糖诱导的NLRP3炎症小体的激活,下调炎性因子释放及纤维化蛋白的表达,从而延缓肾病进展。
张亮[2]（2021）在《基于中医象思维探讨肾衰饮干预慢性肾功能衰竭大鼠的机制研究》文中认为目的:基于中医象思维研究肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠TLR4/MyD88/NF-κB信号通路、Fas/Fas L介导的凋亡途径、PI3K/Akt信号通路的影响,探讨该方防治慢性肾功能衰竭的作用机制。材料与方法:选取6周龄SPF级健康雄性SD大鼠84只,随机抽取12只大鼠为正常组,其余72只为造模组。造模组大鼠应用腺嘌呤（200mg/（kg·d））灌胃3周建立慢性肾功能衰竭大鼠模型,将造模成功大鼠再随机分为模型组、肾衰饮组、尿毒清组、P13K抑制剂组（LY组）及肾衰饮+LY组。正常组和模型组予0.9%Nacl溶液8ml/（kg·d）灌胃。肾衰饮组给予中药复方汤剂肾衰饮煎剂按生药量33.3g/（kg·d）灌胃。尿毒清组给予尿毒清颗粒以2.25g/（kg·d）浓度灌胃。LY组给予腹腔注射P13K抑制剂（LY294002）稀释液50mg/kg,周一次。肾衰饮+LY组在给予肾衰饮煎剂按生药量33.3g/（kg·d）灌胃基础上腹腔注射LY294002稀释液50mg/kg,周一次。以上各组大鼠均连续用药4周。各组分别留取大鼠血清及肾组织,检测各项指标。实验一:观察大鼠一般状态,肉眼观察肾脏外观形态,光镜下观察大鼠肾组织病理改变及TUNEL染色法检测凋亡细胞情况。全自动生化分析仪检验大鼠血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水平。酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平。实验二:免疫印迹法（Western Blot法）和免疫组织化学法检测大鼠肾脏组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达情况。实验三:Western Blot法检测肾脏组织Fas、Fas L、Caspase8、Caspase3蛋白表达情况。实验四:Western Blot法检测肾脏组织Akt、磷酸化Akt（p-Akt）蛋白表达情况。结果:1肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠肾脏形态学及肾功能的影响1.1肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠一般状态的影响正常组:精神状态良好,毛色光泽,较少有脱毛现象,活动正常,反应灵活,每日进食量及饮水量均正常,垫料气味较淡,大鼠便质如常排便未见异常。模型组:体重明显下降,精神状态萎靡,毛色干枯晦暗,并出现脱毛现象,反应迟钝,活动减少,进食量减少,饮水量增加,垫料气味臭秽,稀便。尿毒清组:体重不同程度下降,精神状态萎靡,毛色干枯、脱落,精神中度萎靡,反应略有迟钝,活动减少,进食量减少,饮水量增多,垫料气味臭秽,稀便。肾衰饮组:体重不同程度下降,精神轻度萎靡,毛色干枯脱毛现象较轻,反应尚可,活动度尚可,进食量尚可,饮水量略增加,垫料气味臭秽,可见便质如常排便未见异常。1.2肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠肾脏形态学的影响1.2.1肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠肾脏组织外观形态的影响与正常组比较,其余各组大鼠肾脏体积均不同程度的增大,其中模型组改变最为明显,尿毒清组其次,最后为肾衰饮组。与正常组比较,模型组大鼠肾脏组织表面均呈弥漫性细颗粒状改变,凹凸不平,被膜粘连,不易剥离,且外观颜色均明显发白,肉眼观察外观颜色发白程度:模型组>尿毒清组>肾衰饮组>正常组。沿肾门纵行剖开,除空白组外各组肾组织切面处均可见肾皮质不同程度变薄,且皮髓质界限欠清晰,其中模型组最明显,其他各组肉眼观察无明显区别。1.2.2肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠体质量及肾指数的影响各组大鼠实验前及造模第1周体质量比较无明显差异;与正常组比较,第2周、第3周造模组大鼠体质量明显降低（P<0.05）;治疗期间:第1周:与正常组比较,模型组、尿毒清组和肾衰饮组大鼠体质量明显降低（P<0.01）;第2周和第3周:与正常组比较,模型组与尿毒清组大鼠体质量明显降低（P<0.05）,肾衰饮组无明显差异;与模型组比较,尿毒清组和肾衰饮组大鼠体质量无明显差异;第4周:与正常组比较,模型组、尿毒清组和肾衰饮组大鼠体质量明显降低（P<0.01）,肾指数明显升高（P<0.01）,与模型组比较,尿毒清组和肾衰饮组大鼠体质量明显升高（P<0.05）,肾指数降低（尿毒清组P<0.01,肾衰饮组P<0.05）,尿毒清组与肾衰饮组大鼠体质量、肾指数比较无明显差异。1.2.3肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠肾脏病理学的影响苏木精-伊红（HE）染色结果:正常组可见肾小球、肾小管、系膜结构正常,间质未见增宽,无炎性细胞浸润。模型组可见肾小球囊腔变大,部分肾小管萎缩,小管的管壁薄厚不匀,肾小管上皮细胞弥漫空泡变性,成纤维细胞增多,系膜细胞增生明显,肾小球周围可见大量炎性细胞浸润。尿毒清组可见肾小管上皮细胞空泡变性减轻,系膜细胞轻度增生,部分区域伴有炎性细胞浸润。肾衰饮组可见成纤维细胞减少,系膜细胞轻度增生,部分区域伴有炎性细胞浸润。肾衰饮组在肾小管上皮细胞空泡变性及系膜细胞增生程度均低于尿毒清组。1.3肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠血清Scr、BUN水平的影响与正常组比较,模型组血清Scr、BUN水平明显升高（P<0.01）;与模型组比较,尿毒清组和肾衰饮组血清Scr、BUN水平均明显降低（P<0.01）,尿毒清组和肾衰饮组比较无统计学差异。2肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠肾脏细胞凋亡情况的影响TUNEL染色后显微镜下观察:正常组大鼠肾脏组织中细胞正常,未见阳性细胞;模型组大鼠肾脏细胞凋亡数量明显增多,且主要分布在髓质区;尿毒清组和肾衰饮组大鼠肾脏细胞凋亡指数较模型组降低（P<0.01）;尿毒清组和肾衰饮组相比差异无统计学意义。3肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平的影响ELISA法检测大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平:与正常组比较,模型组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平明显升高（P<0.01）;与模型组比较,尿毒清组和肾衰饮组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平均明显降低（P<0.01）;与尿毒清组比较,肾衰饮组大鼠血清IL-6、TNF-α表达水平降低（P<0.05）。4肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠肾脏组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平的影响Western blot法检测肾脏组织内TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平:与正常组相比,模型组大鼠肾脏组织中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平均明显升高（P<0.01）;与模型组比较,尿毒清组和肾衰饮组大鼠肾脏组织中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平均明显降低（P<0.01）,尿毒清组和肾衰饮组比较无统计学差异。免疫组织化学法检测各组大鼠肾脏组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达情况:光镜下观察,正常组肾脏组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达为阴性,模型组TLR4、MyD88、NF-κB蛋白呈强阳性表达,尿毒清颗粒和肾衰饮干预后均能不同程度的减少TLR4、MyD88、NF-κB蛋白的表达（P<0.01）,且两组之间无明显差异。5肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠肾脏组织Fas、Fas L、Caspase8、Caspase3蛋白表达的影响Western blot法检测肾脏组织Fas、Fas L、Caspase8、Caspase3蛋白表达:与正常组比较,模型组大鼠肾脏组织Fas、Fas L、Caspase8、Caspase3蛋白表达水平显着增高（P<0.01）;与模型组比较,尿毒清组和肾衰饮组大鼠肾脏组织Fas、Fas L、Caspase8、Caspase3蛋白表达水平均明显降低（P<0.01）;尿毒清组和肾衰饮组相比差异均无显着性意义。6肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠肾脏组织PI3K/Akt信号通路蛋白表达的影响各组大鼠肾脏组织Akt蛋白表达无明显差异。与正常组比较,模型组大鼠肾脏组织p-Akt蛋白表达水平降低（P<0.01）,p-Akt/Akt比值降低（P<0.01）;与模型组比较,P13K抑制剂组（LY组）大鼠肾脏组织p-Akt蛋白表达水平显着降低（P<0.01）,p-Akt/Akt比值显着降低（P<0.01）;与LY组比较,肾衰饮+LY组大鼠肾脏组织p-Akt蛋白表达水平明显升高（P<0.01）,p-Akt/Akt比值显着升高（P<0.01）。结论:1基于中医象思维,根据肾藏象的病理之象,提出脾肾虚损是慢性肾功能衰竭发生和发展的病理基础,是产生毒邪的根源;毒邪（湿毒、痰毒、瘀毒）是加重病情进展恶化及迁延不愈的重要外因,证属本虚标实。2拟“抗毒、解毒、排毒”三法于一方,肾衰饮健脾益肾扶正以抗毒;祛湿涤痰化瘀以解毒;通腑泄浊以排毒,攻补兼施。3根据以上病因病机、治则治法,实验研究表明:（1）肾衰饮能够明显改善腺嘌呤诱导的慢性肾功能衰竭模型大鼠的一般状态及肾功能,减轻肾脏组织病理损伤,抑制肾脏炎症反应和细胞凋亡,进一步抑制肾脏纤维化,达到治疗慢性肾功能衰竭的目的;（2）肾衰饮能够降低腺嘌呤诱导的慢性肾功能衰竭模型大鼠肾脏组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达,从而抑制炎症反应,减轻肾脏炎性损伤;（3）肾衰饮能够降低腺嘌呤诱导的慢性肾功能衰竭模型大鼠Fas、Fas L、Caspase8、Caspase3蛋白表达水平,对肾脏细胞凋亡起到抑制作用;（4）肾衰饮可能通过激活PI3K/Akt信号通路,进一步抑制其下游的效应靶点Fas L来抑制慢性肾功能衰竭大鼠肾脏细胞凋亡。
王钦汶[3]（2021）在《丹酚酸与丹参酮组分配伍对糖尿病肾病协同效应的研究》文中研究说明一、文献研究糖尿病肾病是糖尿病患者临床常见而难治的慢性微血管并发症,也是导致终末期肾病的主要原因。世界卫生组织（WHO）预估,直至2045年,糖尿病患者将增至7亿人,而临床上超过1/3的糖尿病患者发展为DKD患者,是糖尿病患者致残和致死的重要原因。因此,针对DKD的发病机制研究以及开发新型治疗药物,已经成为国内外医药领域研究的热点。本文较为系统地总结和归纳了国内外糖尿病肾病的发病机制,主要有高血糖、高血压、血脂异常、肾素-血管紧张素-醛固酮系统的激活、胰岛素抵抗及氧化应激等多种因素,以及丹参酚酸和丹参酮干预糖尿病肾病的作用机制,丹参酚酸可调控Act-A蛋白表达,调节TGF-β1和MCP-1水平;抑制MAPK信号通路,减少ECM的产生;进而减轻糖尿病肾病的症状。丹参酮可通过抑制肾脏中的TGF-β/Smad和NF-κB通路的表达;抑制PTP1B改善T2DM患者中胰岛β细胞分泌功能:下调Wnt/β-catenin信号通路的活性来等。以期为进一步深入研究和药物开发提供科学依据。二、丹酚酸及丹参酮有效组分的提取制备与成分分析1.在课题组对丹酚酸类成分分离纯化工艺研究的基础上,采用课题组前期优化的提取分离纯化工艺,采用水提取醇沉淀的方法从丹参中获得丹酚酸粗提取物;进一步采用乙酸乙酯萃取法和大孔吸附树脂柱层析法进行纯化精制,获得高纯度的丹酚酸类成分。最终总丹酚酸（原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C）的纯度达84.82%。2.对丹参酮类成分的纯化工艺进行了系统研究与评价,以丹参中4种丹参酮类成分（二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA）的总含量为评价指标,通过大孔树脂进行分离纯化确定最佳纯化工艺。乙酸乙酯萃取进一步提高丹参酮类成分的纯度,最终确定最佳分离纯化工艺,获得总丹参酮的纯度为67.33%。三、基于细胞模型的丹参酚酸与丹参酮配伍效应与量效特征研究1.本实验采用高糖（GLU）对人肾小管上皮细胞（HK-2）进行造模,造成细胞损伤模型。经高糖造模给药后发现,丹酚酸和丹参酮以及配伍组对细胞均有保护作用,且中、低剂量对细胞保护作用较为显着。与单独用药组相比,配伍组对GLU诱导的HK-2细胞损伤保护作用较强,保护率较高的主要集中在配伍比例为10:1和9:1。在高糖模型下,模型组细胞内的炎症因子水平较正常组显着升高,各配伍组对高糖诱导的炎症因子异常现象,均有向正常组调节趋势。对于炎症因子IL-6、TNF-α MCP-1下调作用显着的配伍比例为4:1,配伍组10:1、9:1对IL-1/β的调控作用最佳。2.本实验采用过氧化氢（H2O2）对HK-2细胞进行造模,造成氧化损伤模型。经过氧化氢造模给药后发现,丹酚酸和丹参酮以及配伍组对细胞均有保护作用。其中丹酚酸剂量越高,对氧化损伤的HK-2细胞保护率越高。丹参酮对其也有较好的保护作用。在配伍组配伍比例为4:1、3:1、2:1的保护效果较为显着。在过氧化氢模型下,模型组细胞内的炎症因子水平较正常组显着升高,配伍给药组对炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α MCP-1下调作用显着的配伍比例为4:1,其他配伍比例组效果不明显。3.本实验采用GLU对大鼠肾小球系膜（HBZY-1）细胞进行造模,造成细胞损伤模型。高糖造模给药后发现,丹酚酸和丹参酮以及配伍组对细胞均有保护作用,其中丹参酮保护效果优于丹酚酸,且配伍组对GLU诱导的HBZY-1细胞损伤的保护作用更为显着。结果显示,当配伍组丹酚酸比例越高,保护效果越佳。在高糖模型下,模型组细胞内的炎症因子水平较正常组显着升高,各配伍组对各炎症因子均有回调趋势,其中对IL-1β、TNF-α、MCP-1下调趋势明显,且比列在9:1和4:1时效果最为显着。但各配伍组对IL-6均无回调趋势。4.本实验采用H2O2对HBZY-1细胞进行造模,造成其氧化损伤模型。经过氧化氢造模给药后发现,丹酚酸和丹参酮以及配伍组对HBZY-1细胞均有保护作用。其中丹酚酸对氧化损伤的HBZY-1的保护作用呈现剂量依赖性。丹参酮对肾小球系膜细胞也有较好的保护作用。配伍组可有效防止细胞氧化损伤,其中配伍比例10:1、9:1、6:1、4:1,效果较为明显。在过氧化氢模型下,模型组细胞内的炎症因子水平较正常组显着升高,各配伍组对炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1下调效果明显的比例主要为10:1、9:1、5:1、4:1、3:1,其他配伍比例调节效果不显着。这个结果与细胞保护率趋势相一致。四、基于动物模型的丹参酚酸与丹参酮配伍效应与作用机制研究1.以小剂量STZ联合膳食诱导大鼠慢性肾损伤模型,分别给予厄贝沙坦（IRB）、二甲双胍（MEL）、丹酚酸（SAL）、丹参酮（TAN）、以及丹酚酸和丹参酮不同配伍比例4:1（COM1）、9:1（COM2）进行药物干预。病理切片结果表明,各给药组对糖尿病肾病大鼠的肾脏损伤的病理情况,均有一定程度改善作用,其中MEL组、COM1组、COM2组可显着改善肾脏的病理变化;24h尿蛋白检测结果显示,IRB、COM1、COM2有明显回调作用;而在生化指标血清肌酐SCr、尿素氮BUN、甘油三酯TG、总胆固醇TC、谷丙转氨酶AST、谷草转氨酶ALT等的检测结果中发现,各个给药组均有下调作用,其中MEL、COM1最为显着;在肾组织炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1）测定结果表明,IRB、SAL、COM2对其下调效果较为显着。综合病理切片情况、生化指标、24h尿蛋白结果和炎症因子水平,同时参考前期细胞水平的活性筛选结果,确定2种组分最优配伍比例为4:1,且丹酚酸和丹参酮配伍使用效果优于丹酚酸和丹参酮单独使用。2.采用非靶向代谢群组学研究方法,采用UPLC-Q-TOF-MS技术,并结合统计学分析,综合评价多种变量,探究糖尿病肾病的大鼠尿液、血浆的代谢轮廓特点,研究丹酚酸、丹参酮及其配伍组的生物效应与作用机制。结果表明,在血浆中发现并鉴定了 23个潜在生物标志物,在尿液中鉴定了 22个潜在生物标志物,其涉及牛磺酸和次牛磺酸代谢、苯丙氨酸代谢、亚油酸代谢、花生四烯酸代谢等代谢通路;各组别在PLS-DA图上有较大不同,可以明显区分出正常组、模型组、阳性药组、丹酚酸、丹参酮及其配伍组,给药组均向正常状态转归。3.通过16Sr DNA技术分析糖尿病肾病大鼠结肠内容物中肠道菌群多样性,结果显示,相较与空白组,模型组大鼠肠道菌群在门水平上均有显着性差异。门水平上,模型组在厚壁菌门、拟杆菌门中丰度下降;在放线菌门、变形菌门、疣微菌门中,丰度上升。在科分类的菌群中 Bifidobacteriaceae、Enterobacteriaceae、Erysipelotrichaceae 在糖尿病肾病模型组呈上升趋势,Lactobacillaceae、Lachnospiraceae、Prevotellaceae在模型组呈下调趋势。表明糖尿病肾病鼠体内发生了一定程度的肠道菌群失调。各给药组能回调其肠道菌的失衡,其中IRB、MEL、COM1均表现出良好回调效果,且COM1比SAL、TAN调节效果显着。
周静波[4]（2021）在《金丝桃苷通过靶向miR-499-5p改善STZ诱导的糖尿病肾病作用机制研究》文中指出第一部分:芪葵颗粒对糖尿病肾病患者临床疗效研究目的 通过芪葵颗粒对糖尿病肾病患者进行治疗,确认芪葵颗粒临床疗效,为后续研究提供临床数据支持。方法 筛选2016年3月～2020年1月在我院确诊为2型糖尿病的患者作为研究对象,所有患者均符合2型糖尿病诊断且病史资料完整、临床样本收集齐全。通过尿白蛋白排泄率及临床信息诊断分为糖尿病组及糖尿病肾病组。糖尿病组采用常规降糖治疗,作为对照组。糖尿病肾病组采用常规降糖治疗,并口服芪葵颗粒治疗,作为治疗组。治疗前后,采集治疗组患者血液样本及尿液样本。对比糖尿病组、糖尿病肾病组治疗前后的性别、年龄、收缩压、舒张压、高血压发病率、FPG、HBA1c、TG、PBG、TC、血肌酐（SCR）、UACR、24h-UTP 及 EGFR 等指标。结果 两组患者治疗前一般资料:男女比例、年龄、收缩压、舒张压、高血压发病率等比较,差异均无统计学差异（P<0.05）。与糖尿病组（DM组）对比,DN组患者的FPG、HBA1c及TG显着高于DM组,差异具有统计学意义（P<0.05）;两组患者PBG、TC水平无显着性差异（P>0.05）。与糖尿病组（DM组）对比,DN组患者的血肌酐（SCR）、UACR、24h-UTP水平均显着高于DM组,EGFR水平显着低于DM组,差异具有显着统计学意义（P<0.01）。与治疗前对比,治疗后DN组患者的UACR、24h-UTP 水平均显着降低,差异具有显着统计学意义（P<0.01）。SCR略为升高,而EGFR略为降低,但与治疗前相比,无显着性差异（P>0.05）。与表3数据进行比较,可以发现DN组虽经治疗后UACR、24h-UTP均有所改善,SCR和EGFR略微改善,但与DM组相比,仍有显着性差异（P<0.01）。结论 芪葵颗粒可改善糖尿病肾病患者SCR、UACR、24h-UTP及EGFR功能治疗,对糖尿病肾病具有临床治疗作用。后续对芪葵颗粒有效成分金丝桃苷进行药理学研究具有临床支持。第二部分:金丝桃苷通过miR-499-5p/NRIPI对高糖干预的HK-2细胞的保护作用及机制目的:通过观察金丝桃苷对高糖诱导的HK-2细胞影响,探讨金丝桃苷对高糖干预的HK-2细胞凋亡和炎症反应的影响及相关机制。方法:HK-2细胞株作为正常肾小管细胞的模型,在高糖条件（含45.0 mmol/L葡萄糖培养基）中进行培养,以建立体外糖尿病肾病模型。TUNEL法检测细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞凋亡。用ELISA试剂盒检测炎症反应。Western blotting检测凋亡相关基因和炎性细胞因子的蛋白水平。机制分析包括荧光素酶报告实验和RNA pulldown实验来检测分子间的结合关系。结果:首先,分别通过CCK-8、TUNEL及流式细胞术测定对照组（Control）、高糖模型组（HG）、治疗组（HG+Hyperoside）条件下HK-2细胞的存活情况。数据表明,高糖处理可诱导细胞凋亡,金丝桃苷可减少细胞凋亡且具有剂量依赖性。Western blot分析显示,金丝桃苷可使HG诱导的Bax表达增加和Bcl-2表达降低。检测HG处理的HK-2细胞中IL-10、IL-6和IL-1β的蛋白水平。HG可上调IL-6、IL-1β蛋白水平,下调IL-10蛋白水平,金丝桃苷可拮抗HG对IL-10、IL-6、IL-1β的影响。用ELISA试剂盒检测这些促炎细胞因子的浓度。结果表明,金丝桃苷逆转了 HG对HK-2细胞炎症反应的刺激作用。接下来,我们发现在HK-2细胞中miR-499-5p被HG下调,并进一步被金丝桃苷剂量依赖性上调。RT-qPCR检测miR-4995p对HG处理的HK-2细胞的基因敲除效应。miR-4995p的表达被miR-499-5p抑制剂有效地下调。miR-499-5p抑制剂可挽救金丝桃苷对HG处理的HK-2细胞的抗凋亡作用。Western blot和ELISA结果表明,抑制miR-499-5p可挽救金丝桃苷诱导的HK-2细胞IL-10水平的升高,以及IL-6和IL-1β水平的降低。根据Starbase预测,NRIP1被确定为miR-499-5p的下游靶点。HG诱导HK-2细胞NRIP1表达上调,金丝桃苷处理呈剂量依赖性降低NRIP1的表达。miR-499-5p抑制剂促进HK-2细胞NRIP1 mRNA和蛋白水平,与HG处理无关。从Starbase预测了 miR-499-5p和NRIP1的结合序列。NRIP1的结合位点发生突变,用于下一步的荧光素酶报告分析。转染miR499-5p抑制剂增强了 HK-2细胞中pmirGLO-NRIP1-Wt质粒的荧光素酶活性,而对pmirGLO-NRIP1Mut质粒的荧光素酶活性没有显着影响。RNA Pulldown实验数据表明,与 bio-miR-499-5p Mut 相比,BIO-miR-499-5p Wt 下拉的产物中 NRIP1含量丰富,表明miR-499-5p与NRIP1存在相互作用。进行抢救试验显示,抑制NRIP1可以挽救miR-499-5p对HK-2细胞的促凋亡作用。沉默的miR-499-5p对IL-10、IL-6和IL-1β蛋白水平的刺激作用可通过下调NRIP1来恢复结论:金丝桃苷通过miR-499-5p/NRIP1轴减轻HG诱导的HK-2细胞凋亡和炎症反应。第三部分:金丝桃苷通过靶向miR-499-5p/APC轴改善STZ诱导的糖尿病肾病目的:本研究旨在进一步探讨金丝桃苷通过靶向miR-499-5p/APC轴改善STZ诱导的糖尿病肾病的作用机制。方法:HK-2细胞株作为正常肾小管细胞的模型,在高糖条件（含45.0 mmol/L葡萄糖培养基）中进行培养,以建立体外糖尿病肾病模型。TUNEL法检测细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞凋亡。用ELISA试剂盒检测炎症反应。Western blotting检测凋亡相关基因和炎性细胞因子的蛋白水平。机制分析包括荧光素酶报告实验和RNA下拉实验来检测分子间的结合关系。采用SPF级C57BL/6雄性小鼠,高脂高糖饮食及STZ诱导建立糖尿病肾病小鼠模型。通过给予不同剂量金丝桃苷进行治疗,测定各剂量组小鼠尿蛋白和血糖、体重、收缩压、血肌酐和肾小球滤过率。用RT-qPCR检测miR-499-5p和APC水平,评价miR-499-5P和APC对小鼠血糖的影响。组织学免疫染色观察肾组织结构,测定PAS 阳性小鼠肾小球面积指数和系膜扩张指数,对小鼠肾小球和肾间质胶原沉积进行定量。用免疫印迹法检测各组Bax、Bcl-2、胶原Ⅰ、胶原Ⅳ和纤维连接蛋白的蛋白水平。用ELISA法检测各组细胞因子（肿瘤坏死因子-α、单核细胞趋化蛋白-1、白细胞介素-1-β）的含量。利用TargetScan（http://www.targetscan.org）)数据库来预测含有APC3‘非编码区结合位点的潜在miRNA。结果:用高糖（25 mmol/L）处理足细胞模拟细胞损伤,以正常葡萄糖（5.5mmol/L）作对照。高糖显着上调细胞外基质（包括胶原Ⅰ、胶原Ⅳ和纤维连接蛋白）的表达,金丝桃苷则抑制其升高。此外,在高糖环境下炎症细胞因子TNF-α、单核细胞趋化蛋白-1和IL-1β的蛋白水平升高。同时金丝桃苷可以降低高糖模型中炎症反应。金丝桃苷可拮抗HG诱导的足细胞Bax的升高、Bcl-2的降低、Caspase-3活性的降低。采用高脂饮食和链脲佐菌素（Streptozocin,STZ）注射诱导糖尿病肾病小鼠模型,糖尿病肾病小鼠血糖升高,然后用金丝桃苷或胰岛素治疗后降低。根据PAS和Masson‘s三色染色的结果,我们发现金丝桃苷治疗可以对抗STZ介导的肾小球面积和大小的增加。注射链脲佐菌素后,糖尿病大鼠肾小球表面积明显增加,肾小球系膜扩张,肾小管-肠系膜胶原大量积聚。然而,这种作用被金丝桃苷处理明显取消。Western blot分析发现,金丝桃苷治疗可减轻糖尿病肾病小鼠肾组织中细胞外基质（胶原Ⅰ、胶原Ⅳ和纤维连接蛋白）的积聚。此外,Western blot和ELISA分析表明,金丝桃苷治疗可以抑制STZ诱导的炎症反应。最后,与Sham+DMSO组相比,STZ介导的Bax的升高和Bcl-2蛋白水平的降低被Hyproside治疗所拮抗,与Sham+DMSO组相比,STZ介导了 Bax的升高和Bcl-2蛋白水平的降低。RT-qPCR分析表明,miR-499-5p在金丝桃苷处理的足细胞中比其他miRNAs显示更多的上调。然后,RT-qPCR发现miR-499-5p水平被高糖降低,然后通过体内金丝桃苷处理恢复。通过TargetScan推测了 miR-499-5P与APC的3’UTR之间的结合序列,通过转染miR-499-5p模拟物和抗miR-499-5p分别过表达和下调miR-499-5p的表达水平。用足细胞进行荧光素酶报告实验表明,野生型pGLO-APC-3’UTR的荧光素酶活性被异位miR-499-5p显着降低,而被miR-499-5p沉默的野生型pGLO-APC-3’UTR的荧光素酶活性显着升高,而突变体pGLOAPC-3’UTR的荧光素酶活性没有明显的变化。RT-qPCR和Western blot分析表明,miR-4995p扩增能提高mRNA和蛋白质水平,而miR-499-5p抑制能降低mRNA和蛋白质水平。最后,miR-499-5p抑制取消了金丝桃苷对足细胞APC mRNA水平的抑制作用。小鼠分别注射AA V-miR-499-5P和AA V-APC后,左肾组织miR-499-5p和APC水平显着升高,右肾无明显分化。miR-499-5p过表达和APC过表达对糖尿病肾病小鼠的血糖、体重、血肌酐和血压均无明显影响。miR-499-5p对GFR的抑制作用被APC过表达所抵消。与DN+Mock+载体组比较,AA vmir-499-5P组肾小球肥大程度减轻,肾小球表面积减少。这种影响被APC的过度表达所抵消。在糖尿病肾病小鼠中,通过AA V-APC治疗,miR-499-5P对肾小球表面积和系膜伸展的抑制作用以及肾小管间质胶原堆积的减少都得到了恢复。在糖尿病肾病小鼠中,miR-499-5P对肾小球表面积和系膜伸展的抑制作用以及肾小管间质胶原堆积的减少都得到了恢复。同样,Western blot分析表明,miR-499-5p导致的肾组织ECM减少也被APC过表达所抵消。此外,注射AA V-miR-499-5p可降低糖尿病肾病小鼠血清中炎症细胞因子的含量。然而,这一结果被APC的过度表达所抵消。AAV-miR-499-5p诱导的Bax降低和Bcl-2升高可被糖尿病肾病小鼠肾组织中APC的过表达所抵消。最后,miR-499-5p的过表达破坏了高糖处理对尿蛋白的促进作用,可被异位APC逆转。结论:金丝桃苷在体外可抑制HG诱导的ECM聚集、炎症反应和细胞凋亡。金丝桃苷治疗改善了 STZ诱导的小鼠的糖尿病症状,减轻了糖尿病肾病小鼠的肾脏损伤和纤维化。金丝桃苷在体外和体内均能抑制APC水平。而APC被miR499-5p直接靶向和负调控。miR-499-5P通过靶向APC减轻糖尿病肾病小鼠的肾功能障碍。APC的过表达逆转了miR-499-5p对肾脏损伤和纤维化的影响。
郭艳丽[5]（2020）在《马里苷单克隆抗体的制备以及抗糖尿病肾病机制研究》文中进行了进一步梳理目的:糖尿病肾病目前是世界各国慢性肾脏疾病和终末期肾病的主要病因,马里苷为两色金鸡菊抗糖尿病肾病的有效成分之一,但作用机制尚不明确。本文通过制备马里苷单克隆抗体,建立间接竞争ELISA方法,用于药材中马里苷定量检测,并探讨马里苷对糖尿病肾病保护作用以及机制。方法:1.马里苷单抗制备:采用高碘酸钠法和曼尼希法制备人工抗原,PEG法诱导小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合,筛选出能特异性产生马里苷的杂交瘤细胞株,进行亚克隆。腹水法大量制备抗体后,饱和硫酸铵法纯化抗体。建立间接竞争ELISA方法用于两色金鸡菊提取物中马里苷的定量检测,并与高效液相方法做比较。2.马里苷体外吸收机制研究:建立MDCK单层细胞模型,采用UPLC-MS/MS对马里苷进行含量测定,考察马里苷吸收和外排转运特性,并考察SGLTs的非选择性抑制剂（根皮苷）和GLUT2抑制剂（根皮素）对马里苷在MDCK细胞模型跨膜转运的影响。3.体外实验:采用Western-blot以及RT-q PCR检测马里苷对高糖诱导HK-2细胞SGLT2表达影响,检测AMPK/ACC信号通路以及炎症和纤维化相关蛋白表达;进一步采用慢病毒技术过表达SGLT2蛋白,探讨马里苷对SGLT2表达的影响。4.体内实验:采用db/db糖尿病小鼠,共分为四组:db/m组、db/db组、db/db恩格列净组（10mg/kg）和db/db马里苷组（50mg/kg）,连续给药12周,测定血清生化指标以及肝肾功能指标。PAS染色、Masson染色和透射电镜观察肾组织病理学变化。Western-blot和免疫组化检测肾组织SGLT2的表达,AMPK/ACC/PGC-1信号通路探讨马里苷对肾脏保护作用机制。结果:1.马里苷单抗制备:高碘酸钠法和曼尼希法制备马里苷人工抗原,薄层鉴定结果均显示合成成功,但免疫Balb/c小鼠,只有曼尼希法合成的人工抗原在小鼠体内产生马里苷特异性抗体,小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合后,经亚克隆得到马里苷单克隆细胞株4B11。建立间接竞争ELISA方法用于马里苷定量检测,结果表明:马里苷在156.25-5000 ng/m L范围内成线性（R2=0.991）,且精密度与加样回收率均符合要求。对于两色金鸡菊提取物中马里苷定量检测,该间接竞争ELISA方法与HPLC方法高度吻合,并且发现杭菊和贡菊提取物均未检测出马里苷。2.马里苷在MDCK单层细胞模型吸收和外排转运的Papp均在在1-4×10-6cm·s-1,属于中等吸收化合物,除了被动转运之外,主动转运也参与其跨膜转运。SGLTs抑制剂根皮苷干预后,马里苷转运量显着降低,并具有显着性差异;GLUT2抑制剂根皮素无明显影响。3.体外实验:马里苷抑制正常HK-2细胞SGLT2蛋白表达,抑制葡萄糖摄取。在高糖干预HK-2细胞模型上,马里苷和根皮苷均能明显抑制SGLT2蛋白和m RNA表达增高;达格列净对正常细胞和高糖干预HK-2细胞的SGLT2蛋白表达无明显影响,但其可以逆转高糖引起SGLT2 m RNA表达增高;达格列净、根皮苷和马里苷干预后均能激活高糖干预HK-2细胞p-AMPK/p-ACC蛋白,且达格列净干预组对AMPK,ACC m RNA表达升高更为显着;根皮苷和马里苷干预能抑制高糖诱导的细胞外基质蛋白COL1和FN以及促炎因子MCP-1和IL-6表达上调。HK-2细胞过表达SGLT2后,马里苷干预能显着抑制SGLT2表达增高。4.体内实验:马里苷和恩格列净干预对db/db小鼠的体重和肾重无明显影响,但两者均可明显降低空腹血糖,改善胰岛素抵抗。除了降糖作用外,两者均能显着降低糖尿病小鼠血清甘油三酯、胆固醇和低密度脂蛋白,并且增加血清脂联素含量改善脂代谢紊乱;两者均能逆转糖尿病引起的血清中促炎因子IL-6和MCP-1的增高,但对机体总的抗氧化能力没有影响。马里苷和恩格列净对糖尿病小鼠的肝功能无明显的影响,但是能显着改善糖尿病引起肾功能减退;PAS、Masson染色结果表明,马里苷和恩格列净干预均能显着改善糖尿病引起的肾小球和肾小管基底膜增厚,肾小球硬化和肾小管纤维化。糖尿病肾病情况下,肾小管SGLT2表达显着增高,恩格列净和马里苷均能显着抑制SGLT2表达增高;且两者均能通过激活p-AMPK/p-ACC/PGC-1通路,抑制SREBP-1表达改善糖尿病引起的肾脏脂质异位沉积。此外,两者均能在不同程度上缓解糖尿病引起的肾脏炎症和纤维化。结论:1.基于马里苷单克隆抗体建立的间接竞争ELISA方法可以用于药材中马里苷定量检测,且与高效液相有很好的一致性。2.马里苷在MDCK单层细胞模型以原型吸收,属于中等吸收化合物,SGLTs可能介导马里苷在MDCK单层细胞上的跨膜转运。3.马里苷能够抑制正常HK-2细胞SGLT2蛋白表达,抑制葡萄糖摄取;且马里苷能逆转高糖干预和SGLT2过表达引起SGLT2表达增高,同时通过激活p-AMPK/p-ACC,抑制纤维化和炎症而缓解高糖损伤。4.马里苷能够显着抑制db/db糖尿病小鼠肾脏SGLT2表达增高。同时,其通过激活p-AMPK/p-ACC/PGC-1通路,抑制SREBP-1蛋白表达减轻肾脏脂质异位堆积,减轻脂毒性。此外,马里苷通过抑制纤维化和炎症相关蛋白而发挥保护作用。
危志强[6]（2020）在《二十碳五烯酸抑制肾小管上皮细胞间质转化及纤维化的机制研究》文中进行了进一步梳理第一部分二十碳五烯酸抑制肾小管上皮细胞间质转化及纤维化机制的体外研究背景:上皮细胞向间充质细胞转化即上皮间充质转化（EMT）是肾脏疾病进展的一个重要过程。转化生长因子β1（TGF-β1）是一种常见的促纤维化细胞因子,TGF-β1/整合蛋白联接激酶（ILK）信号通路和整合素β1（integrinβ1）/ILK信号通路在肾纤维化过程中对间质的慢性炎症变化和细胞外基质的积累起着重要作用。过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）可下调肾小管上皮细胞分泌炎性介质ILK活性,延缓EMT。多个研究证实mi RNAs参与了肾小管水平细胞发育,如mi R-4756,mi R-34a和mi R-210。微眼相关转录因子（MITF）是MIR-541的靶点,MITF/mi R-541轴是心肌肥厚的一种新的调节途径。肿瘤转移和EMT的重要调节因子mi RNAs通过调节EMT相关基因参与各种肿瘤的进展。那么,mi R-541是否参与肾小管上皮细胞间质转化及纤维化的尚不清楚。二十碳五烯酸（EPA）具有降低蛋白尿、减轻肾脏损害、延缓肾脏进展等作用,然而EPA的肾脏保护作用是否通过TGF-β1/ILK信号通路和或integrinβ1/ILK信号通路、是否有mi R-541参与尚不清楚。目的:本研究对HK-2模型采用人血白蛋白（Alb）刺激,并对体内肾小管上皮细胞在发生蛋白尿后的病理改变过程进行模拟。分析EPA对肾脏EMT、纤维化和信号通路相关蛋白表达水平的影响,评价mi R-541在此过程的作用,并探讨其潜在机制。基于此,本体外实验研究将探讨EPA抑制肾小管上皮细胞间质转化及纤维化中的可能作用机制,以期为临床治疗提供理论依据。方法:常规培养对数生长期HK-2细胞,对其进行培养24h后,将其放置在无血清培养24h,将细胞培养为G0期。（1）将5.0mg/ml Alb加入为白蛋白组（模型组）;将EPAl0μmol/l+5.0mg/ml Alb（低剂量EPA干预组）,EPA30μmol/l+5.0mg/ml Alb（高剂量EPA干预组）,另外设置正常对照组。对以上各组进行培养24h、48h、72h,并对其具体指标进行测定。（2）细胞转染mi R-541抑制剂或mi R-NC抑制剂24h后,洗涤细胞,然后用或不用5mg/ml Alb处理,有或没有30μmol/l EPA刺激24h,对具体指标进行测定。各实验组均设置6个重复孔。（3）采用MTT法测定Alb或EPA对HK-2细胞活力的影响。通过QPCR检测ILK、integrinβ1、PPARγ、mi R-541、平滑肌肌动蛋白（a-SMA）、E钙黏蛋白（E-Cadherin）、I型胶原蛋白（collagen I）、纤维连接蛋白（FN）等m RNA表达。（4）采用Western blot法测定ILK通路相关蛋白TGF-β1、p Smad2/3、Smad7和ILK蛋白水平,同时测定integrinβ1、PPARγ、mi R-541、a-SMA、E-Cadherin、collagen I等蛋白水平。采用ELISA法检测FN的水平。（5）mi R-541和TGF-β1之间的目标关系通过生物信息学,荧光素酶基因测定和蛋白质印迹分析证实。结果:（1）低剂量的Alb对HK-2细胞的细胞存活率没有影响,而EPA以浓度依赖性方式抑制HK-2细胞的细胞活力。（2）HK-2在Alb的作用下,ILKm RNA和蛋白的表达上调,而integrinβ1、PPARγ的m RNA和蛋白的表达下调,EPA一定程度上抑制了该过程,且呈浓度和时间依赖性。（3）EPA可抑制Alb诱导的HK-2细胞的EMT和纤维化,并增加mi R-541表达。mi R-541的引入有效地消除了Alb刺激的HK-2细胞的EMT和纤维化。（4）生物信息学分析预测TGF-β1作为mi R-541的靶基因,随后荧光素酶报告基因检测和蛋白质印迹分析进一步支持了该预测。mi R-541可下调TGF-β1的表达,并抑制TGF-β1/Smad3/ILK通路。Alb处理激活TGF-β1/Smad3/ILK途径,而EPA抑制该途径的激活。（5）mi R-541抑制剂逆转了EPA对Alb诱导的HK-2细胞的EMT、纤维化和TGF-β1/Smad3/ILK通路相关蛋白表达的影响。结论:EPA可通过PPARγ介导的ILK/integrinβl信号通路直接激活核受体,或靶向mi R-541通过TGF-β1/Smads/ILK通路,抑制EMT和肾纤维化。第二部分二十碳五烯酸抑制肾小管上皮细胞间质转化及纤维化机制的体内研究背景:在慢性肾脏疾病中辅助采用二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳五烯酸（EPA）等n-3多不饱和脂肪酸可使患者受益,比如降低蛋白尿、减轻肾脏损害、延缓肾脏进展等作用,然而具体作用机制尚不清楚。目的:本研究拟对早期阶段的2型糖尿病肾病KK-Ay/Ta小鼠采用EPA干预,通过检测小鼠表型变化、分析肾脏病理变化等,探讨体内试验研究中EPA抑制肾小管上皮细胞间质转化及纤维化的机制,为EPA治疗慢性肾脏病尤其是早期糖尿病性肾病提供理论依据。方法:在本次体内实验中,将20只KK-Ay/Ta雄性小鼠采用随机数字表法进行分组分为2组每组均为10只雄性小鼠,其中治疗组从小鼠周龄自第12周开始给予EPA给药,每次腹腔内注射EPA1g/kg/d,连续注射8周,非治疗组在自第12周开始给予腹腔内注射生理盐水1g/kg/d,连续注射8周。对照组小鼠为10只Balb/c A雄性小鼠。分别在小鼠12周、16周及20周时对小鼠血压、血糖、尿蛋白肌酐比值等表型变化进行检测,并在小鼠20周龄时对血清脂肪酸、甘油三酯、胆固醇、晚期氧化蛋白产物（AOPP）、丙二醛（MDA）、胰岛素、糖耐量水平进行检测。对KK-Ay/Ta雄性小鼠进行8周治疗后处死,将肾组织取出,并采取形态学对肾组织进行观察及检测,采用图象分析软件、免疫组化对肾脏中TGFβ1、α-SMA、I型胶原、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）等表达及巨噬细胞浸润的情况进行检测分析。同时采用RT-PCR检测MCP-1、TGFβl、α-SMA和I型胶原m RNA表达。结果:对KK-Ay/Ta雄性小鼠经EPA治疗后,相比于未治疗组,血清磷脂中EPA水平呈明显升高趋势,本研究结果提示腹腔内注射EPA被KK-Ay/Ta雄性小鼠充分吸收。经过EPA治疗后,KK-Ay/Ta雄性小鼠的AOPP、MDA水平明显得到降低,且KK-Ay/Ta雄性小鼠的血清甘油三酯下降明显,对尿白蛋白的排泄率起到明显降低作用,对葡萄糖不耐受现象明显得到改善。通过免疫组化检测及形态学检查均证实对KK-Ay/Ta雄性小鼠进行EPA治疗后可明显降低肾小球细胞外基质的积聚,同时可减少EMT和小管间质纤维化程度,另外可有效减弱肾脏中MCP-1及巨噬细胞的浸润。通过RT-PCR检测结果提示,对KK-Ay/Ta雄性小鼠进行EPA治疗后,与未治疗组相比,MCP-1、TGFβl、α-SMA及I型胶原m RNA表达均呈下降状态。结论:EPA可通过抑制肾脏局部的炎症、纠正体内异常代谢、调节TGFβ1水平和氧化应激状态等有效地缓解细胞外基质的积聚,减轻EMT和肾间质纤维化。
浦强[7]（2020）在《基于PKM2调控M1型巨噬细胞活化途径探讨黄葵素对糖尿病肾病模型肾保护作用的机制研究》文中提出糖尿病肾病（Diabetic kidney disease,DKD）是糖尿病最常见也是最严重的微血管并发症之一,严重威胁着人类健康。免疫系统激活、微炎症状态是目前一致认可的糖尿病肾病发病机制,如何克服免疫炎症反应,阻止和延缓DKD的进程,是糖尿病肾病防治领域的重要课题。巨噬细胞是关键的免疫炎症效应细胞。糖尿病环境下,肾脏局部巨噬细胞浸润,并活化为促炎M1型,产生多种炎性细胞因子、趋化因子、促纤维化因子等,改变肾脏局部微环境,引起肾小球损伤、结构重塑、硬化,小管萎缩,间质炎症及纤维化等。巨噬细胞从静息状态至促炎M1型经典活化状态发生了糖代谢重编程（从静止转变为活跃代谢状态）。M1型巨噬细胞主要依靠快速供能的有氧糖酵解途径获取能量及中间介质以发挥促炎效应。M2型丙酮酸激酶（pyruvate kinase M2,PKM2）是细胞代谢重编程的关键酶,是糖酵解最重要的限速酶。生理状态下,PKM2以高激酶活性的四聚体构象存在于细胞质内,能与其他糖代谢酶,如己糖激酶、丙酮酸脱氢酶激酶等构成复合体驱动三羧酸循环,调节细胞的能量代谢。微环境刺激下,PKM2四聚体解离为低活性的二聚体易位至细胞核,作为转录因子,驱动糖酵解进程。核PKM2是巨噬细胞活化M1的关键决定因素。因此,在糖尿病状态下,基于免疫代谢酶点深入研究巨噬细胞相关的肾损伤机制,以筛选出防治DKD新的作用靶点,具有重要的理论及临床意义。中医药在延缓糖尿病肾病病情进展方面具有不可替代的优势。中药黄蜀葵花及其制剂目前已成为治疗糖尿病肾病、慢性肾炎等慢性肾脏病的重要药物。本研究以db/db小鼠及RAW264.7巨噬细胞为研究对象,探讨黄蜀葵花醇提取物-黄葵素对DKD肾脏的保护作用,及其机制是否与巨噬细胞浸润、活化相关,进一步探寻其中可能作用靶点,为黄蜀葵花治疗糖尿病肾病的药理机制提供新的实验依据。目的:从动物和细胞水平,应用分子生物学实验技术,观察黄葵素对db/db小鼠肾组织炎症、纤维化的影响,并初步探明其中机制是否与调控M2型丙酮酸激酶（PKM2）及M1型巨噬细胞浸润、活化相关,为黄蜀葵花治疗糖尿病肾病提供科学依据。方法:1.动物实验:20只雄性db/db小鼠按随机数字表法均分为黄葵素低剂量、中剂量、高剂量治疗组（97.5mg/kg/d,195mg/kg/d,390mg/kg/d）及糖尿病肾病模型组,每组各5只小鼠,空白对照组用5只相同背景的db/m小鼠。黄葵素治疗组分别相应剂量黄葵素混悬液灌胃,对照组及模型组以等体积的0.5%羧甲基纤维素钠溶液灌胃。连续给药16周,期间定期检测尿ACR。第24周处死小鼠并收集标本。HE染色和Masson染色观察肾脏形态学改变和肾纤维化程度;免疫组化染色法检测肾组织F4/80标记的巨噬细胞表达情况;蛋白质印迹法检测F4/80蛋白、III型胶原蛋白、波形蛋白、iNOS蛋白和PKM2蛋白表达情况;RT-qPCR法检测TNF-α、IL-1β、iNOS和PKM2基因的mRNA表达情况;ELISA法检测血清TNF-α、MCP-1水平。2.细胞实验:CCK-8法检测不同浓度梯度的黄葵素对RAW264.7巨噬细胞存活率的影响,初步确定适宜浓度黄葵素进行后续药效学实验。不同糖浓度梯度刺激RAW264.7细胞,流式细胞术筛选巨噬细胞M1型活化最佳糖浓度。将RAW264.7巨噬细胞分为低糖组,高糖组,高糖+黄葵素组,流式细胞术分析黄葵素对RAW264.7巨噬细胞M1型活化的影响,蛋白质印迹法检测PKM2蛋白表达,探讨量效关系。结果:1.与对照组db/m小鼠相比:糖尿病肾病模型组db/db小鼠体重明显上升（P<0.01）;肾脏指数下降（P<0.01）;尿ACR水平明显升高（P<0.01）;血肌酐水平明显升高（123.50±17.91 vs 13.40±1.36,P<0.01）,尿素氮水平明显升高（15.22±0.63 vs 6.53±1.38,P<0.01）;肾脏病理损害明显、胶原纤维的沉积;免疫组化提示肾组织中标记F4/80的巨噬细胞浸润增多（P<0.05）;肾组织中巨噬细胞标记F4/80蛋白、M1型巨噬细胞活化标志iNOS蛋白和mRNA、及炎症因子IL-1β、TNF-α基因的mRNA转录均增加（P<0.01）;血清中促炎因子TNF-α、MCP-1水平升高（P<0.01）;肾组织中Collagen Ⅲ蛋白和Vimentin蛋白表达明显上调（P<0.01）;糖代谢重编程关键酶PKM2的蛋白和mRNA表达水平明显上调（P<0.01）。2.与DKD模型组小鼠相比:黄葵素组小鼠尿ACR水平均下降（P<0.05）;黄葵素组小鼠血Scr、血BUN水平总体呈抑制的趋势,其中中剂量组血Scr和高剂量组血BUN水平显着下降（P<0.05）,高剂量组血Scr下降水平更明显（P<0.01）;黄葵素组小鼠肾组织中Collagen Ⅲ蛋白和Vimentin蛋白表达均降低,呈量效关系,中、高剂量治疗组降低更显着（P<0.01）;黄葵素组小鼠F4/80标记的棕染细胞浸润呈不同程度降低,呈一定量效关系,中、高剂量组降低更明显（P<0.05）;黄葵素组小鼠肾组织F4/80蛋白表达均下调,呈量效关系,高剂量组下调最明显（P<0.01）,中剂量组次其次（P<0.05）;黄葵素组小鼠肾组织TNF-α、IL-1β和iNOS基因的mRNA转录均下调（P<0.01）;黄葵素组小鼠血清中TNF-α、MCP-1水平均下调（P<0.05）,高剂量组下调更显着（P<0.01）;黄葵素组小鼠肾组织PKM2的蛋白和mRNA表达均呈不同程度的下调（P<0.05,P<0.01）;但体重与肾脏指数方面,黄葵素组与DKD模型组差异无统计学意义（P>0.05）。3.细胞实验结果:高糖（30mM）刺激RAW264.7巨噬细胞后,PKM2蛋白表达上调（P<0.01）,巨噬细胞M1型活化率上升（P<0.05）;而经过25ug/ml、50ug/ml的黄葵素药液处理后,PKM2蛋白表达下调（P<0.01）,M1型巨噬细胞活化率下降（P<0.05）。结论:1.黄葵素显着降低db/db小鼠蛋白尿水平,减轻db/db小鼠肾脏病理损伤,减少胶原纤维沉积,抑制肾纤维化程度,呈量效关系;2.黄葵素可抑制肾组织局部巨噬细胞浸润及M1型巨噬细胞活化,减轻肾组织炎症及纤维化,呈量效关系;3.黄葵素抑制M1型巨噬细胞活化作用,可能与调控PKM2表达相关。
赵宇[8]（2019）在《活性维生素D3通过TREM-1调控糖尿病肾病巨噬细胞功能及表型的研究》文中认为目的糖尿病肾病（DN）是一种慢性炎症性疾病,巨噬细胞浸润是DN重要病理特征,也是导致DN进展的关键因素。巨噬细胞主要通过粘附和迁移过程进入肾组织。糖尿病肾组织中的巨噬细胞主要存在两个表型,即M1/M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞介导炎症反应,参与组织损伤;M2型巨噬细胞则具有组织修复作用。研究发现,糖尿病肾病（DN）肾组织存在M1/M2巨噬细胞表型失衡并以M1型浸润为主。因此,探讨巨噬细胞的调节机制,达到减少肾组织M1型巨噬细胞浸润的目的,以及寻找有效可行的调节巨噬细胞的药物是解决问题的关键。活性维生素D3对糖尿病肾病具有显着的肾保护作用,但其机制尚未阐明。本研究通过构建STZ诱导的糖尿病肾病大鼠模型及体外巨噬细胞培养模型两方面,观察活性维生素D3对糖尿病肾病巨噬细胞的调节作用,同时探讨可能机制。方法体内实验:通过建立STZ诱导的糖尿病肾病大鼠模型,将雄性SD大鼠随机分为三组:对照组（NC组）、DN组、VD干预组（DN+VD组,骨化三醇0.1μg·kg-1·d-1灌胃）、VD对照组（骨化三醇0.1μg·kg-1·d-1灌胃）,干预后18w末处死,PAS染色观察肾脏病理改变。免疫组化法检测肾组织CD68+巨噬细胞浸润以及;Western Blot检测CD68以及M1巨噬细胞特异性标志物iNOS、TNF-α表达,M2巨噬细胞特异性标志物Arg-1、MR表达以及TREM-1、STAT-1、p-STAT-1表达。免疫共聚焦检测CD68和iNOS,CD68和MR,CD68和TREM-1共表达。体外实验:采用体外培养小鼠永生系RAW264.7巨噬细胞,对巨噬细胞予不同的刺激,观察1,25（OH）2D3、TREM-1siRNA,TREM-1过表达质粒,以及STAT-1siNA,STAT-1激活剂对高糖诱导的巨噬细胞粘附、迁移以及M1/M2表型的影响。粘附实验、transwell迁移实验测巨噬细胞的粘附和迁移能力,免疫荧光和Western Blot检测不同干预条件下TREM-1,STAT-1,p-STAT-1以及M1标志物（iNOS、TNF-α）M2标志物（Arg-1、MR）的表达。结果体内实验:与对照组相比,DN组Scr、BUN、24小时尿蛋白及肾小球系膜基质增生程度显着增加（均P<0.05）。VD干预后能明显改善上述病理现象（均P<0.05）。与对照组相比,DN大鼠组肾组织CD68+巨噬细胞浸润数量明显增加,M1型巨噬细胞标志物iNOS、TNF-α表达,TREM-1表达以及p-STAT-1表达显着增加,VD能显着降低DN肾组织巨噬细胞浸润,降低iNOS、TNF-α、TREM-1以及p-STAT-1的表达。体外实验:为了探究高糖状态下巨噬细胞浸润及表型转化的机制,体外培养RAW264.7巨噬细胞。结果发现,与对照组相比高糖组巨噬细胞粘附迁移数量显着增加（P<0.05）;M1型巨噬细胞标志物显着增加（P<0.05）;巨噬细胞TREM-1和p-STAT-1表达显着增加（P<0.05）。为进一步确定TREM-1和STAT-1对巨噬细胞粘附迁移以及巨噬细胞M1/M2表型的调节作用,分别用TREM-1siRNA和STAT-1siRNA干预巨噬细胞观察巨噬细胞粘附迁移和M1/M2表型的变化。实验结果显示,高糖环境下,TREM-1siRNA组与TREM-1siRNA阴性对照组相比,巨噬细胞粘附和迁移数量显着下降（P<0.05）。M1型巨噬细胞标志物显着下降（P<0.05）,但是巨噬细胞STAT-1表达无显着差异。高糖环境下,STAT-1 siRNA组与STAT-1 siRNA阴性对照组相比,巨噬细胞粘附和迁移数量显着下降（P<0.05）;M1型巨噬细胞标志物显着下降（P<0.05）同时,巨噬细胞TREM-1表达显着下降（P<0.05）。上述实验结果证实,TREM-1和STAT-1参与巨噬细胞粘附迁移和M1/M2表型的调节,同时STAT-1是TREM-1上游调控因子。为了观察VD对巨噬细胞的调节作用发现,与高糖组相比,VD能显着降低高糖诱导的巨噬细胞粘附迁移数量（P<0.05）;显着降低高糖诱导的巨噬细胞TREM-1和p-STAT-1的表达（P<0.05）;显着降低高糖诱导的巨噬细胞M1型巨噬细胞标志物的表达（P<0.05）。为了进一步探究VD调节巨噬细胞的机制发现,在高糖环境下,TREM-1质粒过表达组与质粒空载阴性对照组相比,巨噬细胞粘附和迁移数量显着升高（P<0.05）;M1型巨噬细胞标志物显着升高（P<0.05）,但是巨噬细胞STAT-1表达并无明显变化。高糖环境下,STAT-1激活剂组与正常对照组相比,巨噬细胞粘附和迁移数量显着升高（P<0.05）;M1型巨噬细胞标志物显着升高（P<0.05）,同时巨噬细胞TREM-1表达显着升高。结论1.糖尿病肾病大鼠肾组织巨噬细胞浸润增多,并且以M1型浸润为主。2.高浓度葡萄糖环境下,STAT-1/TREM-1信号通路的上调促进巨噬细胞粘附迁移以及向M1型转化。3.活性维生素D3能够通过抑制高糖诱导的STAT-1/TREM-1信号通路,降低巨噬细胞粘附迁移并抑制其向M1型转化,从而缓解糖尿病肾病的进展。
路菲菲[9]（2019）在《三黄益肾胶囊对早期糖尿病肾病大鼠肾组织NF-κB、MCP-1表达的影响》文中认为目的:通过观察三黄益肾胶囊对早期糖尿病肾病大鼠肾组织核因子-κB（NF-κB）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）表达的影响,探讨其防治糖尿病肾脏病变的可能作用机制。方法:雄性SD大鼠70只,适应性喂养1周后随机分为正常对照组（NC）10只,造模组60只。造模组大鼠腹腔注射链脲佐菌素（STZ）后,随机分为糖尿病肾病组（DN）、雷米普利组（RP）及三黄益肾胶囊低（SL）、中（SM）、高（SH）剂量组,每组10只。SL组、SM组、SH组大鼠分别给予三黄益肾胶囊0.4 g/kg/d、0.8 g/kg/d、1.6 g/kg/d灌胃,RP组大鼠给予雷米普利片0.5 mg/kg/d灌胃,NC组、DN组大鼠给予等剂量蒸馏水灌胃。治疗8周末,观察各组大鼠血糖、甘油三酯、胆固醇、血尿素氮、血肌酐、24 h尿微量白蛋白、肾脏病理变化及肾组织NF-κB、MCP-1的表达。结果:1.各组大鼠一般情况NC组大鼠精神状态良好,进食、活动均正常;DN组大鼠精神状态较差,各治疗组大鼠与DN组大鼠比较,症状有改善。2.各组大鼠血糖、甘油三酯、胆固醇、血尿素氮、血肌酐及24 h尿微量白蛋白的变化各组大鼠经治疗后血糖、甘油三酯、胆固醇未见明显改善,血尿素氮、血肌酐、24 h尿微量白蛋白较DN组大鼠降低,以SM组、SH组、RP组大鼠降低显着。3.各组大鼠肾组织病理变化NC组大鼠肾脏组织结构大致正常;DN组大鼠肾组织结构混乱,基底膜增厚,间质区有炎性细胞浸润;各治疗组大鼠肾组织病理损伤较DN组大鼠有不同程度的减轻,以SM组、SH组、RP组大鼠减轻明显。4.各组大鼠肾组织中NF-κB、MCP-1的表达NF-κB、MCP-1的蛋白及MCP-1mRNA在NC组大鼠肾组织中正常表达,在DN组大鼠肾组织中呈现高表达,在各治疗组大鼠肾组织中表达下降,在SM组、SH组、RP组大鼠肾组织中表达下降明显。结论:1.三黄益肾胶囊能够降低早期DN大鼠血肌酐、血尿素氮、24 h尿微量白蛋白,减轻并改善早期DN大鼠的肾脏病理损伤,这种治疗作用独立于血糖、血脂的变化。2.三黄益肾胶囊能够抑制肾组织中NF-κB、MCP-1蛋白、基因的表达。3.三黄益肾胶囊部分通过以上机制保护肾脏组织,改善大鼠的早期DN。
周本宏,汪静[10]（2017）在《中药及提取物调节单核细胞趋化蛋白1、肿瘤坏死因子-α对糖尿病肾病改善作用》文中进行了进一步梳理糖尿病肾病（DN）是糖尿病的并发症之一,其发病机制与炎症密切相关。该文总结单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）与DN的相关性及相关中药干预的相关文献,发现肾脏组织中MCP-1受到氧化应激、NF-κB依赖的信号通路等因素诱导而表达增加,导致巨噬细胞聚集、尿蛋白增加、肾纤维化、肾脏清除能力下降,进而导致肾损伤。临床及实验发现血清、尿液及肾组织中肿瘤坏死因子αmRNA和蛋白水平与DN密切相关,可作为DN的标志物,对临床有一定的指导作用。MCP-1、TNF-α两个靶点对临床治疗DN提供了新的思路。雷公藤多苷等一些中药及提取物通过抑制这两个靶点对DN有缓解或治疗作用,值得在临床进一步验证或推广应用。
二、单核细胞趋化蛋白-1和Ⅳ型胶原在糖尿病肾病大鼠肾组织中的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、单核细胞趋化蛋白-1和Ⅳ型胶原在糖尿病肾病大鼠肾组织中的表达（论文提纲范文）
（1）基于NLRP3炎症小体信号探讨高糖环境下大鼠肾小管上皮细胞炎症因子变化及糖尿病大鼠肾脏纤维化机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 NOD样受体家族与NLRP3 炎症小体 |
| 1.2 NLRP3 炎症小体的活化及其调控机制 |
| 1.3 NLRP3 炎症小体与TLR之间的关系 |
| 1.4 NLRP3 炎症小体与天然免疫 |
| 1.5 NLRP3 炎症小体与DKD |
| 第2章 材料与研究方法及步骤 |
| 第一部分 实验:细胞实验 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 研究方法及步骤 |
| 2.1 主要溶液的配置 |
| 2.2 细胞实验(培养、冻存、传代、复苏及计数) |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 实验分组 |
| 2.5 荧光定量PCR检测各组NLRP3、Caspase-1、Vimentin mRNA的表达 |
| 2.6 Western Blot分析各处理NLRP3、HSP47、P-P65、Vimentin、Collagen Ⅳ蛋白的相对表达量 |
| 2.7 ELISA检测细胞上清液中IL-1β、TNF-ɑ的表达量, 操作步骤如下 |
| 3 统计学分析 |
| 第二部分 试验:动物实验 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要溶液配制 |
| 2 研究方法和步骤 |
| 2.1 动物模型的建立 |
| 2.2 实验分组 |
| 2.3 采集标本 |
| 2.4 常规生理生化指标检测 |
| 2.5 肾组织病理学检测 |
| 2.6 免疫组织化学 |
| 2.7 荧光定量PCR检测各组NF-kB、NLRP3、HSP47、TRAF6、Collagen Ⅳ mRNA的表达 |
| 2.8 Western Blot分析各处理组NLRP3、HSP47、α-SMA、Vimentin、P-P65蛋白的相对表达量 |
| 3 统计学分析 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 第一部分实验 |
| 3.1.1 检测各组NLRP3 siRNA的干扰效率有效性检测 |
| 3.1.2 荧光定量PCR检测48h、72h各组细胞NLRP3、Caspase-1、Vimentin mRNA的相对表达量 |
| 3.1.3 Western blot检测48h、72h和96h各组细胞NLRP3、HSP47、P-P65、Vimentin、Collagen IV蛋白的表达量 |
| 3.1.4 ELISA检测24h、48h、72h各组细胞培养上清液IL-1β、TNF-ɑ的表达 |
| 3.2 第二部分实验: |
| 3.2.1 肾组织病理变化 |
| 3.2.2 荧光定量PCR检测4W、8W和12W各组细胞NF-?B、NLRP3、HSP47、TRAF6、Collagen IV m RNA的相对表达量 |
| 3.2.3 Western blot检测4W、8W和12W各组细胞NLRP3、HSP47、α-SMA、Vimentin、P-P65 蛋白的表达量 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 第6章 创新之处 |
| 第7章 展望与不足 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 天然免疫细胞与糖尿病肾病 |
| 参考文献 |
（2）基于中医象思维探讨肾衰饮干预慢性肾功能衰竭大鼠的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 观察肾衰饮对CRF大鼠抗炎、抗凋亡的作用 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 基于TLR4/MyD88/NF-κB通路探讨肾衰饮对CRF大鼠抗炎机制的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文三 肾衰饮对CRF大鼠肾脏细胞凋亡的调控机制 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文四 探讨肾衰饮调控CRF大鼠PI3K/Akt通路的作用机制 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 从炎症及细胞凋亡角度探讨CRF的发病机制及中药防治CRF的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（3）丹酚酸与丹参酮组分配伍对糖尿病肾病协同效应的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 文献研究 |
| 参考文献 |
| 第二章 丹参有效组分的制备与分析 |
| 第一节 丹酚酸类成分的制备与分析 |
| 第二节 丹参酮类成分的制备与分析 |
| 参考文献 |
| 第三章 基于细胞模型的丹酚酸与丹参酮组分配伍效应及量效关系研究 |
| 第一节 基于HK-2细胞模型的丹酚酸与丹参酮组分配伍效应及量效关系研究 |
| 第二节 基于HBZY-1细胞模型的丹酚酸与丹参酮组分配伍效应及量效关系研究 |
| 参考文献 |
| 第四章 基于小剂量STZ联合膳食诱导大鼠慢性肾损伤模型的丹酚酸与丹参酮配伍效应与作用机制研究 |
| 第一节 丹酚酸与丹参酮配伍效应评价 |
| 参考文献 |
| 第二节 基于动态代谢组学糖尿病肾病发病机制的研究 |
| 第三节 基于代谢组学的丹酚酸与丹参酮组分配伍作用机制研究 |
| 参考文献 |
| 第四节 基于肠道菌群的丹酚酸与丹参酮配伍调节作用与机制 |
| 参考文献 |
| 小结与展望 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（4）金丝桃苷通过靶向miR-499-5p改善STZ诱导的糖尿病肾病作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 糖尿病肾病的流行病学特点 |
| 2 糖尿病肾病的病理生理及发病机制 |
| 2.1 促炎细胞因子在糖尿病肾病中的作用 |
| 2.2 代谢与生化因子 |
| 2.3 自噬 |
| 2.4 纤维化 |
| 3 参考文献 |
| 第一章 芪葵颗粒对糖尿病肾病患者临床疗效研究 |
| 1 前言 |
| 2 方法与材料 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 样本量估算 |
| 2.3 诊断标准 |
| 2.4 治疗方案 |
| 2.5 方法与材料 |
| 2.6 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 一般资料汇总 |
| 3.2 血糖及血脂数据分析 |
| 3.3 SCR、UACR、24h-UTP及EGFR数据分析 |
| 3.4 治疗前后糖尿病肾病患者SCR、UACR、24h-UTP及EGFR改善情况比较 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 第二章 金丝桃苷通过miR-499-5p/NRIP1对高糖干预的HK-2细胞的保护作用及机制 |
| 1 前言 |
| 2 方法与材料 |
| 2.1 试剂材料 |
| 3 研究方案 |
| 3.1 生物信息学分析 |
| 3.2 细胞培养 |
| 3.3 细胞的传代 |
| 3.4 细胞分组及给药治疗 |
| 3.5 细胞转染 |
| 3.6 检测方法 |
| 3.7 统计分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 金丝桃苷对高糖条件下HK-2细胞活力的影响 |
| 4.2 金丝桃苷对高糖条件下HK-2细胞炎症因子表达水平的影响 |
| 4.3 金丝桃苷上调miR-499-5p |
| 4.4 金丝桃苷上调miR-499-5p减轻HG诱导的细胞凋亡 |
| 4.5 金丝桃苷上调miR-499-5p减轻HG诱导的炎症反应 |
| 4.6 miR-499-5p靶向HK-2细胞中的NRIP1 |
| 4.7 miR-499-5p与NRIP1存在相互作用 |
| 4.8 金丝桃苷通过miR-499-5p/NRIP1途径抑制HG诱导的HK-2细胞凋亡 |
| 4.9 金丝桃苷通过miR-499-5p/NRIP1途径抑制HG诱导的HK-2细胞炎症反应 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 7 参考文献 |
| 第三章 金丝桃苷通过靶向miR-499-5p/APC轴改善STZ诱导的糖尿病肾病 |
| 1 前言 |
| 2 方法与材料 |
| 2.1 试剂材料 |
| 2.2 仪器设备 |
| 2.3 实验动物 |
| 3 研究方案 |
| 3.1 质粒构建 |
| 3.2 体内研究方案 |
| 3.3 检测方法 |
| 3.4 统计分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 金丝桃苷抑制高糖诱导的细胞外基质(ECM)积聚、炎症反应和细胞凋亡 |
| 4.2 金丝桃苷治疗改善链脲佐菌素诱导的小鼠糖尿病症状 |
| 4.3 金丝桃苷治疗减轻糖尿病肾病小鼠肾损伤和肾纤维化 |
| 4.4 金丝桃苷在体内外对APC水平的抑制作用 |
| 4.5 miR-499-5p直接靶向和负调控APC |
| 4.6 miR-499-5P和APC对小鼠糖尿病症状无影响 |
| 4.7 APC过表达逆转miR-499-5p在肾损伤和纤维化中的作用 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 7 全文总结 |
| 8 参考文献 |
| 综述糖尿病肾病:表观遗传学和microRNA之间的调节相互作用 |
| 1 miRNA:生物发生与功能 |
| 1.1 miRNAs在肾脏生理学中的作用 |
| 1.2 糖尿病肾病中的miRNA |
| 2 表观遗传学 |
| 2.1 简介 |
| 2.2 表观遗传学与糖尿病肾病 |
| 3 结束语 |
| 4 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 致谢 |
（5）马里苷单克隆抗体的制备以及抗糖尿病肾病机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 马里苷单克隆抗体的制备以及酶联免疫分析方法的建立 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 溶液配制 |
| 1.3 马里苷人工抗原制备 |
| 1.4 马里苷人工抗原的鉴定 |
| 1.5 动物免疫 |
| 1.6 细胞融合 |
| 1.7 杂交瘤细胞的克隆化 |
| 1.8 单克隆抗体的大量制备及抗体纯化 |
| 1.9 获得马里苷单克隆抗体的性质鉴定以及ic-ELISA建立 |
| 1.10 基于马里苷单克隆抗体ic-ELISA方法应用 |
| 1.11 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 马里苷人工抗原鉴定 |
| 2.2 动物免疫 |
| 2.3 细胞融合、筛选以及抗体制备及纯化 |
| 2.4 马里苷单克隆抗体性质考察以及间接竞争ELISA方法建立 |
| 2.5 基于马里苷单克隆抗体ic-ELISA方法应用 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 马里苷在MDCK单层细胞模型转运特性研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 溶液配制 |
| 1.3 马里苷UPLC-MS/MS含量测定方法的建立 |
| 1.4 MDCK细胞培养操作 |
| 1.5 MTT实验操作 |
| 1.6 MDCK单层细胞模型的建立 |
| 1.7 不同条件下马里苷在MDCK单层细胞模型的跨膜转运 |
| 1.8 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 马里苷MTT实验结果 |
| 2.2 MDCK单层细胞完整性考察 |
| 2.3 影响马里苷在MDCK单层细胞模型上的跨膜转运因素考察 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 马里苷对高糖干预HK-2细胞SGLT2表达影响 |
| 1 研究内容和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 溶液配制 |
| 1.3 细胞培养操作 |
| 1.4 MTT实验操作 |
| 1.5 HK-2细胞高糖模型的建立 |
| 1.6 细胞转染操作 |
| 1.7 Western-blot检测细胞相关蛋白的表达 |
| 1.8 免疫荧光操作 |
| 1.9 2-NBDG荧光葡萄糖摄取操作 |
| 1.10 RT-qPCR检测总mRNA表达水平 |
| 1.11 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 马里苷对正常HK-2细胞SGLT2,AMPK,ACC蛋白表达以及对2-NBDG荧光葡萄糖摄取的影响 |
| 2.2 马里苷抑制高糖诱导HK-2细胞SGLT2表达增高以及保护高糖损伤机制探讨 |
| 2.3 马里苷对SGLT2过表达HK-2细胞的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四部分 马里苷抗糖尿病肾病机制研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 溶液配制 |
| 1.3 动物分组及处理 |
| 1.4 血清生化指标测定 |
| 1.5 石蜡切片 |
| 1.6 苏木素·伊红(H&E)染色 |
| 1.7 PAS染色 |
| 1.8 Masson染色 |
| 1.9 肾组织的透射电镜 |
| 1.10 免疫组化(IHC)操作 |
| 1.11 组织免疫荧光-石蜡切片(IF) |
| 1.12 油红O染色 |
| 1.13 Westem-Blot检测肾组织相关蛋白表达 |
| 1.14 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 小鼠一般情况观察 |
| 2.2 马里苷对小鼠体重和肾重的影响 |
| 2.3 血清生化指标检测 |
| 2.4 马里苷对db/db糖尿病小鼠肾脏病理学的影响 |
| 2.5 马里苷对肾脏组织SGLT2蛋白表达的影响 |
| 2.6 马里苷通过改善肾脏脂毒性而缓解糖尿病肾病 |
| 2.7 马里苷对db/db小鼠糖尿病肾脏炎症和纤维化的影响 |
| 2.8 马里苷对胰岛组织形态结构和胰岛素分泌的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 糖脂代谢紊乱对糖尿病肾病的影响 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 新疆医科大学博士研究生学位论文 导师评阅表 |
（6）二十碳五烯酸抑制肾小管上皮细胞间质转化及纤维化的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 序言 |
| 第一部分 二十碳五烯酸抑制肾小管上皮细胞间质转化及纤维化机制的体外研究 |
| 引言 |
| 1.实验材料与方法 |
| 2.实验结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 二十碳五烯酸抑制肾小管上皮细胞间质转化及纤维化机制的体内研究 |
| 引言 |
| 1.实验材料与方法 |
| 2.实验结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结与展望 |
| 综述一 二十碳五烯酸在蛋白尿相关性肾病治疗中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 EPA和肾脏疾病的临床研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的科研成果 |
| 英文缩略词表 |
| 致谢 |
（7）基于PKM2调控M1型巨噬细胞活化途径探讨黄葵素对糖尿病肾病模型肾保护作用的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1. 中医学对糖尿病肾病病因病机的认识 |
| 1.1 病因 |
| 1.2 病机 |
| 1.3 黄蜀葵花及其制剂治疗糖尿病肾病的作用机制研究 |
| 1.4 问题与展望 |
| 2. 现代医学基于免疫炎症角度对糖尿病肾病的认识 |
| 2.1 糖尿病肾病与免疫炎症机制 |
| 2.2 免疫细胞 |
| 2.3 免疫细胞受体 |
| 2.4 炎性细胞因子 |
| 2.5 趋化因子 |
| 2.6 粘附分子 |
| 2.7 免疫复合物沉积 |
| 2.8 补体激活 |
| 2.9 问题和展望 |
| 第二部分 动物实验 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药品 |
| 1.3 实验耗材 |
| 1.4 实验主要仪器设备 |
| 1.5 实验主要试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 动物分组 |
| 2.2 给药方案 |
| 2.3 小鼠一般情况观察 |
| 2.4 小鼠血清、尿液和肾脏组织样本采集 |
| 2.5 肾脏组织苏木精-伊红(HE)染色、胶原纤维(Masson)染色 |
| 2.6 小鼠肾组织免疫组化法检测 |
| 2.7 实时荧光定量聚合酶链技术(RT-qPCR)检测 |
| 2.8 蛋白质印迹法(WB)检测 |
| 2.9 酶联免疫吸附法(ELISA)检测 |
| 2.10 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 各组小鼠一般状态的观察 |
| 3.2 各组小鼠体重、肾脏指数的比较 |
| 3.3 各组小鼠尿ACR、血Scr和BUN的比较 |
| 3.4 各组小鼠肾脏病理改变的比较 |
| 3.5 各组小鼠肾脏纤维化指标(Collagen Ⅲ、Vimentin)蛋白表达的比较 |
| 3.6 各组小鼠炎症因子表达结果的比较 |
| 3.7 各组小鼠肾组织M1型巨噬细胞活化结果的比较 |
| 3.8 各组小鼠肾脏组织PKM2蛋白和mRNA的表达比较 |
| 4. 小结 |
| 第三部分 细胞实验 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验药品 |
| 1.3 实验耗材 |
| 1.4 实验主要仪器设备 |
| 1.5 实验主要试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞培养、复苏、传代及冻存 |
| 2.2 Cell Counting Kit (CCK)-8实验 |
| 2.3 流式细胞术 |
| 2.4 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 不同剂量黄葵素(TFA)对RAW264.7细胞的存活率影响 |
| 3.2 不同糖浓度刺激RAW264.7细胞,筛选巨噬细胞M1型活化最佳糖浓度 |
| 3.3 黄葵素对RAW264.7巨噬细胞活化为M1型状态的影响 |
| 3.4 黄葵素对RAW264.7巨噬细胞活化为M1型下PKM2蛋白的影响 |
| 4. 小结 |
| 第四部分 讨论 |
| 结论 |
| 1. 研究的主要成果 |
| 2. 研究存在的不足和展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
（8）活性维生素D3通过TREM-1调控糖尿病肾病巨噬细胞功能及表型的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语注释表(Abbreviations) |
| 绪论 |
| 参考文献 |
| 文献综述一:活性维生素D3通过免疫调节防治糖尿病肾病研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二:髓样细胞触发受体在肾脏疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述三:信号转导子和转录激活子与肾脏疾病 |
| 参考文献 |
| 第一部分 高糖状态下巨噬细胞功能和表型的变化 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料和方法 |
| 1.3 研究内容 |
| 1.4 结果 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 结论 |
| 1.7 参考文献 |
| 第二部分 STAT-1/TREM-1 在高糖调节巨噬细胞功能和表型中的作用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.3 研究内容 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 2.7 参考文献 |
| 第三部分 活性维生素D对高糖状态下巨噬细胞功能、表型、STAT-1及TREM-1表达的调节作用 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 研究内容 |
| 3.4 结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 结论 |
| 3.7 参考文献 |
| 第四部分 STAT-1/TREM-1通路在活性维生素D调节巨噬细胞功能和表型中的作用 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.3 研究内容 |
| 4.4 结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 结论 |
| 4.7 参考文献 |
| 全文总结与展望 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）三黄益肾胶囊对早期糖尿病肾病大鼠肾组织NF-κB、MCP-1表达的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 糖尿病肾病的中医药治疗研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）中药及提取物调节单核细胞趋化蛋白1、肿瘤坏死因子-α对糖尿病肾病改善作用（论文提纲范文）
| 1 MCP-1和TNF-α在糖尿病肾病中的作用 |
| 2 中药及提取物干预MCP-1、TNF-α治疗糖尿病肾病 |
| 2.1 中药复方 |
| 2.1.1 柴黄益肾颗粒 |
| 2.1.2 泻心汤 |
| 2.1.3益气解毒活络中药复方 |
| 2.1.4 葛脾煎剂 |
| 2.1.5 复方益肾胶囊 |
| 2.1.6 百令胶囊 |
| 2.2 天然药物提取物 |
| 2.2.1 中药提取物混合物 |
| 2.2.2 天然药物提取物单体 |
| 2.2.2. 1 雷公藤多苷 |
| 2.2.2. 2 刺五加苷 |
| 2.2.2. 3 人参皂苷Rg1 |
| 2.2.2. 4 大黄素 |
| 2.2.2. 5 葛根素 |
| 3 前景与展望 |
四、单核细胞趋化蛋白-1和Ⅳ型胶原在糖尿病肾病大鼠肾组织中的表达（论文参考文献）
- [1]基于NLRP3炎症小体信号探讨高糖环境下大鼠肾小管上皮细胞炎症因子变化及糖尿病大鼠肾脏纤维化机制[D]. 刘思逸. 南昌大学, 2021(01)
- [2]基于中医象思维探讨肾衰饮干预慢性肾功能衰竭大鼠的机制研究[D]. 张亮. 辽宁中医药大学, 2021(02)
- [3]丹酚酸与丹参酮组分配伍对糖尿病肾病协同效应的研究[D]. 王钦汶. 南京中医药大学, 2021
- [4]金丝桃苷通过靶向miR-499-5p改善STZ诱导的糖尿病肾病作用机制研究[D]. 周静波. 南京中医药大学, 2021(01)
- [5]马里苷单克隆抗体的制备以及抗糖尿病肾病机制研究[D]. 郭艳丽. 新疆医科大学, 2020(08)
- [6]二十碳五烯酸抑制肾小管上皮细胞间质转化及纤维化的机制研究[D]. 危志强. 苏州大学, 2020(06)
- [7]基于PKM2调控M1型巨噬细胞活化途径探讨黄葵素对糖尿病肾病模型肾保护作用的机制研究[D]. 浦强. 南京中医药大学, 2020(01)
- [8]活性维生素D3通过TREM-1调控糖尿病肾病巨噬细胞功能及表型的研究[D]. 赵宇. 东南大学, 2019(05)
- [9]三黄益肾胶囊对早期糖尿病肾病大鼠肾组织NF-κB、MCP-1表达的影响[D]. 路菲菲. 河北中医学院, 2019(01)
- [10]中药及提取物调节单核细胞趋化蛋白1、肿瘤坏死因子-α对糖尿病肾病改善作用[J]. 周本宏,汪静. 中国药师, 2017(03)