一、影响农杆菌介导的水稻遗传转化效率的因素（论文文献综述）
彭小群,王梦龙[1]（2021）在《水稻遗传转化研究进展》文中研究指明水稻遗传转化技术是探究水稻基因功能和开展遗传育种的重要手段。为进一步推动遗传转化技术在水稻中的应用,笔者总结了聚乙二醇（PEG）法、脂质体法、电激法、基因枪法、花粉管通道法和农杆菌介导法等几种常用水稻遗传转化方法,并分析归纳了这些转化方法在实际应用中的优缺点。同时,笔者还重点阐述了农杆菌介导的水稻遗传转化研究进展,指出侵染体系、再生体系和组织培养条件等因素对农杆菌介导的水稻遗传转化影响,并提出农杆菌介导法优化的一些具体措施。
王慧杰[2]（2021）在《三元载体系统的构建及其应用于水稻农杆菌介导的遗传转化研究》文中认为水稻遗传转化技术已成为水稻分子生物学研究不可或缺的研究技术。农杆菌介导法是水稻遗传转化的主流方法,但农杆菌介导法转化水稻具有很强的基因型依赖性,一些顽拗型水稻品种的遗传转化仍然较为困难。本研究以粳稻品种日本晴,籼稻品种明恢86、9311作为遗传转化材料,探究了不同筛选标记基因、不同培养条件、两个胚形态建成基因和三元载体系统对水稻遗传转化效率的影响,建立了一种用于水稻遗传转化的三元载体系统。主要研究结果如下:以日本晴和明恢86成熟胚作为遗传转化材料,探究不同筛选标记基因Hpt、Bar对遗传转化效率的影响。结果显示,Hpt基因在两个品种中的筛选效率均优于Bar基因,且前者遗传转化周期明显短于后者。以明恢86成熟胚为遗传转化材料,探究形态调节基因BBM和WUS2对籼稻成胚效率和遗传转化效率的影响,但最终结果表明本实验中构建的含形态调节基因的载体与普通载体的遗传转化效率无明显差异。以日本晴成熟胚为遗传转化材料,比较含有相同目的基因RFP的双T-DNA载体（单质粒双T-DNA）和三元载体（双质粒双T-DNA）的转化效率。结果表明,目的基因的转化效率在双T-DNA载体系统中高于三元载体系统。而在三元载体系统中,p VS1相较于RK2更加适合作为辅助质粒的复制子。以明恢86、9311成熟胚为遗传转化材料,比较不同培养条件下籼稻遗传转化效率。结果显示,在预分化阶段之前,共培养、恢复、筛选等阶段共28天的连续黑暗培养更加适用于籼稻遗传转化。四种三元载体系统转化明恢86、9311成熟胚愈伤组织。结果表明,三元载体系统引入额外的毒力基因vir提高了农杆菌侵染效率。相较于双元载体,三元载体有效提高了明恢86的遗传转化效率。在9311中,三元载体转化效率仍是不高,最高转化率仅为2.6%,仍需进一步完善。
刘闵豪[3]（2021）在《杜仲ARF基因家族分析与EuARF19.2功能验证》文中指出杜仲是我国特有的经济树种,拥有多种用途。叶片是杜仲资源可持续利用的最佳原材料,杜仲叶片生长发育相关基因的研究对杜仲资源的开发利用具有重要意义。生长素响应因子（Auxin response factor,ARF）是一类能够在叶片生长发育过程中发挥巨大调控作用的转录因子。利用杜仲全基因组测序数据,挖掘杜仲ARF基因家族成员,筛选调控杜仲叶片生长发育的ARF基因进行功能研究,不仅能够填补杜仲ARF基因研究的空白,为杜仲其他基因家族的研究提供借鉴,还能为杜仲叶片生长性状的遗传改良奠定基础。本研究利用杜仲全基因测序数据,鉴定杜仲ARF基因家族的成员,结合杜仲小RNA测序和转录本全长测序信息,通过表达量分析对杜仲ARF基因家族成员进行功能预测,从中选出可能调控杜仲叶片生长发育的关键基因EuARF19.2,构建EuARF19.2植物表达载体,进行拟南芥的遗传转化验证其功能,最后优化杜仲愈伤组织再生体系,构建农杆菌介导的杜仲叶片愈伤组织遗传转化系统,进行EuARF19.2在杜仲的遗传转化。主要研究结果如下:（1）在杜仲基因组中共鉴定出18个杜仲ARF基因,这些EuARFs可以归属到5个亚族中,同亚族的EuARFs蛋白具有相似的理化性质与蛋白结构,可能行使相似的功能。EuARFs的表达分析显示EuARFs在正常生长条件下不同发育阶段（幼嫩和成熟）的器官（根、茎和叶）中均有表达,其中EuARF19.2在叶片中的表达显着高于其他EuARFs,说明EuARF19.2对杜仲叶片生长可能具有重要的调控作用。（2）EuARF19.2表达量与植株叶面积表型的关联性分析显示,EuARF19.2在叶片发育早期的表达与叶片成熟后的叶面积显着正相关,表明EuARF19.2能够调控叶片形态发育,促进叶面积增大。IAA处理下带芽茎段叶片的EuARF19.2表达量分析显示,添加外源IAA,EuARF19.2上调表达,表明EuARF19.2能够响应外源IAA。（3）获得了EuARF19.2的cDNA全长序列,构建了pBI121-EuARF19.2植物表达载体,进行了农杆菌介导的拟南芥遗传转化,通过卡那霉素（Kanamycin,Kan）筛选与PCR验证,最终筛选获得转EuARF19.2 T3代阳性拟南芥植株。T3代阳性转基因植株的表型分析证明EuARF19.2的表达对拟南芥的叶面积增大有促进作用。（4）优化了杜仲叶片愈伤组织再生体系,筛选获得愈伤组织诱导最适导培养基为MS+8.1μmol·L-1 NAA+4.4μmol·L-1 6-BA,诱导率达到100±0%;愈伤组织继代增殖的最适培养基为MS+0.27μmol·L-1 NAA+6.7μmol·L-1 6-BA,增殖系数为304±36%,褐化率为16±4%,继代周期为18～20d;不定芽诱导最适合培养基为3/4MS+0.27μmol·L-1 NAA+4.4μmol·L-1 6-BA,不定芽诱导率为83±10%;芽苗复壮最适培养基为3/4MS+0.054μmol·L-1 NAA+4.4μmol·L-1 6-BA,芽生长长度为2.47±1.33cm。（5）以GUS瞬时表达率为标准评价了转化因子对农杆菌介导杜仲叶片愈伤组织遗传转化效率的影响,获得了最适转化因子组合为:预培养5 d、侵染时间10 min和共培养3 d,筛选培养基为3/4MS+0.054μmol·L-1 NAA+4.4μmol·L-1 6-BA+200mg·L-1Cef+70 mg·L-1Kan。通过获得的遗传转化体系,进行了pBI121-EuARF19.2的遗传转化,获得了4个转pBI121-EuARF19.2抗性芽。PCR分析和GUS组织化学染色都表明目的基因已整合到抗性芽基因组中,表型观察与EuARF19.2表达量的分析推测EuARF19.2的过量表达能够增大杜仲叶面积。
张月[4]（2021）在《星星草（Puccinellia tenuiflora）遗传转化体系的建立》文中指出土壤盐碱化严重影响农业生产力。星星草（Puccinellia tenuiflora）是我国东北松嫩平原广泛分布的优良天然牧草,具有较强的耐盐碱能力,可作为盐碱地治理的先锋植物。对星星草盐碱胁迫应答的生理生态学、蛋白质组学、分子生物学等方面的研究已有一定报道;2020年,星星草全基因组序列测序完成,为解析星星草耐盐碱机制奠定了基础。然而,目前仍缺乏高效的星星草再生与遗传转化体系。本研究以星星草种子为外植体,分析了外植体、基础培养基对愈伤组织诱导的影响,以及植物激素配比与不定芽诱导率的关系,优化了星星草再生体系。继而,利用pANIC 6B质粒和农杆菌EHA105,优化了转化条件、共培养时间、潮霉素筛选压等条件对转化效率与抗性芽产生的影响。主要研究结果如下:（1）优化了星星草愈伤组织再生体系。使用含有4 mg·l-1 2,4-D的MS培养基对星星草种子、叶片、茎段进行愈伤组织诱导,确定了最适外植体为种子。对MS培养基和N6培养基中种子形成的愈伤组织诱导率进行了比较,结果表明MS为最适培养基。同时,对植物激素配比的分析表明,2 mg·l-1 KT与0.5 mg·l-1 6-BA结合使用对不定芽的诱导率最高（30%）;不定芽在不含外源植物激素的1/2 MS培养基中可生出根系。此外,再生植株经7天炼苗处理后,移栽至无菌混合土中易成活。（2）建立了星星草遗传转化体系。转化条件为愈伤组织浸泡在农杆菌侵染液中真空和超声处理,共培养3天,潮霉素筛选压为10 mg·l-1;转化后的愈伤组织在筛选培养基中可分化出最多的抗性芽,转化效率高达18.6%。
王诗雨[5]（2021）在《水稻愈伤分化基因GR9的功能研究》文中提出通过胚性愈伤组织的诱导和分化获得完整植株是水稻无性繁殖的一种重要途径,对于水稻转基因技术的应用尤其重要。虽然水稻遗传转化体系已经比较成熟,但不同水稻品种,尤其是亚种间的差异还是很大。粳稻遗传转化效率一般较高,而籼稻普遍转化效率偏低。主要表现在籼稻愈伤在分化过程中会褐化,死亡,难以再生成苗,但其中的分子机制并不清楚。为探索不同水稻亚种间遗传转化效率的差异及其影响的分子机制,本研究前期利用一套水稻染色体片段替换系（以籼稻9311为供体,粳稻日本晴为受体）为研究材料,在水稻9号染色体上分离到一个影响愈伤分化的QTL位点q GR9,并在此候选区间内鉴定到一个可能的候选基因GR9。序列分析结果表明:无论是编码区还是上游的启动子区,GR9基因在两个亲本间（籼稻9311和粳稻日本晴）均存在一些差异。本论文通过反向遗传学的方法对GR9在水稻愈伤分化过程中的生物学功能进行分析,同时利用分子生物学和生物化学等方法寻找该基因参与调控的信号通路和其所在的遗传位置,获得了以下结果:1、与籼稻愈伤分化效率相关的主效位点q GR9定位于9号染色体的一个约2.4Mb区间内,且籼型q GR9位点抑制水稻愈伤分化。本研究前期的结果显示,影响籼稻分化效率的主效QTL位点定位于9号染色体,我们将含有q GR9位点的大片段替换系与背景亲本日本晴回交后自交,构建了含有q GR9位点的次级分离群体。通过分子标记鉴定获得一系列候选区间内发生交换的小片段替换系。通过对含小片段替换系的分化试验,将q GR9定位于9号染色体的一个约2.4Mb区间内。且含有籼型q GR9的替换系分化效率显着低于日本晴亲本及不含籼型q GR9的替换系,表明籼型q GR9不利于水稻愈伤分化,导入日本晴后可显着抑制愈伤的分化效率。2、GR9基因可能是一个影响水稻愈伤分化的负调控因子。在进一步构建精细定位群体的同时,我们利用基因编辑的手段对候选区间内的多个潜在的候选基因进行敲除。结果显示,其中一个转录因子基因在粳稻日本晴背景下敲除后愈伤的分化效率由受体对照的63%上升到86%。表明该基因可能为q GR9的最佳候选基因,我们将其命名为GR9。同时,我们获得了GR9在粳稻Dongjin背景下的T-DNA插入突变体材料和在粳稻ZH11背景下的RNAi材料,结果显示,无论是该基因的T-DNA插入突变体还是RNAi材料,其愈伤分化效率都明显高于其野生型对照。反之,利用组成型启动子Ubi对GR9基因进行过量表达时,水稻愈伤分化严重受阻,难以获得转基因植株。这些结果暗示GR9基因负调控水稻愈伤的分化。3、GR9可能是导致籼稻9311难以转化的重要基因之一,其启动子区和编码区序列与日本晴GR9的差异均可影响水稻愈伤分化的效率。我们将籼稻9311型GR9和日本晴GR9基因组DNA(GR99311,GR9NIP)分别转化插入缺失突变体材料gr9-1,获得了分别含GR99311、GR9NIP的转化系GR9-9311和GR9-NIP。测序结果显示:9311的GR9序列跟日本晴序列相比编码区存在一个SNP,由G替换为C,并导致氨基酸由Val变为Leu。启动子区存在多个碱基的替换,缺失与插入。将日本晴GR9外显子中的SNP突变成9311型GR9,构建成GR9-Mutant,同时保持日本晴和9311的基因编码区不变,但将两种GR9等位基因的启动子进行了互换,构建成GR9-P9CN和GR9-PNC9,将上述构建分别转化gr9-1,并获得了相应的遗传转化材料。筛选这些转基因互补材料的纯合株系,并同时进行愈伤分化实验,结果显示,GR9NIP转化系的分化效率最高,而其他转基因系的分化效率低于GR9NIP,表明9311启动子区和编码区序列差异均可影响水稻愈伤分化的效率。.4、籼型GR9对于水稻愈伤分化具有明显的抑制作用,而粳型GR9在自身启动子的驱动下对于水稻愈伤分化可能具有一定的促进作用,且粳型GR9相对于籼型GR9表现为为显性。我们分别将日本晴和9311的GR9基因组片段与HA融合构建了GR99311:HA和GR9NIP:HA载体并转化日本晴;同时,将GR9NIP:HA转入含有籼型GR9的替换系中,筛选获得纯合转基因株系,并与它们各自的受体亲本进行分化效率的比较。结果显示:含有GR9NIP:HA的转基因系分化效率显着高于对照日本晴;而含有GR99311:HA转基因系的分化效率显着低于对照日本晴;将GR9NIP:HA转入含有籼型GR9替换系后,水稻愈伤分化效率显着上升,说明不同亚型的GR9对于水稻愈伤分化作用不同,粳型GR9相对于籼型表现为为显性。5、GR9可能通过ADA2和GRF4影响水稻愈伤分化。酵母双杂交结果表明GR9与愈伤分化相关基因ADA2存在相互作用;而双荧光系统实验结果显示GRF4对GR9的功能具有一定的抑制作用,且对粳型GR9的作用更为明显,而对籼型GR9的抑制则相对较小。GRF4可能是通过抑制GR9的功能从而增强愈伤的分化能力。综上,我们的结果表明GR9参与水稻愈伤分化过程。籼型GR99311对水稻愈伤分化具有明显的抑制作用,而粳型GR9NIP对水稻愈伤分化具有一定的促进作用。GR9可能是导致籼稻9311难以转化的重要基因之一,其启动子区和编码区序列与日本晴GR9的差异均可影响水稻愈伤分化的效率。GR9对水稻愈伤分化的影响可能通过ADA2和GRF4等水稻再生相关基因实现。
陈冰[6]（2020）在《谷子基因编辑体系的建立及香味基因SiBADH2突变体的获得》文中进行了进一步梳理谷子（Seteria italica）,是世界上最古老的的农作物之一,拥有大量的有益性状,如抗旱性、耐盐性、耐贫瘠性等,去壳后的谷子俗称小米,由于其含有丰富的营养物质,备受人们的青睐。随着人们生活水平的提高,对谷子的品质的要求也有所提高。然而,谷子遗传转化体系是一个世界性难题,到目前国内外还没有建立一个高效的遗传转化体系。本论文以谷子Ci846为研究材料,利用农杆菌介导的方法,建立了一套高效的谷子转化体系。率先在谷子中建立利用成熟的CRISPR/Cas9技术敲除的体系,以水稻香味基因OsBADH2的同源基因SiBADH2为例,成功地在谷子中实现了对SiBADH2基因的敲除。具体研究内容如下:1.针对谷子遗传转化效率低的问题,本论文对谷子转化体系进行了优化,经多次平行对比试验,筛选最佳的处理时间,采用70%的乙醇灭菌1 min,再用20%的次氯酸钠溶液灭菌5 min,在此条件下的染菌率平均为0.52%,发芽率平均为99.83%;选择MS培养基作为基础培养基;培养基中需要添加CuSO4,ZnSO4与2 mg/L 2,4-D,不需要添加KT、脯氨酸与AgNO3;在选择培养基中加入40 mg/L Hyg可提高抗性愈伤率;分化培养基中,可将激素2,4-D（1 mg/L）与KT（1 mg/L）搭配使用;侵染农杆菌浓度为OD600=0.4～0.6,侵染时间为40 min,共培养4天。2.构建3个敲除SiBADH2基因的CRISPR/Cas9敲除载体,即构建3个敲除载体:pRLG103-BADH2-1、pRLG103-BADH2-2与pRLG103-BADH2-3,每个载体含有2个敲除靶点。3.经过遗传转化,仅pRLG103-BADH2-3载体获得22株再生植株,可能因体细胞变异原因,最终收获3株种子。对其进行测序鉴定,获得一批含有载体骨架和无载体骨架的后代。其中获得了2个无载体骨架纯合敲除株系。#20纯合突变体距离ATG 97 bp的位置后缺失99个碱基;#18纯合突变体距离ATG 196 bp的位置插入了一个碱基C。下一步计划评估这2个株系的农艺性状及代谢物的含量。
赵强[7]（2020）在《外源基因DNA甲基化对农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化的影响研究》文中研究表明转基因技术具有推动农业生产发生革命性变化的潜力。农杆菌介导的遗传转化法是目前应用最为广泛的大豆遗传转化方法。但是,与其他的物种相比较,低转化效率一直是大豆基因功能研究中的一个瓶颈,制约了转基因大豆的商业化发展。并且,大豆的遗传转化效率具有很强的基因型依赖性,这限制了遗传转化技术在具有良好性状的商业化大豆品种中的应用。本研究采用不同大豆品种进行农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化和大豆原生质体细胞转化试验,分析了不同大豆品种转化早期阶段外源基因表达差异及其调控机制对大豆抗性丛生芽诱导效率的影响,以期提高大豆的抗性丛生芽再生效率,得到以下主要结果:（1）筛选得到高/低遗传转化效率大豆品种。利用农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化体系对17个大豆品种进行遗传转化试验,共获得168株转基因大豆植株。根据不同大豆品种的遗传转化效率,筛选得到大豆品种东农50（DN50）,Williams 82（Wm82）,Bert（Br）和沈农9（SN9）为高遗传转化效率大豆品种（转化效率高于5.5%）,而Kottman（Kt）,General（Gr）,中黄35（ZH35）和辽豆16（LD16）为低遗传转化效率大豆品种（转化效率低于1%）。在农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化试验中,当培养基中含有筛选剂(5mg·L-1草铵膦)时,高遗传转化效率大豆品种的抗性丛生芽诱导效率达到75%以上,而低遗传效率大豆品种的抗性丛生芽诱导效率低于20%。并且,不同大豆品种的芽伸长效率（约80%）和生根效率（约85%）没有显着的差异。（2）建立并优化大豆原生质体细胞分离、纯化和转化表达体系。以28℃黑暗环境下培养至真叶完全展开后4天的大豆叶片为材料;使用含有0.4M甘露醇的CPW溶液对组织材料进行预处理30min;使用含有1.6%纤维素酶,0.8%离析酶和1.5%的果胶酶的酶解液于黑暗条件下130r/min×28℃振荡酶解10小时;采用300目细胞筛与100g离心的方法纯化大豆原生质体细胞,得到的大豆原生质体细胞的产量约为1.12×107个·g·FW-1,原生质体细胞活力均达到92%以上;使用20%PEG4000介导法将植物表达载体pEarleyGate 104和pER8-GFP分别转化进入大豆原生质体细胞,以EYFP/GFP作为荧光报告蛋白,在转化后第2天（2DAT）观察到不同大豆品种转化效率（荧光细胞占比）均达到75%以上。（3）高/低遗传转化效率大豆品种原生质体细胞的外源基因表达存在显着差异。在大豆原生质体细胞中,外源基因的转化效率随着培养时间内的延长呈现先上升后下降的趋势,在2DAT时达到最大值,且在1-2DAT时,不同大豆品种原生质中外源基因的转化效率之间没有显着的差异;而在3DAT时,低遗传转化效率大豆品种的外源基因转化效率和基因表达水平显着的低于高遗传转化大豆品种。（4）内源蛋白酶水解途径不是造成大豆原生质体中外源基因表达水平降低的主要原因。与对照相比较,向原生质体细胞培养液中分别添加外源蛋白酶抑制剂MG132（20μM）、AEBSF（50μM）和MG115（200μM）对于3DAT时外源基因的转化效率和基因表达水平没有显着的影响。（5）甲基化抑制剂5-Azac显着的影响外源基因的表达水平。与2DAT相比较,3DAT时,低遗传转化效率大豆品种甲基化酶编码基因MET1的表达水平显着上升,且显着高于高遗传转化效率大豆品种。同时,低遗传转化效率大豆品种外源基因EYFP的启动子区和编码区的甲基化水平显着的显着高于高遗传转化效率大豆品种。10μM的甲基化抑制剂5-Azac处理能够显着的降低低遗传转化效率大豆品种中外源基因的启动子及编码区的DNA甲基化程度,并提高外源基因的表达水平。（6）甲基化抑制剂显着的增加了低遗传转化效率大豆品种的抗性丛生芽诱导效率。在农杆菌介导的大豆遗传转化体系中,在抗性丛生芽诱导1周后,向培养基中加入10μM的甲基化抑制剂5-Azac能够显着的提高大部分大豆品种（19/22）的抗性丛生芽的筛选效率,特别是对于低遗传转化效率大豆品种的促进效果更为显着。综上所述,在本研究中低遗传效率大豆品种中外源基因启动子及编码区较高程度的DNA甲基化水平,抑制了外源基因的表达,并导致了抗性丛生芽诱导效率的低下。甲基化抑制剂5-Azac能够有效的降低外源基因的DNA甲基化程度,并提高低遗传转化效率抗性丛生芽的诱导效率。由于抗性丛生芽的再生是农杆菌介导的大豆遗传转化中的关键步骤,这些结果为提高低遗传转化效率大豆基因型的遗传转化效率提供了新的途径,有利于克服大豆遗传转化困难的问题。
唐旭[8]（2020）在《基于CRISPR-Cas的高效水稻基因组编辑系统构建及应用》文中研究指明水稻（Oryza sativa）是世界上最重要的粮食作物之一,也是重要的结构及功能基因组研究模式植物。对于水稻功能基因组基础研究及种质创新应用实践而言,有效获得目的基因可靠突变体材料是后续工作能否顺利开展的关键要素,但水稻天然突变体材料的发现、鉴定十分有限,难以满足实际需求。基因组编辑一直是生物学研究的前沿与热点领域,近年来源自（古）细菌基因组的CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）-Cas（CRISPRassociated）基因编辑工具的发展使生物学及其相关学科的基础研究及应用实践发生了革命性变化,相关成果多次被Science、Nature评选为“年度科学突破”（Science:2012,2013,2015）及“杰出研究”（Nature:2019）。研究者先后从不同细菌基因组中挖掘鉴定了CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a（Cpf1）、CRISPR-Cas12b（C2c1）等多种具备不同基因组定向编辑特性的多样CRISPR-Cas系统成员,有效拓展了CRISPR-Cas系统的基础及应用研究范围。尽管作为使用最为广泛的CRISPR-Cas系统成员,Sp Cas9的相关研究工作已经相对较多,但其在植物中的编辑效率、物种适用性、多基因共编辑等关键分子操作依然需要进一步的提质增效。同时,CRISPR-Cas12a作为新报道的2类（class 2）CRISPR-Cas系统成员,在核酸酶蛋白结构、向导RNA构成及核酸分子识别剪切特性等方面相较Cas9有显着不同,显示了其作为基因组编辑工具的巨大潜力。尽管前期相关研究已经证明CRISPR-Cas12a可以作为基因组定向编辑有效工具针对人源及相关动物细胞进行分子操作,但在植物基因组编辑中的编辑效率、编辑特异性、遗传稳定性、适用范围等还没有得到可靠证实。基于以上植物CRISPR-Cas基因组编辑系统创制、升级、应用及水稻定向突变体编辑材料创制的研究现状,本研究围绕CRISPR-Cas9及CRISPR-Cas12a植物基因组编辑新工具构建、活性提升、多位点共编辑有效实现、编辑特异性可靠评价等核心科学问题及关键技术瓶颈展开工作,主要研究结果如下:1、基于序列特异性自剪切核酶,设计了单转录单元CRISPR-Cas9（single transcript unit CRISPR-Cas9,STU-CRISPR 1.0）基因组编辑系统,针对水稻内源基因实现了有效编辑:单位点编辑工作中,农杆菌介导的水稻遗传转化再生T0单株编辑效率为53.8%-100%,其中双等位基因编辑效率为30.8%-77.8%;双位点共编辑工作中,农杆菌介导的水稻遗传转化再生T0单株编辑效率为66.7%-86.2%,其中双等位基因编辑效率为22.2%-89.78%。进一步工作中,分别结合Cas9切口酶、XVE诱导启动系统,证实了STU CRISPR-Cas9系统切口酶编辑及诱导编辑的可行性。同时,基于拟南芥、烟草测试结果,说明STU CRISPRCas9可被广泛应用于不同植物材料基因组编辑中,其编辑效率与Pol II启动子直接相关;2、在STU-CRISPR 1.0系统有效实现的基础上,进一步升级开发了STU-CRISPR2.0基因组编辑新系统。实验结果表明,不同STU-CRISPR 2.0编辑系统均可有效实现目标位点碱基缺失及插入编辑,其中STU-Cas9-Csy4及STU-Cas9-t RNA系统相对STU-Cas9-RZ系统显示了一定程度的编辑活性提升。同时,STU-CRISPR 2.0基因组编辑系统可高效实现针对1-6个目标位点的植物基因组编辑,其中STU-Cas9-t RNA系统在编辑水稻基因组6个位点时,47.4%的T0植株在6个位点均可检测编辑事件发生,值得注意的是10.5%的T0植株在6个位点全为双等位基因共编辑类型。进一步的工作中,基于STU-CRISPR 2.0系统,通过优化r APOBEC1、Pm CDA1胞苷脱氨酶单元,有效实现了C to T碱基编辑。其中稳定转化实验中,STU n Cas9::Pm CDA1可以实现38.9%-68.8%的C to T碱基编辑效率,并且检测到了-1 bp处的C to T单碱基编辑事件;3、针对CRISPR-Cas12a核心元件结构及功能特性,基于ZmUbi1驱动RZ-crRNARZ表达单元的设计策略在水稻中实现了CRISPR-Cas12a核酸酶介导的高效基因组编辑,成功揭示了其植物基因组编辑主要特征:1)编辑事件以6-13 bp的多碱基缺失为主;2)编辑事件主要发生在5’-TTTV-3’PAM位点远端13-22 bp区域内;3)CRISPR-Cas12a核酸酶具备良好的编辑特异性。在水稻稳定植株中,针对Os PDS、Os DEP1、Os ROC5共4个编辑位点处Lb Cas12a的编辑效率为100%,且几乎所有编辑事件均为双等位基因共编辑,同时不存在嵌合体编辑事件。Cas12a核酸酶在编辑活性上存在温度敏感性,但其编辑事件分布特征不会随温度变化而改变。此外,进一步评价了STU-CRISPR策略在Cas12a编辑系统中的适用性,实现了基于STU CRISPR-Cas12a的单位点、多位点基因编辑;4、针对不同类型水稻对照材料及CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a编辑T0、T1代水稻材料进行全基因组重测序（whole genome sequencing,WGS）分析,进行CRISPR-Cas介导的植物基因组编辑特异性定量评价,结果表明:1)CRISPRCas9、CRISPR-Cas12a骨架载体再生植株对照材料全基因组变异事件绝对数量、基因组分布特征与经组培再生及农杆菌侵染再生植株对照材料无显着差异;2)水稻T0代编辑材料中,CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a核酸酶及对应sg RNA、cr RNA的表达并没有增加单核苷酸变异（single nucleotide variant,SNV）、插入-缺失变异（insertion and deletion,Indel）数量;3)不同CRISPRCas表达载体T-DNA插入拷贝数目及单sg RNA、双sg RNA表达载体转化水稻T0代编辑材料间,WGS检出的基因组变异事件绝对数量、分布特征没有显着差异;4)CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a核酸酶编辑效率的不同并不与具体T0代编辑材料基因组变异的产生存在相关性;5)所有CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a编辑事件均可稳定遗传至T1代植株;6)T1代植株中新增变异事件的绝对数量、分布特征对比野生型材料实生苗世代传递产生的基因组自发变异未显示差异;5、基于Prime Editing（PE）实施策略,构建了多类型植物PE基因组编辑新系统:1)PPE3-V01系统中,检测到较低但明确的基于PE策略的编辑活性（0.05%-0.15%）,此外还存在较高比例的长片段缺失编辑事件;2)PPE3b-V01系统将最高编辑效率较PPE3-V01提升3倍,进一步实现了编辑位点处多碱基、不连续类型的复杂编辑;3)经基因工程优化后的PPE2-V02及PPE3-V02系统有效提升了水稻内源基因PE编辑效率,最高PE编辑位点效率为1.55%,但不同位点PE编辑效率明显受PBS、RT设计参数影响,同时PPE2-V02及PPE3-V02系统明显降低了非PE策略的删除编辑副产物。
艾丽曼·阿布来孜[9]（2020）在《农杆菌介导的玉米高效遗传转化体系的建立及CgbHLH001转基因玉米株系的鉴定》文中研究说明玉米是世界重要的粮食、饲料作物,也是现代食品、医药和化学工业的重要原料。而干旱则是影响玉米生长发育并导致产量和质量下降的最主要的环境因素。传统玉米育种技术由于周期长且难以维持玉米的产量等问题,一直无法满足社会需求。因此利用转基因技术选育耐旱玉米新品种具有重要的意义。农杆菌介导的基因转化法是目前广泛应用于玉米等农作物的遗传转化方法,与其他转基因方法相比具有成本低、外源基因单拷贝插入、稳定遗传等优点。基于此,本研究拟通过农杆菌介导法将来自盐生植物灰绿藜的耐旱转录因子CgbHLH001（碱性螺旋环螺旋转录因子）基因转入优良玉米自交系中,同时对遗传转化体系的主要影响因素进行优化,旨在建立高效稳定的农杆菌介导的玉米遗传转化体系,并创制耐旱转基因玉米新种质,为选育耐旱玉米品种、加快我国转基因玉米研究与产业化进程提供依据。本研究主要获得了如下研究结果:1.不同基因型玉米幼胚诱导愈伤组织实验结果表明,本实验选取的四个玉米自交系基因型间形成愈伤的能力差异不大,各玉米自交系幼胚均能诱导出初级愈伤组织。诱导愈伤组织最适2,4-D浓度为2.0或2.5 mg/L;最适分化培养基为MS+0.5 mg/L VB1（维生素B1）+0.5 g/L CH（水解酪蛋白）+30 g/L蔗糖+1.38 g/L L-pro（L-脯氨酸）+4 mg/L 6-BA;最适生根培养基为1/2 MS+30 g/L蔗糖+0.5 mg/L IBA;筛选抗性愈伤组织的草铵膦（PPT）临界浓度为9 mg/L;筛选转化苗的PPT临界浓度为0.8 g/L。2.基于玉米幼胚的分化体系进一步优化了农杆菌介导的遗传转化体系并获得了抗逆基因CgbHLH001的转基因植株。分别转化了三种植物表达载体:CgbHLH001基因过表达载体、CgbHLH001基因干扰载体以及空载体,结果显示,当农杆菌菌液OD600=0.6,浸染时间25 min时得到自交系JH089转化过表达载体的较佳条件,该条件下获得的再生植株经PCR鉴定获得1株CgbHLH001过表达的JH089株系;当农杆菌菌液OD600=0.8,浸染时间15-20min时得到自交系JH089转化干扰载体的较佳条件,该条件下共获得3株PCR阳性的CgbHLH001 RNAi的JH089株系;当农杆菌菌液OD600=0.8,浸染时间30 min时得到自交系3604转化干扰载体的较佳浸染条件,该条件下获得1株PCR阳性的CgbHLH001 RNAi的新自3604株系。实验结果表明,不同玉米自交系的遗传转化效率有明显差异,其中自交系JH089较容易获得转化植株。3.利用农杆菌介导对玉米自交系JH089的种子萌动胚进行遗传转化条件的优化。结果显示,浸染时间和浸染的菌液浓度对出苗率均有一定的影响,合理的菌液浓度和浸染时间的组合对提高出苗率及转化率具有重要作用。与此同时,对玉米自交系JH089也进行了茎节愈伤组织的诱导,其愈伤诱导的最佳培养基为MS+0.5 mg/L VB1+0.5 g/L CH+30 g/L蔗糖+1.38 g/L L-pro+3.4mg/L Ag NO3+2.5 mg/L 2,4-D。
苏佩佩[10]（2019）在《小麦组织特异性启动子的筛选、功能分析及应用研究》文中提出小麦（Triticum aestivum L.）是世界第二大粮食作物,小麦籽粒作为人类重要的主食之一,是全球超过35%的人类每日所需蛋白质和热量的主要来源。植物组织特异性表达基因和启动子研究一方面有助于预测基因的功能,深入了解植物生长发育过程中基因的表达调控规律,另一方面启动子更是植物基因工程研究的重要工具。但单子叶植物特别是小麦中组织特异性基因和启动子的研究远远落后于其他禾本科作物,比如水稻。本文对小麦组织特异性基因及启动子进行了筛选和分析,利用组织特异性启动子构建了雄性不育系,并尝试利用小麦组织特异性启动子创建小麦无损伤可视化筛选方法;另外还在水稻中分离鉴定了小麦花粉特异性表达基因Ta PSG076的同源基因Os PSG076的启动子,构建了用于Os PSG076基因功能验证的植物表达载体并得到了转基因水稻株系。主要研究结果如下:（1）分析了NCBI公共数据库中小麦胚芽鞘、根、叶、雌蕊、雄蕊、胚、和胚乳七个组织中基因表达的芯片数据,共发现了604个探针代表的基因表现出组织特异性特征。进一步将其中的330个基因进行了小麦染色体定位,发现具有相同组织特异性的基因往往成簇分布在染色体上,并且有些基因的序列被定位在不同的染色体上呈现多拷贝现象。（2）为了验证芯片数据分析结果的可靠性,利用RT-sq PCR和RT-q PCR方法证实了其中36个候选基因表达的组织特异性,实验结果与芯片数据表现出高度一致性。在此基础上,构建了p Col1::GUS,p Root2::GUS和p Leaf1::GUS的植物表达载体,通过农杆菌介导的转化技术,瞬时侵染小麦胚芽鞘,证明Ta Col1启动子可以驱动gus基因在小麦胚芽鞘中瞬时表达。同样采用农杆菌转化技术,获得了p Root2::GUS和p Leaf1::GUS的转基因拟南芥植株。经GUS组织化学检测,证明Ta Root2启动子在拟南芥中表现为根特异性调控模式,而Ta Leaf1启动子在拟南芥叶片中优势表达。（3）利用候选的小麦根特异性启动子Ta Root7和已报道的1Dx5胚乳特异性启动子,分别构建p Root7::Ds Red和1Dx5::Ds Red表达载体,利用基因枪转化,获得了转基因小麦株系,并建立了小麦无损伤可视化筛选方法。（4）利用本实验室克隆鉴定的小麦花粉特异性启动子Ta PSG076构建了Ta PSG076::Barnase（p14B）表达载体,利用基因枪转化,获得了转基因小麦株系,用以创制小麦雄性不育系。（5）基于本实验室分离鉴定的小麦花粉特异性启动子Ta PSG076,分离鉴定了水稻中的同源基因Os PSG076的上游启动子,构建了987 bp该启动子序列的表达载体Os PSG076::GUSplus,利用农杆菌介导的转化技术进行水稻的遗传转化,获得了转基因水稻株系。经过GUS组织化学染色发现,Os PSG076启动子在水稻的花粉中特异表达,且表达强度很高,证实Os PSG076启动子是水稻花粉特异性启动子。（6）构建了Os PSG076基因的过表达（OE）、RNA干扰（RNAi）、基因编辑（CRISPR/Cas9）植物表达载体并获得了水稻转基因株系。综上所述,本文通过高通量分析鉴定了小麦中七个组织的特异性基因,这些结果有助于了解相关未知基因的功能,为小麦组织特异性启动子的挖掘提供了新的资源。对其中三个启动子进行了功能验证,并进行了小麦组织特异性启动子的应用研究。此外,还分离鉴定了一个水稻花粉特异性基因启动子Os PSG076,并获得了可对Os PSG076基因进行功能验证的水稻转基因材料。这些结果证实了本文中组织特异性启动子筛选方法的可行性,及组织特异性启动子的潜在应用价值。
二、影响农杆菌介导的水稻遗传转化效率的因素（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、影响农杆菌介导的水稻遗传转化效率的因素（论文提纲范文）
（1）水稻遗传转化研究进展（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 常见水稻遗传转化方法 |
| 1.1 PEG法 |
| 1.2 电激法 |
| 1.3 脂质体法 |
| 1.4 基因枪法 |
| 1.5 花粉管通道法 |
| 1.6 农杆菌介导法 |
| 2 农杆菌介导法在水稻中的研究 |
| 3 农杆菌介导的水稻遗传转化影响因素 |
| 3.1 侵染体系对农杆菌介导的遗传转化影响 |
| 3.2 再生体系和组织培养对农杆菌介导的遗传转化影响 |
| 3.3 其他因素对农杆菌介导的遗传转化影响 |
| 4 展望 |
（2）三元载体系统的构建及其应用于水稻农杆菌介导的遗传转化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 农杆菌侵染机制 |
| 1.2 农杆菌介导水稻遗传转化研究进展 |
| 1.3 影响农杆菌转化水稻的几个关键因素 |
| 1.3.1 基因型 |
| 1.3.2 外植体 |
| 1.3.3 外源添加物 |
| 1.3.4 筛选标记 |
| 1.3.5 农杆菌菌株及载体系统 |
| 1.4 三元载体系统 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 受体植物材料 |
| 2.1.2 菌株与载体 |
| 2.2 化学试剂与酶类 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 大肠杆菌DH5α感受态制备及转化 |
| 2.3.2 农杆菌感受态的制备及转化 |
| 2.3.3 农杆菌Ti质粒的提取 |
| 2.3.4 质粒DNA酶切 |
| 2.3.5 DNA片段回收 |
| 2.3.6 PCR反应及产物电泳检测 |
| 2.3.7 连接反应 |
| 2.3.8 水稻遗传转化与筛选 |
| 2.3.9 水稻DNA的提取 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 水稻LAZY1基因敲除载体p1300Cas9-lazy1的构建 |
| 3.2 Bar基因为筛选标记的载体构建 |
| 3.3 形态调节基因载体的构建 |
| 3.4 双T-DNA与三元载体的构建 |
| 3.5 三元载体系统载体构建 |
| 3.6 不同筛选标记对水稻遗传转化的影响 |
| 3.7 形态调节基因的籼稻遗传转化 |
| 3.8 双T-DNA位于同一载体和不同载体的遗传转化效率比较 |
| 3.9 不同培养条件下的籼稻遗传转化 |
| 3.10 三元载体系统的籼稻遗传转化 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 水稻遗传转化效率的提升 |
| 4.2 三元载体系统中的辅助质粒 |
| 第五章 全文总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 附录 B |
| 附录 C |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）杜仲ARF基因家族分析与EuARF19.2功能验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 生长素响应因子(ARF)研究进展 |
| 1.2.1 ARF的作用机制 |
| 1.2.2 ARF的蛋白结构 |
| 1.2.3 ARF对植物生长发育的作用 |
| 1.2.4 miR160/miR167对ARF的调控 |
| 1.3 植物基因的功能验证 |
| 1.4 杜仲的遗传转化 |
| 1.4.1 植物遗传转化的方法 |
| 1.4.2 杜仲的组织培养及农杆菌介导的遗传转化研究进展 |
| 1.5 本研究的目的意义与主要内容 |
| 1.5.1 本研究的目的意义 |
| 1.5.2 主要研究内容 |
| 1.6 技术路线 |
| 第二章 杜仲ARF基因家族分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验主要仪器与试剂 |
| 2.1.3 杜仲ARF基因家族的鉴定 |
| 2.1.4 杜仲ARF基因家族系统进化树分析 |
| 2.1.5 杜仲ARF基因家族的生物信息学分析 |
| 2.1.6 miRNA靶基因结合位点预测 |
| 2.1.7 EuARFs基因表达分析 |
| 2.1.8 RNA的提取 |
| 2.1.9 反转录与qRT-PCR |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 EuARF蛋白的鉴定及理化性质 |
| 2.2.2 EuARF蛋白的系统进化 |
| 2.2.3 EuARFs的基因结构 |
| 2.2.4 EuARFs蛋白的保守结构域和基序 |
| 2.2.5 EuARF基因受miR160/167 调控的靶位点 |
| 2.2.6 EuARFs和 eu-miR160/167 的表达模式 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 EuARFs的进化 |
| 2.3.2 EuARFs的蛋白结构 |
| 2.3.3 miRNA的调控预测 |
| 2.3.4 EuARFs的功能预测 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 杜仲EuARF19.2 的克隆与功能分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验主要仪器和试剂 |
| 3.1.3 杜仲杂交后代叶片数据测定 |
| 3.1.4 杜仲杂交后代叶片的EuARF19.2 表达分析 |
| 3.1.5 IAA处理下杜仲萌发芽的EuARF19.2 表达分析 |
| 3.1.6 RNA提取与qRT-PCR分析 |
| 3.1.7 EuARF19.2 cDNA全长的克隆 |
| 3.1.8 农杆菌介导的拟南芥遗传转化 |
| 3.1.9 T3代拟南芥阳性转基因植株叶片的表型测定与EuARF19.2的表达量分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 EuARF19.2 表达与植株叶面积的关联性 |
| 3.2.2 EuARF19.2对IAA的响应 |
| 3.2.3 EuARF19.2 表达载体的构建 |
| 3.2.4 T3 代阳性拟南芥转基因植株的获得 |
| 3.2.5 T3 代拟南芥转基因阳性植株叶片的表型与EuARF19.2 表达量 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 杜仲叶片生长发育模式 |
| 3.3.2 EuARF19.2对IAA的响应 |
| 3.3.3 EuARF19.2 对叶片生长发育的调控 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 杜仲叶片愈伤组织遗传转化体系的建立与EuARF19.2的遗传转化 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验主要仪器与试剂 |
| 4.1.3 叶片愈伤组织再生体系优化 |
| 4.1.4 愈伤组织抑菌剂和抗生素敏感性试验 |
| 4.1.5 农杆菌介导的杜仲叶片愈伤组织遗传转化转化因子试验 |
| 4.1.6 抗性芽的筛选与检测 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 愈伤组织诱导最适培养基 |
| 4.2.2 愈伤组织增殖的最适培养基 |
| 4.2.3 不定芽诱导与复壮最适培养基 |
| 4.2.4 头孢霉素与卡那霉素对不定芽诱导的影响 |
| 4.2.5 农杆菌介导的杜仲叶片愈伤组织遗传转化的转化因子 |
| 4.2.6 抗性芽的获得 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 杜仲叶片愈伤组织再生体系 |
| 4.3.2 影响杜仲叶片愈伤组织遗传转化的因子 |
| 4.3.3 转EuARF19.2 杜仲抗性芽 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 有待进一步研究的问题 |
| 参考文献 |
| 缩略词 |
| 附录 |
| 附表2-1 AtARF、OsARF与PeARF的蛋白序列号 |
| 附表3-1 一号家系2015 年叶片数据 |
| 附表3-2 一号家系2016 年叶片数据 |
| 附表3-3 一号家系2017 年叶片数据 |
| 附表3-4 一号家系2018 年叶片数据 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）星星草（Puccinellia tenuiflora）遗传转化体系的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 星星草研究进展 |
| 1.1.1 引言 |
| 1.1.2 星星草概述 |
| 1.1.3 星星草的形态特征 |
| 1.1.4 星星草的生长条件 |
| 1.1.5 星星草的主要价值 |
| 1.1.6 星星草盐碱应答机制的研究进展 |
| 1.1.7 星星草全基因组序列研究进展 |
| 1.2 禾本科作物遗传转化研究进展 |
| 1.2.1 农杆菌概述 |
| 1.2.2 农杆菌转化法的原理 |
| 1.2.3 影响农杆菌介导遗传转化的主要因素 |
| 1.2.4 禾本科作物遗传转化研究进展 |
| 1.2.5 禾本科作物遗传转化存在的问题 |
| 1.3 建立星星草遗传转化体系的意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株和载体 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 主要培养基的配制 |
| 2.1.5 激素、抗生素母液、GUS染液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 星星草再生体系的建立方法 |
| 2.2.2 星星草遗传转化体系的建立方法 |
| 2.2.3 影响农杆菌转化效率的因素 |
| 2.2.4 分子生物学检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 星星草再生体系的建立 |
| 3.1.1 星星草愈伤组织诱导外植体类型及基础培养基的确定 |
| 3.1.2 星星草愈伤组织诱导不定芽最优培养基的确定 |
| 3.2 星星草遗传转化体系的建立 |
| 3.2.1 潮霉素筛选压的确定 |
| 3.2.2 最适农杆菌转化条件及共培养天数的确定 |
| 3.2.3 农杆菌介导的遗传转化及植株再生 |
| 3.3 分子生物学检测 |
| 3.3.1 转基因星星草GUS基因的PCR检测 |
| 3.3.2 GUS表达的组织化学检测 |
| 3.3.3 转基因星星草叶片中GUS基因实时荧光定量PCR |
| 4 讨论 |
| 4.1 星星草再生体系及遗传转化体系建立的特异性 |
| 4.2 星星草遗传转化体系中植物受体的选择 |
| 4.3 星星草遗传转化体系中转化条件及共培养时间的选择 |
| 4.4 星星草遗传转化体系中乙酰丁香酮浓度的选择 |
| 4.5 星星草遗传转化体系中抑菌剂浓度的选择 |
| 4.6 星星草遗传转化体系中筛选剂及筛选压的选择 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 附件 |
（5）水稻愈伤分化基因GR9的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 一、文献综述 |
| 1.1 影响水稻遗传转化的因素 |
| 1.1.1 不同水稻基因型对遗传转化的影响 |
| 1.1.2 培养基组分对水稻遗传转化的影响 |
| 1.1.3 植物激素对水稻再生的影响 |
| 1.1.4 外植体种类对水稻遗传转化的影响 |
| 1.1.5 外界环境对水稻遗传转化的影响 |
| 1.2 影响水稻转化的遗传基础 |
| 1.2.1 影响水稻愈伤组织诱导的遗传基础 |
| 1.2.2 影响水稻再生的遗传基础 |
| 1.3 影响水稻再生的分子机制 |
| 1.4 高效籼稻转基因技术的研究进展 |
| 二、材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 水稻植株材料 |
| 2.1.2 菌株和载体 |
| 2.2 引物设计 |
| 2.3 仪器与试剂 |
| 2.3.1 主要实验试剂 |
| 2.3.2 主要实验仪器 |
| 2.3.3 常用培养基 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 水稻幼苗DNA的提取 |
| 2.4.2 水稻叶片RNA的提取 |
| 2.4.3 水稻愈伤组织RNA的提取(Trizol法) |
| 2.4.4 水稻RNA的消化反转 |
| 2.4.5 大肠杆菌DH5α/Top10 感受态的制备 |
| 2.4.6 大肠杆菌的转化-热激法 |
| 2.4.7 根癌农杆菌EHA105/GV3101 感受态的制备 |
| 2.4.8 农杆菌的转化-冻融法 |
| 2.4.9 酵母双杂交实验 |
| 2.4.9.1 酵母AH109 感受态的制备 |
| 2.4.9.2 酵母AH109 感受态细胞的转化 |
| 2.4.10 Mating筛库实验 |
| 2.4.10.1 准备材料 |
| 2.4.10.2 酵母Y2H转化 |
| 2.4.10.3 Mating的筛选过程 |
| 2.4.11 侵染烟草的方法 |
| 2.4.12 水稻幼茎原生质体的制备 |
| 2.4.12.1 水稻幼茎材料的准备 |
| 2.4.12.2 原生质体的分离 |
| 2.4.12.3 原生质体的纯化 |
| 2.4.13 水稻原生质体的转化 |
| 2.4.14 双荧光系统实验 |
| 2.4.15 水稻成熟胚转化流程 |
| 2.4.15.1 成熟胚愈伤组织的诱导 |
| 2.4.15.2 胚性愈伤组织的继代培养 |
| 2.4.15.3 农杆菌培养 |
| 2.4.15.4 农杆菌共培养 |
| 2.4.15.5 侵染后愈伤组织的选择 |
| 2.4.15.6 抗性愈伤组织的分化 |
| 2.4.15.7 转基因苗的鉴定及移栽 |
| 2.4.16 载体的构建 |
| 2.4.16.1 PGADT7-ADA2/Bzip72 载体构建(酶切方法构建) |
| 2.4.16.2 PGBKT7-GR9 载体构建 |
| 2.4.16.3 p GREEN-62sk相关载体构建 |
| 2.4.16.4 p GREEN-0800-GRF4 载体构建 |
| 2.4.16.5 PYL-CAS9-GR9/ADA2/BZIP72 基因编辑载体的构建 |
| 三、结果与分析 |
| 3.1 影响水稻愈伤分化作用位点的定位及遗传分析 |
| 3.2 qGR9 候选基因的鉴定 |
| 3.3 GR9 的亚细胞定位 |
| 3.4 GR9 基因的功能互补试验 |
| 3.5 GR9 不同等位基因的转基因试验 |
| 3.6 GR9 与ADA2 互作 |
| 3.7 GR9 结合GRF4 启动子区 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（6）谷子基因编辑体系的建立及香味基因SiBADH2突变体的获得（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 谷子简介 |
| 1.2 农杆菌介导的谷子遗传转化研究进展 |
| 1.2.1 利用谷子不同的外植体进行再生 |
| 1.2.2 多种因素对谷子再生的影响 |
| 1.2.3 谷子农杆菌转化法的研究进展 |
| 1.3 基因编辑技术的发展及应用 |
| 1.3.1 巨核酶 |
| 1.3.2 锌指核酸酶 |
| 1.3.3 转录激活因子样效应物核酸酶 |
| 1.3.4 CRISPR/Cas9系统 |
| 1.4 BADH基因在植物中的重要多功能作用 |
| 1.4.1 BADH作为一种不含抗生素的转化子选择标记 |
| 1.4.2 非生物胁迫中的BADH |
| 1.4.3 植物香气中的BADH2 |
| 1.5 本课题的研究的目的与意义 |
| 第二章 农杆菌介导的谷子遗传转化 |
| 2.1 实验材料、仪器与试剂 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 主要实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 农杆菌介导谷子的遗传转化方法 |
| 2.2.2 谷子灭菌时间的梯度实验 |
| 2.2.3 基础培养基的选择 |
| 2.2.4 CuSO_4与ZnSO_4 的添加 |
| 2.2.5 脯氨酸的添加 |
| 2.2.6 硝酸银的添加 |
| 2.2.7 2,4-D含量的确定 |
| 2.2.8 KT的添加含量 |
| 2.2.9 选择培养基中Hyg的含量的确定 |
| 2.2.10 分化培养基中激素的选择 |
| 2.2.11 农杆菌浓度的确定 |
| 2.2.12 农杆菌液浸泡侵染愈伤时间的确定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 最佳灭菌时间改变发芽率与染菌率 |
| 2.3.2 适当的基础培养基提高愈伤质量 |
| 2.3.3 CuSO_4与ZnSO_4提高愈伤数量与质量 |
| 2.3.4 脯氨酸的负作用 |
| 2.3.5 硝酸银对愈伤无影响 |
| 2.3.6 2,4-D最优浓度提高愈伤诱导率 |
| 2.3.7 KT降低胚性愈伤诱导率 |
| 2.3.8 40 mg/LHyg用于选择培养基 |
| 2.3.9 2,4-D与KT诱导谷子分化 |
| 2.3.10 农杆菌的OD_(600)值 |
| 2.3.11 浸染愈伤最佳时间 |
| 2.3.12 谷子基本培养基的确定 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 植物表达载体的构建与转化 |
| 3.1 实验材料、仪器与试剂 |
| 3.1.1 菌株和质粒载体 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 主要实验试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 SiBADH2敲除载体的构建 |
| 3.2.2 琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.2.3 琼脂糖凝胶DNA回收 |
| 3.2.4 大肠杆菌的转化 |
| 3.2.5 菌落PCR |
| 3.2.6 质粒的提取 |
| 3.2.7 农杆菌感受态的制备 |
| 3.2.8 表达载体转化农杆菌 |
| 3.2.9 农杆菌介导谷子的遗传转化方法 |
| 3.2.10 谷子基因组总DNA的提取(CTAB法) |
| 3.2.11 转基因阳性植株检测 |
| 3.2.12 T_1代植株纯合转基因植株检测 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 Ci846 野生型植株的BADH2 基因检测 |
| 3.3.2 靶点引物的设计 |
| 3.3.3 pJG310 载体与p JG338 载体的构建 |
| 3.3.4 阳性菌落检测 |
| 3.3.5 pRLG103-BADH2 载体的检测 |
| 3.3.6 农杆菌介导Ci846成熟胚的遗传转化 |
| 3.3.7 再生植株的PCR鉴定结果 |
| 3.3.8 T_0代转基因植株的靶位点突变分析 |
| 3.3.9 T_1代转基因植株的鉴定结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）外源基因DNA甲基化对农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化的影响研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 大豆的遗传转化方法 |
| 1.2.1 农杆菌介导法 |
| 1.2.2 基因枪转化法 |
| 1.2.3 聚乙二醇转化法 |
| 1.2.4 花粉管通道法 |
| 1.2 外源基因表达的影响因素 |
| 1.2.1 外源基因插入特性对基因表达的影响 |
| 1.2.2 宿主调控对外源基因表达的影响 |
| 1.2.3 外界环境条件对外源基因表达的影响 |
| 1.3 植物中DNA甲基化 |
| 1.3.1 DNA甲基化的产生机制 |
| 1.3.2 DNA甲基化的功能 |
| 1.3.3 DNA甲基化的研究方法 |
| 1.4 原生质体转化与外源基因表达 |
| 1.4.1 原生质体转化方法在基因功能研究中的优势 |
| 1.4.2 原生质转化方法在基因功能研究中的应用 |
| 1.4.3 原生质转化方法的影响因素 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 第二章 农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.1.3 数据处理与计算 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 农杆菌介导的大豆遗传转化 |
| 2.2.2 不同大豆品种丛生芽诱导效率 |
| 2.2.3 不同大豆品种丛生芽伸长效率 |
| 2.2.4 不同大豆品种生根效率 |
| 2.2.5 不同大豆品种遗传转化效率 |
| 2.3 本章小结 |
| 2.3.1 结论 |
| 2.3.2 讨论 |
| 第三章 大豆原生质体细胞分离和瞬时转化体系 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.1.4 数据处理与计算 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 大豆原生质体制备和活力检测 |
| 3.2.2 组织材料培养时间对原生质体产量及活力的影响 |
| 3.2.3 预处理液中甘露醇含量对原生质体产量和活力的影响 |
| 3.2.4 酶解液成份对原生质体产量和活力的影响 |
| 3.2.5 酶解时间对原生质体产量和活力的影响 |
| 3.2.6 不同组织材料类型对原生质体产量和活力的影响 |
| 3.2.7 大豆原生质体中外源基因的瞬时表达 |
| 3.3 本章小结 |
| 3.3.1 结论 |
| 3.3.2 讨论 |
| 第四章 不同遗传转化效率大豆品种外源基因表达的影响因素研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.1.3 数据处理与计算 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 不同遗传转化效率大豆品种原生质体的制备 |
| 4.2.2 不同遗传转化效率大豆品种原生质体的转化效率 |
| 4.2.3 雌二醇诱导时间对大豆原生质体转化效率的影响 |
| 4.2.4 雌二醇浓度对大豆原生质体转化效率的影响 |
| 4.2.5 培养时间对不同遗传转化效率大豆品种原生质体细胞外源荧光蛋白表达的影响 |
| 4.2.6 不同遗传转化效率大豆品种原生质体细胞内外源基因的表达差异 |
| 4.2.7 蛋白酶抑制剂对外源基因表达的影响 |
| 4.2.8 不同转化效率的大豆品种原生质体中甲基化酶相关编码基因表达水平 |
| 4.2.9 不同转化效率的大豆品种原生质体中甲基化水平差异 |
| 4.2.10 甲基化抑制剂5-Azac对外源基因表达水平的影响 |
| 4.2.11 甲基化抑制剂5-Azac对外源基因甲基化水平的影响 |
| 4.3 本章小结 |
| 4.3.1 结论 |
| 4.3.2 讨论 |
| 第五章 5-AZAC对农杆菌介导的大豆遗传转化的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.1.3 数据处理与计算 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 不同5-Azac处理浓度对大豆遗传转化的影响 |
| 5.2.2 不同5-Azac使用方式对大豆抗性丛生芽诱导效率的影响 |
| 5.2.3 5-Azac对不同大豆品种抗性丛生芽诱导效率的影响 |
| 5.3 本章小结 |
| 5.3.1 结论 |
| 5.3.2 讨论 |
| 第六章 全文总结 |
| 6.1 大豆的遗传转化效率具有显着的基因型差异 |
| 6.2 建立高效的大豆原生质体细胞分离和瞬时转化表达体系 |
| 6.3 DNA甲基化能够造成大豆品种间外源基因表达水平差异 |
| 6.4 甲基化抑制剂5-AZAC能够显着的提高大豆遗传转化过程中抗性丛生芽的诱导效率 |
| 6.5 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（8）基于CRISPR-Cas的高效水稻基因组编辑系统构建及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 基因组编辑研究概述 |
| 1.1.1 基因组编辑研究内涵 |
| 1.1.2 基因组编辑基本序列特异性核酸酶 |
| 1.1.3 CRISPR-Cas系统结构特点及基因组编辑应用 |
| 1.2 基于CRISPR-Cas的植物基因组编辑 |
| 1.2.1 CRISPR-Cas植物基因组编辑工具开发 |
| 1.2.2 主要CRISPR-Cas植物基因组编辑工具 |
| 1.2.3 植物基因组编辑主要策略 |
| 1.2.4 植物基因组编辑主要限制性因素 |
| 1.3 植物基因组编辑中的特异性问题 |
| 1.3.1 基因组编辑中特异性问题的内涵及外延 |
| 1.3.2 影响基因组编辑特异性的主要因素 |
| 1.3.3 特异性检测策略 |
| 1.3.4 提升特异性措施 |
| 1.4 立题依据及研究内容 |
| 1.4.1 立题依据 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株和载体 |
| 2.1.3 主要酶和试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 质粒DNA小量提取 |
| 2.2.2 DNA凝胶回收 |
| 2.2.3 质粒DNA中量提取 |
| 2.2.4 载体构建 |
| 2.2.5 水稻原生质体制备及转化 |
| 2.2.6 质粒DNA转入农杆菌 |
| 2.2.7 水稻稳定遗传转化 |
| 2.2.8 水稻基因组DNA提取 |
| 2.2.9 再生植株转基因阳性检测 |
| 2.2.10 阳性再生植株编辑情况检测 |
| 2.2.11 基于c RT-PCR的 STU-CRISPR转录加工验证 |
| 2.2.12 扩增子高通量测序及分析 |
| 2.2.13 水稻植物材料培养 |
| 2.2.14 全基因组重测序 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 单转录单元CRISPR-Cas9 系统(STU-CRISPR1.0)构建及应用 |
| 3.1.1 STU-CRISPR1.0 设计策略 |
| 3.1.2 STU CRISPR-Cas9 基因组编辑系统构建策略优化及活性评价 |
| 3.1.3 STU CRISPR-Cas9 基因组编辑实现的分子基础 |
| 3.1.4 STU CRISPR-Cas9 系统基因组编辑特异性分析 |
| 3.1.5 基于STU CRISPR-Cas9 系统的双位点编辑 |
| 3.1.6 基于STU CRISPR-Cas9 系统的Cas9 切口酶编辑事件检测 |
| 3.1.7 STU CRISPR-Cas9 系统的诱导型植物基因组编辑 |
| 3.1.8 基于水稻稳定转化的STU CRISPR-Cas9 系统编辑活性评价 |
| 3.1.9 STU CRISPR-Cas9 系统的多物种基因组编辑活性验证 |
| 3.2 STU-CRIPSR2.0 水稻基因组编辑新系统构建及应用 |
| 3.2.1 基于多元RNA剪切元件的STU-CRIPSR2.0 系统设计及验证 |
| 3.2.2 基于STU-CRIPSR2.0 系统的编辑事件特征高通量测序分析 |
| 3.2.3 基于水稻稳定转化的STU CRISPR-Cas92.0 系统编辑活性评价 |
| 3.2.4 基于STU CRISPR-Cas92.0 系统水稻基因组多位点共编辑 |
| 3.2.5 基于STU CRISPR-Cas92.0 系统水稻基因组单碱基编辑 |
| 3.3 CRISPR-Cas12a植物基因组编辑系统构建及应用 |
| 3.3.1 基于CRISPR-Cas12a的植物基因组编辑可行性确认 |
| 3.3.2 水稻CRISPR-Cas12a编辑事件特征高通量测序分析 |
| 3.3.3 LbCas12a水稻基因组编辑工具特异性分析 |
| 3.3.4 基于稳定转化的LbCas12a水稻基因组编辑植株获得 |
| 3.3.5 LbCas12a介导的水稻非嵌合体编辑事件证明 |
| 3.3.6 温度对Cas12a介导的植物基因组编辑实现的影响 |
| 3.3.7 STU CRISPR-Cas12a植物基因组编辑系统构建及活性验证 |
| 3.4 基于全基因组重测序大数据分析的CRISPR-Cas特异性评价 |
| 3.4.1 WGS水稻样本确定及数据分析流程设计 |
| 3.4.2 不同类型组织培养再生水稻对照材料基因组变异分析 |
| 3.4.3 T0代CRISPR-Cas编辑材料基因组变异分析 |
| 3.4.4 T1代CRISPR-Cas编辑材料基因组变异分析 |
| 3.5 水稻引导编辑(Prime Editing)系统构建及活性鉴定 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 单转录单元CRISPR系统在植物基因组编辑中的有效实现 |
| 4.1.1 STU-CRISPR系统(1.0)分子基础及基因组编辑潜力 |
| 4.1.2 STU-CRISPR系统(2.0)升级及基因组编辑功能强化 |
| 4.1.3 STU-CRISPR基因组编辑系统多元化拓展 |
| 4.2 CRISPR-Cas12a高效植物基因组编辑系统构建及应用 |
| 4.3 CRISPR-Cas植物基因组编辑系统特异性评价 |
| 4.3.1 植物基因组编辑研究及应用中的特异性问题 |
| 4.3.2 植物基因组编辑特异性评价策略 |
| 4.3.3 CRISPR-Cas基因组编辑工具特异性确认 |
| 4.4 PE基因组编辑策略在植物中的探索性实践 |
| 4.4.1 基于PE策略的植物基因组编辑可行性确认 |
| 4.4.2 植物PE基因组编辑系统活性有效提升的建议 |
| 第五章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的成果 |
| 附录 |
（9）农杆菌介导的玉米高效遗传转化体系的建立及CgbHLH001转基因玉米株系的鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要缩略词对照表 |
| 第1章 引言 |
| 1 玉米转基因方法研究进展 |
| 1.1 农杆菌介导的转化法 |
| 1.2 基因枪法 |
| 1.3 聚乙二醇(PEG)介导法 |
| 1.4 电击法 |
| 1.5 花粉管通道法 |
| 1.6 子房注射法 |
| 2 玉米遗传转化的受体系统 |
| 2.1 幼胚 |
| 2.2 茎节 |
| 2.3 茎尖 |
| 2.4 萌动胚 |
| 2.5 其他受体 |
| 3 bHLH转录因子耐旱功能的研究进展 |
| 4 本研究的目的、意义及拟解决的关键科学问题 |
| 第2章 农杆菌介导的玉米幼胚遗传转化体系的建立及优化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 幼胚再生体系的建立 |
| 1.2.2 草铵膦(PPT)筛选浓度的确定 |
| 1.2.3 农杆菌感受态细胞的制备 |
| 1.2.4 质粒转化农杆菌 |
| 1.2.5 质粒转化大肠杆菌 |
| 1.2.6 质粒提取 |
| 1.2.7 质粒酶切鉴定 |
| 1.2.8 农杆菌浸染液的制备 |
| 1.2.9 浸染转化 |
| 1.2.10 抗性愈伤组织的筛选 |
| 1.2.11 抗性愈伤组织的分化和生根 |
| 1.2.12 植物基因组DNA的提取 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同玉米自交系形成愈伤组织能力的分析 |
| 2.2 2,4-D 浓度对玉米幼胚愈伤诱导率的影响 |
| 2.3 不同激素类型及浓度对玉米幼胚愈伤分化率的影响 |
| 2.3.1 继代时间对分化率的影响 |
| 2.3.2 不同激素对分化率的影响 |
| 2.3.3 培养基附加成分对分化率的影响 |
| 2.4 不同激素及浓度对玉米幼胚再生幼苗生根的影响 |
| 2.5 草铵膦(PPT)筛选转化玉米愈伤组织的临界浓度确定 |
| 2.6 农杆菌浸染前重组质粒的转化及酶切鉴定 |
| 2.7 转化苗的PCR鉴定 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第3章 农杆菌介导的玉米萌动胚、茎节遗传转化体系的建立及优化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 种子消毒及预处理 |
| 1.2.2 农杆菌浸染液的制备 |
| 1.2.3 草铵膦(PPT)筛选幼苗临界浓度确定 |
| 1.2.4 玉米种子萌动胚的转化及培养 |
| 1.2.5 转基因植株检测 |
| 1.2.6 统计分析方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同浓度草铵膦(PPT)对玉米幼苗生长的影响 |
| 2.2 不同菌液浸染浓度和浸染时间对玉米种子萌动胚出苗率的影响 |
| 2.3 转CgbHLH001 基因玉米植株的鉴定 |
| 2.4 不同激素及浓度对茎节愈伤组织诱导和分化的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论与展望 |
| 1 结论 |
| 2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）小麦组织特异性启动子的筛选、功能分析及应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 启动子概述 |
| 1.2 植物启动子的研究现状 |
| 1.3 小麦遗传转化 |
| 1.4 杂种优势与雄性不育 |
| 1.5 本课题研究目的和研究内容 |
| 2 小麦组织特异性基因的全基因组分析与鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 小麦组织特异性启动子的分离及在植物体中的遗传转化研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 利用组织特异性启动子构建的应用表达载体转化小麦的研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 OsPSG076启动子在水稻中的转化研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果与分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 6 水稻OsPSG076基因分析及其表达载体的遗传转化 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.3 实验结果与分析 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 本章小结 |
| 7 全文总结与展望 |
| 7.1 主要研究结果 |
| 7.2 本文的特色与创新点 |
| 7.3 课题展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1 攻读学位期间发表的论文 |
| 附录2 主要符号与缩略词(按字母顺序) |
四、影响农杆菌介导的水稻遗传转化效率的因素（论文参考文献）
- [1]水稻遗传转化研究进展[J]. 彭小群,王梦龙. 中国农学通报, 2021
- [2]三元载体系统的构建及其应用于水稻农杆菌介导的遗传转化研究[D]. 王慧杰. 中国农业科学院, 2021(09)
- [3]杜仲ARF基因家族分析与EuARF19.2功能验证[D]. 刘闵豪. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [4]星星草（Puccinellia tenuiflora）遗传转化体系的建立[D]. 张月. 东北林业大学, 2021(08)
- [5]水稻愈伤分化基因GR9的功能研究[D]. 王诗雨. 浙江师范大学, 2021(02)
- [6]谷子基因编辑体系的建立及香味基因SiBADH2突变体的获得[D]. 陈冰. 中国农业科学院, 2020
- [7]外源基因DNA甲基化对农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化的影响研究[D]. 赵强. 沈阳农业大学, 2020(08)
- [8]基于CRISPR-Cas的高效水稻基因组编辑系统构建及应用[D]. 唐旭. 电子科技大学, 2020
- [9]农杆菌介导的玉米高效遗传转化体系的建立及CgbHLH001转基因玉米株系的鉴定[D]. 艾丽曼·阿布来孜. 新疆大学, 2020(07)
- [10]小麦组织特异性启动子的筛选、功能分析及应用研究[D]. 苏佩佩. 华中科技大学, 2019