一、Anti-tumor effect of bufalin on the orthotopic transplantation tumor model of human hepatocellular carcinoma in nude mice（论文文献综述）
李华[1]（2021）在《川芎嗪对结肠癌细胞的抑瘤效应及改变线粒体活性氧代谢介导凋亡通路的机制研究》文中研究指明背景结肠癌是消化道中常见的恶性肿瘤之一,在我国,其发病率及死亡率呈逐年上升趋势,多数患者就诊时已属于中晚期。针对晚期及复发患者,化疗是主要的治疗手段,但化疗药物存在较强的毒副反应以及药物耐药的出现严重影响结肠癌患者的治疗效果及预后。因此,亟待寻找新型的抗肿瘤药物为结肠癌患者提供新的治疗手段。传统中药是抗癌药物的宝库,川芎嗪是从川芎中提取的一种生物碱单体,川芎嗪作为川芎的主要活性成分,多项研究证实川芎嗪可对肝癌、胃癌、前列腺癌、宫颈癌和乳腺癌等多种肿瘤具有良好的抗肿瘤作用。然而,关于川芎嗪是否能抑制结肠癌细胞生长及其作用机制的研究较少。目的探讨川芎嗪对结肠癌的抗肿瘤作用,并探讨其抗结肠癌的作用机制。川芎嗪对不同结肠癌细胞的杀伤作用分析;明确川芎嗪抗结肠癌细胞增殖以及促进结肠癌细胞凋亡的作用;进一步探讨川穹嗪改变线粒体活性氧代谢介导结肠癌细胞凋亡通路的调控机制;在结肠癌荷瘤小鼠中验证川芎嗪的抗肿瘤效果。方法采用结晶紫染色法观察川芎嗪对结肠癌细胞的杀伤作用;采用Cell Counting Kit-8（CCK-8）法检测细胞增殖率,观察川芎嗪作用的浓度依赖性和时间依赖性并计算IC50;通过流式细胞术检测细胞凋亡率及对细胞周期的影响;运用Annexin-V/PI双染的方法检测细胞凋亡的类型和比例;细胞内活性氧含量用DCFH-DA探针来检测;用活性氧抑制剂（NAC）和Caspase泛抑制剂（Z-VAD-FMK）联合川芎嗪作用于结肠癌细胞,观察清除活性氧及阻断凋亡相关靶蛋白后对结肠癌细胞凋亡的影响;建立结肠癌荷瘤动物模型,通过检测肿瘤组织中丙二醛和分析移植肿瘤内活性氧含量,采用Caspase 3和Caspase 9活性检测试剂盒检测移植肿瘤内Caspase 3和Caspase 9蛋白含量。结果1.川芎嗪对6种结肠癌细胞均有杀伤效果,并且随着川芎嗪药物浓度升高,结肠癌细胞存活量逐渐减少,杀伤效果在HCT116和SW480两株细胞中最为敏感。HCT116和SW480两种细胞系的IC50最低;2.随着川芎嗪浓度的增加和作用时间的延长,显微镜下细胞数减少。与对照组相比,3.川芎嗪浓度达到600μg/ml时,HCT116和SW480细胞数目显着减少,细胞收缩和圆,分裂和漂浮。随着川芎嗪浓度的增加和作用时间的延长,HCT116和SW480细胞的增殖活性逐渐降低;4.随着川芎嗪浓度的增加,G1期的细胞比例逐渐增多,S期的细胞比例逐渐减少。与对照组相比,在600μg/ml以上浓度的川芎嗪作用下,细胞周期中S期的比例与对照组相比差异有统计学意义;5.随着川芎嗪浓度的增加,细胞凋亡率逐渐增加,呈浓度依赖性。600μg/ml处理组细胞凋亡率具有统计学意义。SW480细胞中以早期凋亡增加（annexin+/pi-,右下象限）增加为着,HCT116细胞呈现晚期凋亡（annexin+/pi+,右上象限）增加为着;6.与DMSO对照组相比,川芎嗪组的HCT116和SW480细胞数目显着减少,细胞收缩变圆、破碎并漂浮。川芎嗪+NAC和川芎嗪+Z-VAD-FMK组与川芎嗪组相比,细胞数目明显增多。川芎嗪组相比DMSO对照组细胞凋亡率明显升高,川芎嗪+NAC和川芎嗪+Z-VAD-FMK组与川芎嗪组相比,两组凋亡率显着降低。NAC组细胞存活率高于Z-VAD-FMK 组;7.川芎嗪组活性氧含量明显增加,与DMSO组相比有显着性差异。川芎嗪+NAC组与川芎嗪处理组相比,活性氧含量显着下降。川芎嗪+Z-VAD-FMK组活性氧含量与川芎嗪处理组在SW480结肠癌细胞中无明显变化。在HCT116结肠癌细胞中川芎嗪+Z-VAD-FMK组与川芎嗪处理组相比活性氧含量有所下降;8.川芎嗪组与对照组相比,Caspase 3,9和PARP均发生明显的剪切活化,蛋白表达明显增高。川芎嗪+Z-VAD-FMK组和川芎嗪+NAC组,与川芎嗪组相比,Caspase 3,9和PARP这种活化可以被Z-VAD-FMK和NAC显着抑制;川芎嗪+NAC组Caspase 3,9和PARP表达与川芎嗪+Z-VAD-FMK组相比,表达抑制更为显着,蛋白表达降低;9.动物实验中,高浓度川芎嗪组移植瘤生长明显抑制,且呈浓度依赖性,移植瘤的重量分布为:1.62±0.48 g（浓度 0 mg/kg）、0.92±0.21 g（浓度 50 mg/kg）和 0.58±0.19 g（浓度100 mg/kg）,差异有显着性和浓度依赖性;10.川芎嗪高浓度组（100 mg/kg）的动物模型移植肿瘤中的丙二醛和Caspase3,9蛋白含量显着高于低浓度组（50 mg/kg）和对照组（0 mg/kg）,具有显着统计学差异,且有浓度依赖性。结论1.川芎嗪对结肠癌细胞有明显的抑制增殖、促进凋亡作用,并呈现时间与浓度依赖性;2.结肠癌细胞在川芎嗪作用下能够将凋亡细胞增殖阻止在G1期,进而抑制细胞周期S期的合成,从而抑制细胞增殖;3.川芎嗪诱导结肠癌细胞凋亡与产生大量活性氧从而激活Caspase依赖性细胞凋亡通路密切相关,活性氧抑制剂可以更有效抑制川芎嗪诱导的细胞凋亡;4.川芎嗪诱导结肠癌细胞内活性氧含量增高在Caspase依赖性凋亡通路的上游发挥诱导细胞凋亡的调控作用;5.川芎嗪在结肠癌裸鼠移植瘤中能显着抑制肿瘤增殖,增加裸鼠体内的活性氧和Caspase3,9的含量并诱导肿瘤细胞凋亡。
王一同[2]（2021）在《华蟾素注射液治疗结肠癌腹水的优效人群分析及对VM的作用机制研究》文中提出研究背景恶性腹水是晚期结肠癌患者的常见并发症,是临床治疗的难点。西医目前主要采用腹腔穿刺置管引流、全身化疗或联合腹腔灌注化疗等方法,但恶性腹水患者多为肿瘤晚期,经过多程放、化疗治疗,体质较差,再次化疗的敏感性及耐受性降低,且恶性腹水多为血性,无法大量置管引流,使腹胀、喘憋等症状持续存在,严重影响生活质量。因此需探索更为温和、有效的治疗方法。中药腹腔灌注,可避免口服汤药引起的胃肠不适,副反应小,近年来广泛应用于恶性腹水的临床治疗。本团队致力于华蟾素注射液腔内灌注治疗研究多年,发现华蟾素注射液对恶性浆膜腔积液有一定的疗效,庄等研究发现,华蟾素注射液腔内灌注治疗恶性浆膜腔积液,有效率为66.42%;杨等研究发现,华蟾素注射液腔内灌注对于恶性胸水有效率为60.00%;袁等研究发现,华蟾素注射液对于消化系统肿瘤来源恶性腹水有效率为75.4%,疗效更好,但前期研究对于不同癌种患者分层后病例数较少,未进行具体分层讨论。恶性腹水的生成与血管新生密切相关。本团队前期基础研究发现华蟾素注射液能够降低恶性腹水中的红细胞数量,使腹水颜色变浅,推测华蟾素注射液可能通过抑制肿瘤血管新生干预恶性腹水的生成。血管生成拟态（Vasculogenic Mimicry,VM）是近年来提出的全新肿瘤血管新生模式,可能与传统内皮细胞参与的肿瘤血管新生共同促进恶性腹水的生成。既往多数研究关注在华蟾素对内皮细胞参与的肿瘤血管新生的影响,鲜有研究探究华蟾素对VM形成的影响。研究目的临床部分:明确华蟾素注射液腹腔灌注治疗对于结肠癌这一单一病种来源的恶性腹水的疗效及该治疗方法对应的优效人群特征,以期为华蟾素注射液腹腔灌注治疗结肠癌恶性腹水提供更为个体化的临床指导。实验部分:由临床现象探索内在机制。以VM为新切入点,通过体内、体外实验观察华蟾素注射液对结肠癌HCT116细胞VM形成的影响及作用机制,从而更为全面地从肿瘤血管新生角度阐述华蟾素注射液腹腔灌注抑制结肠癌恶性腹水的作用机制。研究方法临床部分:采用单臂回顾性研究方法,收集2010年1月1日～2020年12月31日于北京中医药大学东方医院肿瘤科行华蟾素注射液腹腔灌注治疗的结肠癌恶性腹水的患者临床资料,从腹水量控制率、腹水质改善率、KPS评分改善情况及患者生存期方面进行疗效评价,同时评价安全性。进一步对比不同因素（如肿瘤原发病特点、转移情况、整体及局部中医辨证分型、合并全身治疗等）对疗效的影响,从中筛选优效病例,总结优效人群特征。实验部分:（1）采用结肠癌HCT116细胞腹腔+脾脏原位接种法建立BALB/C裸鼠结肠癌血性腹水模型;观察造模前后及华蟾素注射液干预前后裸鼠一般体征、体重、腹围、腹水量、腹水红细胞数量及腹腔转移瘤瘤重等。（2）采用CoCl2化学诱导建立结肠癌HCT116细胞体外缺氧模型;采用CCK-8实验、细胞划痕实验、Transwell实验检测缺氧微环境及华蟾素注射液对结肠癌HCT116细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。（3）采用Matrigel基质胶细胞三维培养建立结肠癌HCT116细胞体外VM模型;通过PAS-CD31组织化学与免疫组化双染法显示结肠癌HCT116细胞体内VM的形成;显微镜下计数VM形成数目,观察缺氧微环境及华蟾素注射液对结肠癌HCT116细胞体内、体外VM形成的影响。（4）采用RT-qPCR、Western-blot实验检测缺氧微环境及华蟾素注射液对结肠癌 HCT116 细胞 VM 形成相关靶点 HIF-1α、VEGF、MMP2、MMP9、VE-cadherin mRNA及蛋白表达的影响。研究结果临床部分:（1）腹水量疗效评价:研究共纳入135例患者。灌注后腹围较灌注前显着减小（P<0.01）;完全缓解2例,部分缓解25例,稳定56例,合计有效83例,无效52例,总有效率61.5%。（2）腹水质疗效评价:灌注后腹水红细胞数、腹水肿瘤标记物、腹水乳酸脱氢酶水平较灌注前显着下降（P<0.01）;腹水红细胞较治疗前下降≥25%者94例,总有效率74.0%;腹水肿瘤标记物较灌注前下降≥25%者70例,总有效率55.1%,其中CEA、CA199、CA724水平下降显着,铁蛋白水平较灌注前差异无统计学意义（P>0.05）;腹水乳酸脱氢酶较治疗前下降≥25%者50例,总有效率39.4%。（3）KPS评分疗效评价:灌注后KPS评分较灌注前显着提高（P<0.01）;较治疗前提高者41例,较治疗前稳定者82例,较治疗前减少者12例。（4）生存情况疗效评价:纳入患者截至末次随访,仍存活者2例,腹水生存期为1～31个月,平均腹水生存期5.66±4.59个月,中位腹水生存期4.00个月;腹水1年生存率为9.6%,2年生存率为3.7%,未见大于3年生存者。（5）安全性评价:出现不良反应者27例,占比20.0%,主要不良反应为腹痛（10例）、发热（11例）、恶心呕吐（3例）、腹泻（3例）,多可耐受或对症治疗后可较快缓解,为1级轻度不良反应。未见由药物引起的骨髓抑制、肝、肾功能异常及心电图改变,未见腹腔感染、肠梗阻、消化道出血等严重并发症,安全性良好。（6）短期疗效优效人群特征分析:对于男性、有饮酒史、左半结肠、灌注前血液NLR≤2.81、初诊即诊断恶性腹水、血性腹水、全身辨证含瘀毒证,全身辨证非肝肾阴虚证、局部辨证为湿热毒证及合并全身中医治疗患者的腹水量控制方面疗效更好,其中结肠癌位置、腹水性质、合并全身中医治疗是影响腹水量控制率的独立预后因素;对于有饮酒史、无肝转移、有腹腔淋巴结转移、无胆红素升高、血性腹水、局部辨证为湿热毒证及合并全身中医治疗患者的腹水颜色改善方面疗效更好,其中肝转移、胆红素升高、腹水性质、局部辨证为影响腹水颜色改善率的独立预后因素。（7）长期疗效优效人群特征分析:有家族史、左半结肠、无肝转移、无脑转移、转移部位≤2个、灌注前无血中乳酸脱氢酶升高、初诊即诊断恶性腹水、全身辨证非肝肾阴虚证、无不良反应及腹水量得到控制的患者腹水生存期更长,但与外部研究结果对比生存期未见明显延长。实验部分:（1）结肠癌HCT116细胞腹腔+脾脏原位接种可建立较为稳定的BALB/C裸鼠结肠癌血性腹水模型;Matrigel基质胶细胞三维培养可建立结肠癌HCT116细胞体外VM模型。（2）华蟾素注射液腹腔注射可抑制结肠癌血性腹水的生成、降低腹水中红细胞数目,抑制结肠癌腹腔转移瘤的生成。（3）缺氧微环境可促进结肠癌HCT116细胞迁移、侵袭,增强体外VM的形成能力。（4）华蟾素注射液可逆转缺氧对HCT116细胞造成的不良影响,抑制其增殖、迁移、侵袭及体内、体外VM的形成。（5）缺氧微环境可上调HCT116细胞HIF-1α、VEGF、MMP2、MMP9、VE-cadherin mRNA及蛋白的表达,华蟾素注射液干预后可抑制HIF-1α、VEGF、MMP2、VE-cadherinmRNA及蛋白表达,对MMP9 mRNA及蛋白未见显着影响。研究结论临床部分:（1）华蟾素注射液腹腔灌注可有效抑制结肠癌恶性腹水的产生,延缓病情进展,降低腹水中的红细胞数量,提高KPS评分,改善患者生活质量,安全性良好;（2）左半结肠癌、无肝转移、无胆红素升高、血性腹水、局部辨证为湿热毒证及合并全身中医治疗的患者是华蟾素注射液腹腔灌注治疗的优效人群,通过人群特征初步筛选后用药可提高临床疗效。实验研究:华蟾素注射液腹腔灌注抑制结肠癌血性腹水的机制,可能与其逆转肿瘤缺氧微环境,下调HIF-1α、VEGF、MMP2、VE-cadherin mRNA及蛋白的表达从而抑制结肠癌细胞体内、体外VM的形成,同时抑制结肠癌细胞增殖、迁移及腹腔侵袭有关。
王雪[3]（2021）在《白花蛇舌草总黄酮对MFC胃癌小鼠抑瘤及免疫调节作用研究》文中提出目的:通过研究白花蛇舌草总黄酮对MFC胃癌荷瘤小鼠肿瘤生长抑制作用及免疫相关指标的影响,探讨白花蛇舌草总黄酮抑制胃癌的潜在机制,为临床使用中药白花蛇舌草总黄酮防治肿瘤提供理论参考。方法:52只雄性C57BL/6小鼠,SPF级,右腋下消毒后接种MFC细胞悬液,建立MFC胃癌荷瘤小鼠模型。接种第6天,待肿节生长至5mm×5mm左右,随机挑选小鼠2只,剥离后,通过病理学诊断均确定为肿瘤组织时,表明该胃癌模型成功。将50只荷瘤小鼠随机分为模型组、阳性组、白花蛇舌草总黄酮高、中、低剂量组,每组10只,另设10只为空白组。从接种第7天开始给予药物进行干预,空白组和模型组分别给予等体积生理盐水,阳性组给予环磷酰胺25mg·kg-1腹腔注射,白花蛇舌草总黄酮高、中、低剂量组分别按200、100、50 mg·kg-1给予白花蛇舌草总黄酮灌胃,连续灌胃8天,每天1次。给药期间,对各组小鼠一般状态进行评分;游标卡尺分别测量接种后第7、8、9、11、13、15天各组小鼠肿瘤的长径和短径,并绘制肿瘤生长的曲线;最后一次给药结束后,完整剥离肿瘤和脏器,计算抑瘤率及脾脏、胸腺指数;采用HE染色观察肿瘤组织的病理学改变;采用ELISA法检测各组小鼠血清CEA、CA72-4、IL-2、IL-6水平;采用免疫组化法检测各组小鼠肿瘤组织中TLR4、MyD88、NF-κB的表达,进行半定量分析。结果:1.从造模方法来看,该方法具有安全可靠、操作简便、便于观察、造模时间短等优点,成瘤率100%,符合作为实验模型的特征,可满足本实验的要求。2.从小鼠一般状态评分来看,与模型组比较,阳性组小鼠给药后体质量显着下降,白花蛇舌草总黄酮高剂量组体质量显着升高（P<0.01）,白花蛇舌蛇草总黄酮中、低剂量组小鼠体质量差异无统计学意义（P>0.05）;与空白组比较,模型组小鼠综合评分显着降低（P<0.01）;与模型组比较,各给药组均升高（P<0.01或P<0.05）。给药后除阳性组小鼠有脱毛现象,各组小鼠精神状态、活动度及食欲均有所改善。3.从肿瘤生长曲线来看,与模型组比较,阳性组和白花蛇舌草总黄酮高剂量组小鼠肿瘤体积明显减小（P<0.05）,白花蛇舌草总黄酮中、低剂量组小鼠肿瘤生长呈下降趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）。4.从小鼠瘤体观察、瘤重及抑瘤率来看,小鼠瘤体呈球形或不规则形状,为实质性包块,模型组肿瘤体积偏大,部分黏连周围皮肤组织,质地硬,血管明显;给药组小鼠肿瘤体积逐渐减小,边界清楚,容易剥离,呈鱼肉样;与模型组比较,各给药组瘤重均显着降低（P<0.01）,阳性组小鼠抑瘤率为73.40%,中药高剂量组为66.60%,中剂量组为60.09%,低剂量组为47.36%。5.从病理变化看,模型组小鼠肿瘤细胞排列紧密,形态结构稳定,核固缩少,无明显坏死或破碎,而阳性组中的肿瘤细胞排列松散,有不同程度的片状坏死,并且有很多核固缩和核碎裂,可见空泡。白花蛇舌草总黄酮各剂量组瘤细胞出现核固缩,细胞出现坏死,核碎裂,且具有剂量依赖性。6.从血清生化指标来看,模型组小鼠血清肿瘤标志物CEA、CA72-4及细胞因子IL-6含量显着升高（P<0.01）、IL-2含量显着降低;与模型组比较,阳性组、白花蛇舌草总黄酮高、中剂量组能使小鼠血清CEA、CA72-4含量显着降低（P<0.01）,白花蛇舌草总黄酮低剂量组呈下降趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）;与模型组比较,白花蛇舌草总黄酮高、中剂量组能使细胞因子IL-6降低,IL-2含量升高,阳性组中IL-2和IL-6均降低,差异具有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。7.从肿瘤组织指标来看,与模型组比较,阳性组、白花蛇舌草总黄酮高、中剂量组TLR4、MyD88的表达显着降低（P<0.01）,白花蛇舌草总黄酮低剂量组差异无统计学意义;阳性组、白花蛇舌草总黄酮高剂量组NF-κB的表达显着降低（P<0.01）。结论:1.白花蛇舌草总黄酮能够抑制肿瘤的生长,降低肿瘤标志物水平,具有良好的抗肿瘤作用。2.白花蛇舌草总黄酮能够调节免疫相关细胞因子,维持Th1/Th2平衡,改善机体免疫功能;同时可下调肿瘤组织中TLR4、MyD88、NF-κB的表达,提示可能逆转肿瘤免疫逃逸。
杨业国[4]（2020）在《源于白钻的Gomisin M2抗乳腺癌干细胞机制及体内抗增殖作用的研究》文中研究说明肿瘤干细胞（CSCs）在肿瘤的发生、复发和转移中起着重要作用。到目前为止,还没有发现针对CSCs的特异性药物,因为CSCs对大多数传统疗法都有耐药性,并且无限期增殖。三阴性乳腺癌是一种难以治疗而且特殊的乳腺癌亚型,缺乏针对三阴性乳腺癌的有效靶向疗法与富集肿瘤干细胞群和耐药密切相关。本课题研究,我们通过磁激活细胞分选法从MDA-MB-231和HCC1806细胞中富集了CD44+/CD24-乳腺癌干细胞,并将其在无血清培养基中培养。本研究的目的是评价从白钻（S.viridis A.C.Smith）中分离得到的Gomisin M2对MDA-MB-231和HCC1806乳腺癌细胞的抑制作用,并通过体内外细胞凋亡的方法靶向MDA-MB-231和HCC1806乳腺癌干细胞。首先,我们研究了白钻衍生出来的天然化合物的抗增殖活性。我们用11种化合物对两株人三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和HCC1806给药两天,并用Alamar blue测定法测量了细胞活力。Gomisin M2被认为是从白钻提取的11种化合物中最有效的细胞毒性化合物。我们发现Gomisin M2以剂量依赖的方式抑制三阴性乳腺癌细胞活力,并以时间依赖的方式减小3D球体形成的大小。Gomisin M2对两种三阴性乳腺癌细胞系(MDA-MB-231,IC50=60μM;HCC1806,IC50=57μM)最具细胞毒性。我们根据BCSCs标志物通过磁激活细胞分选（MACS）对癌症干细胞进行了分选。我们使用MACS从正常癌细胞中分离出CD44+/CD24-细胞,并检测CD44的表达,以通过流式细胞术确定CD44的纯度。用MACS分离的癌症干细胞（CD44+/CD24-）比例的细胞计数分析结果>99%。我们发现,BCSCs具有形成肿瘤球的能力,并且使用高内涵系统免疫荧光技术发现CD44在肿瘤球中的表达显着增加。一小部分CD44+/CD24-细胞形成了肿瘤球。我们移植了从肿瘤球和非癌干细胞收集的200–300个癌症干细胞,并将它们注入受精后2 d的斑马鱼胚胎,以评估它们的增殖和迁移行为。在细胞移植后第6 d,观察到了来自2-dpf斑马鱼胚胎中乳腺球的MDA-MB-231-GFP细胞迁移至躯干。此外,与非CSC组相比,斑马鱼异种移植物中荧光颗粒的数量增加。然而,在细胞移植后的第3 d,用Di I标记并来源于肿瘤球的HCC1806细胞迁移到了2-dpf斑马鱼胚胎的躯干中。与非肿瘤干细胞相比,肿瘤干细胞在体内具有更高的致瘤性。为了探讨Gomisin M2是否能在体外抑制肿瘤球的形成,我们用Gomisin M2处理了MDA-MB-231 CSC和HCC1806 CSC群体48 h,并在没有Gomisin M2的情况下进行了另外两次肿瘤球培养。结果表明,Gomisin M2治疗后肿瘤球的大小和数量显着减少。使用高内涵筛选观察到核浓缩,细胞通透性,线粒体膜电位和细胞色素c释放。根据总强度除以体积,定量结果表明,阿霉素和Gomisin M2处理48 h后,细胞通透性和细胞色素c的荧光强度增加,而线粒体膜电位显着降低。阿霉素和Gomisin M2处理48 h后,总核强度的蓝色荧光减弱。此外,Western blot结果表明在MDA-MB-231和HCC1806中,应用不同浓度的Gomisin M2作用48 h后,细胞色素c的表达显着增加。为了确定最有效的Gomisin M2化合物对癌细胞的细胞毒性是否是由凋亡引起的,我们使用IC50值小于60μmol/L的Gomisin M2化合物在MDA-MB-231和HCC1806细胞中进行了凋亡分析。我们通过流式细胞仪分析了Gomisin M2治疗的乳腺癌细胞的凋亡。细胞分别用20μM,40μM和60μM Gomisin M2处理48 h。结果表明,Gomisin M2以剂量依赖性方式显着增加了MDA-MB-231和HCC1806细胞系中凋亡细胞的数量。然后流式细胞术分析了MDA-MB-231和HCC1806细胞凋亡的百分比。此外,Gomisin M2以剂量依赖性方式诱导了两种细胞系中Cleaved caspase-3和Cleaved PARP的表达。为了研究Gomisin M2是否通过阻断DNA合成来诱导细胞增殖抑制,我们评估了Gomisin M2对MDA-MB-231和HCC1806中DNA复制的影响。Brd U分析的结果表明Gomisin M2对细胞增殖和DNA合成具有抑制作用。为了进一步评估Gomisin M2在体内的抗乳腺癌肿瘤干细胞效果,使用了斑马鱼模型进行评估。从MDA-MB-231-GFP和HCC1806（用Di I标记）富含的肿瘤干细胞重悬于PBS中将200-300个干细胞显微注射到2-dpf斑马鱼胚胎中。然后,斑马鱼胚胎用10μM Gomisin M2处理。植入后0 h,24 h和48 h通过荧光显微镜捕获荧光密度。结果表明,Gomisin M2处理显着降低了富含CSC的MDA-MB-231或HCC1806细胞的生长和增殖。定量结果表明,与对照组相比,Gomisin M2组在48 h内荧光强度逐渐降低。另外,与DMSO组相比,在48 h内没有增殖的胚的百分比显着增加。为了研究Gomisin M2对乳腺肿瘤干细胞的作用所涉及的机制,我们通过蛋白质印迹分析评估了涉及肿瘤进展的关键信号转导通路的参与。许多研究表明,Wnt/β-catenin通路在调节干细胞自我更新中起关键作用。我们的结果清楚地表明,在MDA-MB-231和HCC1806细胞中,Gomisin M2以剂量和时间依赖性方式显着下调Cyclin D1,β-catenin或p-GSK3β,并上调p-β-catenin或GSK3-β。综上所述,Gomisin M2是源自白钻的天然化合物,已被证明具有抗癌活性。这项研究表明Gomisin M2在体外和体内均能抑制乳腺癌干细胞,这为Gomisin M2或白钻提取物对乳腺癌化学预防的未来临床评估提供了强有力的依据。乳腺癌是由少数乳腺癌干细胞引发并维持的。当前可用的化学疗法和放射疗法不能抑制癌症干细胞群体。乳球形成试验表明,Gomisin M2在体外能抑制乳腺癌干细胞。斑马鱼异种移植模型显示Gomisin M2在体内消除了乳腺癌干细胞。此外,我们的结果表明,通过Gomisin M2对Wnt/β-catenin信号通路的下调是其功效的可能机制之一。这些数据表明Gomisin M2可能在乳腺癌治疗中具有潜能。
韩梦飞[5]（2020）在《自噬在蟾毒灵诱导人肝癌细胞凋亡及有氧糖酵解中的作用及机制研究》文中研究指明背景:自噬是普遍存在于真核细胞中高度进化保守的生命过程,与肿瘤的发生、发展密切相关,将自噬作为抗肿瘤药物作用靶点是目前肿瘤治疗前沿研究领域之一。蟾毒灵（Bufalin）是中药蟾酥的主要活性成分之一,能通过多通路、多靶点抑制肝癌细胞增殖、诱导凋亡。前期预实验通过电镜、蛋白印迹检测观察到蟾毒灵能抑制人肝癌SMMC-7721细胞自噬体形成,降低自噬标记蛋白Beclin 1、LC3-Ⅱ表达水平,证实了蟾毒灵可抑制人肝癌细胞自噬发生。同时,蟾毒灵能抑制人肝癌细胞有氧糖酵解。那么,自噬在蟾毒灵诱导人肝癌细胞凋亡及有氧糖酵解中起到怎样的作用?本课题选取人肝癌细胞株SMMC-7721、Bel-7402,以Beclin 1复合物系统相关信号通路研究蟾毒灵抑制人肝癌细胞自噬的作用靶点,阐明自噬在蟾毒灵诱导人肝癌细胞死亡中的作用。目的:本课题以人肝癌细胞株SMMC-7721、Bel-7402为研究对象,并建立了人肝癌细胞荷瘤鼠模型,在体、内外研究蟾毒灵对人肝癌细胞自噬的抑制作用,并分别通过激活和抑制自噬观察蟾毒灵对人肝癌细胞增殖、凋亡、有氧糖酵解的作用,明确自噬在蟾毒灵诱导人肝癌细胞死亡中的作用和地位。通过人基因表达谱芯片,探讨蟾毒灵诱导人肝癌细胞死亡可能的相关作用机制,为以后蟾毒灵的抗肿瘤研究提供实验基础和思路。方法:第一部分蟾毒灵对人肝癌细胞增殖、凋亡、自噬、有氧糖酵解的影响采用MTT法检测不同浓度蟾毒灵作用四种人肝癌细胞株SMMC-7721、Hep G2、Hep3B、Bel-7402的细胞增殖抑制率;通过Annexin V-FIFC/PI双染法检测不同浓度蟾毒灵作用人肝癌SMMC-7721、Bel-7402细胞24h后细胞凋亡情况;采用透射电镜检测不同浓度蟾毒灵作用人肝癌SMMC-7721细胞24h后胞内自噬体的形成情况;对人肝癌SMMC-7721细胞进行p-EGFP-LC3质粒转染,荧光显微镜下观察蟾毒灵作用人肝癌SMMC-7721细胞24h后LC3表达的情况;Western-blot检测细胞自噬标志蛋白LC3-Ⅰ/Ⅱ、Beclin 1、P62、ATG5表达的情况;q RT-PCR检测肿瘤细胞有氧糖酵解关键蛋白GLUT1、LDHA、HK2及自噬标志蛋白Beclin 1 m RNA的表达水平。第二部分自噬机制在蟾毒灵诱导人肝癌细胞增殖、凋亡及有氧糖酵解的作用采用MTT法、Annexin V-FIFC/PI双染法、Western-blot、q RT-PCR检测自噬抑制剂氯喹（Chloroquine,CQ）、自噬激活剂雷帕霉素（Rapamycin,RAPA）单独和联合100 n M蟾毒灵对人肝癌SMMC-7721细胞分别作用24 h后的细胞增殖抑制率、细胞凋亡、有氧糖酵解情况。采用人基因表达谱芯片检测蟾毒灵作用相关的靶标及信号通路。第三部分ROS及线粒体动力蛋白相关蛋白Drp1在蟾毒灵诱导人肝癌细胞死亡中的作用采用流式细胞术检测蟾毒灵干预人肝癌SMMC-7721细胞后ROS的产生水平;采用MTT法、Annexin V-FIFC/PI双染法、Western-blot、q RT-PCR检测ROS抑制剂NAC单独和联合100 n M蟾毒灵对人肝癌SMMC-7721细胞分别作用24 h后的细胞增殖抑制率、细胞凋亡、有氧糖酵解情况。构建Drp 1干扰和过表达质粒,病毒包装后感染SMMC-7721细胞,q RT-PCR检测NAC单独和联合100 n M蟾毒灵对细胞内HK2、Beclin1 m RNA表达水平的影响。第四部分蟾毒灵及NAC对人肝癌细胞增殖、凋亡、自噬、有氧糖酵解影响的体内研究构建人肝癌SMMC-7721细胞荷瘤裸鼠模型,裸鼠成瘤后,随机分为阴性对照组、蟾毒灵组[1.5 mg/（kg·d）]、NAC[300 mg/（kg·d）]组、蟾毒灵+NAC组,连续给药10天。测量肿瘤体积,免疫组化检测各组皮下瘤组织中有氧糖酵解相关蛋白及Beclin1、Cleaved Caspase-3蛋白表达情况。结果:第一部分蟾毒灵对人肝癌细胞增殖、凋亡、自噬、有氧糖酵解的影响1、蟾毒灵对四种人肝癌细胞增殖均具有一定的抑制作用,其抑制作用呈药物剂量依赖性;在相同浓度药物干预下,蟾毒灵对SMMC-7721、Bel-7402细胞增殖的抑制作用强于Hep G2、Hep3B细胞。流式细胞术检测结果提示,蟾毒灵能诱导人肝癌SMMC-7721、Bel-7402细胞凋亡,且呈药物剂量依赖性。2、蟾毒灵处理SMMC-7721细胞24 h后能降低细胞内自噬水平,且呈药物剂量依赖性。蟾毒灵作用SMMC-7721细胞24 h后,细胞浆LC3 dots低于空白对照组。Western-blot检测结果显示,LC3-II向LC3-I的转化比率和Beclin 1蛋白表达量随蟾毒灵作用剂量增加而逐渐降低。q RT-PCR检测结果显示,蟾毒灵能降低SMMC-7721细胞中GLUT1、LDHA、HK2、Beclin 1 m RNA的表达水平。第二部分自噬机制在蟾毒灵诱导人肝癌细胞增殖、凋亡及有氧糖酵解的作用1、CQ、RAPA分别联合蟾毒灵均能增强蟾毒灵对人肝癌SMMC-7721细胞增殖的抑制作用及细胞凋亡的诱导作用,CQ联合蟾毒灵作用效应强于RAPA联合蟾毒灵;2、CQ减弱蟾毒灵对SMMC-7721细胞中HK2 m RNA表达水平的抑制作用,而RAPA则增强蟾毒灵对SMMC-7721细胞中HK2 m RNA表达水平的抑制作用;Tab-Beclin 1诱导Beclin1的表达减弱蟾毒灵对SMMC-7721细胞中HK2 m RNA表达水平的抑制作用;3、人基因表达谱芯片结果IPA分析表明,蟾毒灵能显着激活SMMC-7721细胞中TNFR2 Signaling信号通路,上游调控因子TNF被预测为强烈激活。第三部分ROS及线粒体动力蛋白相关蛋白Drp1在蟾毒灵诱导人肝癌细胞死亡中的作用1、蟾毒灵能诱导人肝癌SMMC-7721细胞中ROS产生,且呈药物剂量依赖性;NAC联合蟾毒灵干预减弱了蟾毒灵对人肝癌SMMC-7721细胞增殖的抑制作用及细胞凋亡的诱导作用;2、NAC联合蟾毒灵干预能增强蟾毒灵对LC3-II向LC3-I的转化比率及Beclin 1、ATG5蛋白表达量的抑制作用,增加P62蛋白表达水平;NAC联合蟾毒灵干预能增强蟾毒灵对HK2 m RNA表达水平的抑制作用;3、Drp1敲减后能减弱蟾毒灵对SMMC-7721细胞Beclin1、HK2 m RNA表达水平的抑制作用;Drp1敲减增加了NAC联合蟾毒灵作用SMMC-7721细胞后胞内Beclin1、HK2 m RNA的表达水平。第四部分蟾毒灵及NAC对人肝癌细胞增殖、凋亡、自噬、有氧糖酵解影响的体内研究1、蟾毒灵能明显抑制人肝癌荷瘤鼠皮下瘤的生长,而NAC则能促进人肝癌荷瘤鼠皮下瘤的生长;联合NAC后,减弱了蟾毒灵对人肝癌荷瘤鼠皮下瘤生长的抑制作用;2、蟾毒灵抑制GLUT1、LDHA、HK2、PKM2、Beclin1的表达、诱导Cleaved Caspase-3表达上调。结论:1、蟾毒灵能抑制人肝癌SMMC-7721细胞增殖、自噬、有氧糖酵解、诱导细胞凋亡;2、联合自噬抑制剂可增强蟾毒灵对人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的诱导作用;3、蟾毒灵诱导细胞产生的ROS对其抑制人肝癌SMMC-7721细胞自噬呈负向调节作用,Drp1可能参与此调节过程;4、蟾毒灵通过作用于Drp1抑制Beclin1的表达而抑制HK 2的表达,进而抑制人肝癌SMMC-7721细胞有氧糖酵解。
程伟[6]（2019）在《基于HIF1α/VEGF信号通路研究天冬多糖抑制肝癌细胞迁移、侵袭和血管形成的机制》文中研究说明目的:研究缺氧诱导因子1α（HIF1α）mRNA在肝癌组织和癌旁组织或正常肝组织中的表达差异,及其与肝癌患者生存预后和临床病理特征的相关性,进一步明确HIF1α在人肝癌细胞SK-Hep1和Hep-3B中的功能。其后体外实验研究天冬多糖常氧和缺氧下对人肝癌细胞SK-Hep1和Hep-3B增殖,迁移,侵袭和血管形成的影响,并进一步探讨天冬多糖体外常氧和缺氧下对HIF1α/VEGF信号通路相关蛋白表达的影响。最后体内实验验证天冬多糖对裸鼠皮下肝癌细胞移植瘤生长及HIF1α/VEGF信号通路相关蛋白表达的影响。方法:利用Oncomine和GSE14520数据库分析人肝癌组织和癌旁组织或正常人肝组织中HIF1αmRNA表达差异。并用The Human Protein Atlas数据库免疫组化和12对人肝癌组织和癌旁组织免疫印迹进一步验证。通过GSE14520数据库分析HIF1αmRNA不同表达对肝癌患者总生存期（OS）和无复发生存期（RFS）的影响,及其与临床病理特征的相关性。构建HIF1α过表达和RNA干扰慢病毒肝癌细胞稳转株研究HIF1α对人肝癌细胞（SK-Hep1和Hep-3B）增殖、迁移、侵袭和血管形成的影响。用天冬多糖在体外常氧和缺氧下干预人肝癌细胞,观察天冬多糖在体外常氧和缺氧下对人肝癌细胞（SK-Hep1和Hep-3B）增殖、迁移、侵袭和血管形成的影响。通过ELISA、QRT-PCR、免疫印迹和免疫荧光实验明确天冬多糖在体外常氧和缺氧下对人肝癌细胞（SK-Hep1和Hep-3B）HIF1α和VEGF信号通路相关分子表达的影响。构建裸鼠皮下SK-Hep1移植瘤模型,观察天冬多糖对移植瘤生长的影响。后通过免疫组化和免疫印迹明确天冬多糖对移植瘤HIF1α和VEGF信号通路相关分子表达的影响。结果:1.人肝癌组织中HIF1αmRNA较正常人肝组织或癌旁组织表达明显上调,其结果被免疫组化和免疫印迹实验进一步验证。HIF1αmRNA高表达肝癌患者总生存期较短（P=0.048）,但无复发生存期无统计学差异（P=0.066）。HIF1αmRNA高表达肝癌患者更易于出现在TNM分期III期和BCLC分期C期肝癌患者中。成功构建HIF1α过表达和RNA干扰的慢病毒肝癌细胞稳转株,进一步验证了HIF1α可以促进人肝癌细胞（SK-Hep1和Hep-3B）的增殖、迁移、侵袭和血管形成。2.天冬多糖在体外常氧和缺氧下可明显地抑制人肝癌细胞（SK-Hep1和Hep-3B）的增殖、迁移、侵袭和血管形成,且具有一定的剂量依赖性。ELISA、QRT-PCR、免疫印迹和免疫荧光结果表明天冬多糖在体外常氧和缺氧下可抑制人肝癌细胞（SK-Hep1和Hep-3B）HIF1α和VEGF的表达。免疫印迹结果进一步表明天冬多糖在体外常氧和缺氧下可抑制p-AKT、p-m TOR和p-ERK蛋白的表达,但对AKT、m TOR和ERK蛋白表达影响不明显。3.天冬多糖在体内可以明显地抑制裸鼠皮下SK-Hep1移植瘤生长。免疫组化结果表明天冬多糖可抑制移植瘤HIF1α,VEGF和CD34蛋白表达。免疫印迹结果进一步表明天冬多糖可以抑制裸鼠皮下肝癌移植瘤HIF1α,VEGF,p-AKT和p-ERK蛋白的表达,但对AKT和ERK蛋白表达影响不明显。结论:1.HIF1αmRNA在肝癌组织高表达,HIF1αmRNA高表达的肝癌患者预后较差。HIF1α可明显地促进人肝癌细胞（SK-Hep1和Hep-3B）的增殖、迁移、侵袭和血管形成。2.天冬多糖在体外常氧下和缺氧下可明显地抑制人肝癌细胞（SK-Hep1和Hep-3B）增殖、迁移、侵袭和血管形成。机制研究表明天冬多糖体在外常氧和缺氧下可抑制人肝癌细胞（SK-Hep1和Hep-3B）HIF1α和VEGF表达。信号通路研究表明天冬多糖在体外常氧下和缺氧下可抑制人肝癌细胞（SK-Hep1和Hep-3B）p-m TOR、p-AKT和p-ERK蛋白的表达,但对m TOR、AKT和ERK蛋白表达影响不明显。3.天冬多糖在体内可抑制裸鼠皮下SK-Hep1移植瘤的生长。机制研究表明天冬多糖在体内可以抑制移植瘤HIF1α,VEGF,CD34,p-AKT和p-ERK蛋白的表达,但对AKT和ERK蛋白表达影响不明显。
张滢[7]（2018）在《蟾蜍灵对人脑胶质瘤细胞增殖及端粒酶催化亚基hTERT表达的影响》文中进行了进一步梳理目的:脑胶质瘤在中枢神经系统最多见,属原发性肿瘤,约占成人脑内肿瘤的45%-60%。恶性神经胶质瘤呈浸润性生长,易导致肿瘤细胞增殖、复发、迁移,使其难以完全治愈。治疗方法为手术切除,辅以术后放、化疗等。随着现代医学的进步,技术的发展,越来越多的手段被逐渐应用于胶质瘤的治疗中。药物治疗胶质瘤的相关机制尚不完全明了。胶质瘤在中医学属于脑瘤范围,我国古代文献中对“脑肿瘤”无明确病名记载,但在真头痛、癫痫、中风、眩晕、呕吐、厥逆等疾病中有一些类似症状的记述。依据传统医学观:整体观念和辩证论治,虽无“脑肿瘤”病名,但仍可采用“扶正祛邪”、“调整阴阳”的治疗原则。而蟾蜍灵的抗肿瘤作用是近几年的研究热点。本研究通过将蟾酥中提取的有效成分蟾蜍灵,分组处理脑胶质瘤细胞U87、U251,在时间、浓度各异的情况下,采用不同实验方法检测蟾蜍灵对脑胶质瘤细胞的影响,探索蟾蜍灵治疗脑胶质瘤的机制,为以后的研究者提供参考和思路。材料与方法:将购于中国科学院细胞库的人脑胶质瘤细胞株U87、U251进行体外培养,依据既往文献记录,配置浓度适宜的蟾毒灵,分别取6个浓度梯度,作用于两种胶质瘤细胞,分别培养24、48、72h,采用CCK-8法检测蟾蜍灵对胶质瘤细胞增殖抑制率,求出IC50。依据IC50计算出蟾蜍灵的适宜给药浓度。克隆形成实验检测胶质瘤细胞的增殖抑制,Western-blot测定人端粒酶逆转录酶（hTERT）的蛋白表达,real time PCR检测hTERT基因表达水平,CCK-8法检测蟾蜍灵对人原代胶质瘤细胞的杀伤作用,为临床采用蟾蜍灵治疗胶质瘤提供理论依据。结果:1.蟾蜍灵浓度在560nmol/L时,对U251细胞都有一定的抑制作用;蟾蜍灵浓度在20160nmol/L时,抑制U87细胞的增殖,且呈时间和剂量依赖性,蟾蜍灵浓度越高,作用时间越长,对两种胶质瘤细胞的抑制作用越明显。2.克隆形成实验结果显示,蟾蜍灵能够有效地抑制U251及U87细胞的克隆形成,呈时间和剂量依赖性。3.Western-blot结果显示,与对照组（不加蟾蜍灵组）相比,蟾蜍灵组明显抑制胶质瘤细胞hTERT蛋白表达,且随药物浓度增加而蛋白表达水平降低。4.实时荧光定量PCR结果显示,与对照组（不加蟾蜍灵组）相比,蟾蜍灵组U87、U251细胞hTERT-mRNA的表达降低明显。5.体外实验证明,蟾蜍灵对人原代胶质瘤细胞具有明显的杀伤作用。结论:1蟾蜍灵对体外培养的人脑胶质瘤细胞U87、U251以及人原代胶质瘤细胞都具有抑制增殖的作用,且呈时间和剂量依赖性。2蟾蜍灵对人hTERT的表达产生明显的影响,抑制hTERT的表达,进而降低端粒酶的活性,促进胶质瘤细胞的死亡。
彭盘俐[8]（2018）在《华蟾酥毒基抑制肺癌细胞A549增殖及诱导凋亡实验研究》文中研究表明背景肺癌是世界范围内最常见的恶性疾病之一,严重威胁人类的健康,发现新型有效的安全药物是目前肺癌治疗的急迫需要和研究动力。蟾酥,是从蟾蜍的皮肤和腮腺中提取的乙醇萃取物,在我国传统的抗癌治疗中应用广泛。华蟾酥毒基（Cinobufagin,CnBu）,是最新发现的从中华大蟾蜍的皮肤上提取的生物活性成分,被报道证实具有多种药理作用,是蟾酥的活性成分之一,对多种人类肿瘤细胞株有广谱细胞毒性,具有新型抗肿瘤活性。但是CnBu在人肺癌细胞的体内效应和作用机制尚未明确,相关的可行性实验非常少。目的在本实验中,我们通过体内和体外实验初步探讨CnBu在肺癌细胞中的抗癌活性及机制,旨在为CnBu的进一步临床应用提供实验依据以及参考。方法（1）使用CnBu、沙蟾毒精和蟾毒灵对人肺癌细胞系和对照细胞进行处理后,使用MTT法检测细胞活力。加入CnBu孵育24-48小时后,通过人工计数确定细胞迁移数。我们采用Transwell Boyden小室评估CnBu对A549细胞侵袭的影响。加入CnBu孵育24小时后,使用姬姆萨染色,通过人工计数定量侵袭细胞数。（2）我们应用TUNEL&DAPI联合染色试验试剂盒检测CnBu诱导的细胞凋亡。经测试药物处理后,使用特殊的Caspase底物及荧光法检测细胞内的Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性。荧光显微镜及线粒体特异性探针（MitoTracker Red CMXRos）分析CnBu处理后A549细胞中线粒体形态的改变。DHE荧光探针分析ROS在各组细胞内的含量,并对比加与不加ROS的清除剂NAC预处理的各组细胞的活力变化。（3）我们将A549细胞注射到雄性裸鼠右后胁,10天后,对裸鼠注射CnBu 28天。实验结束时将移植瘤切除并称重、测量尺寸;每个组织分别切片脱蜡HE染色,形态学检测及组织学观察,TUNEL&DAPI共染色试验检测各组肿瘤细胞切片凋亡情况;免疫荧光染色分析磷酸化p53免疫荧光成像。采用QW550图像分析软件半定量分析Ki67蛋白和磷酸化p53的表达。结果（1）结果提示,CnBu在肺癌细胞中较蟾毒灵和沙蟾毒精表现出更高的抗癌效果,IC50值范围为2.3-6.7μM。同时,CnBu比对照细胞表现出更低的毒性,IC50值为22.3μM,提示CnBu对肿瘤细胞和正常细胞有较高的选择性。CnBu同时表现出与剂量相关的阻碍A549细胞迁徙、入侵的特性。（2）此外,CnBu的处理提高肺癌细胞中Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性,有效地诱导A549细胞凋亡。抗癌治疗显着激活线粒体的裂解和ROS过度产生。有趣的是,抗氧化剂的添加明显减少CnBu诱导的细胞死亡,这一结果显示ROS在CnBu诱导的细胞凋亡过程中的重要作用。（3）最后,在体内实验中,我们的结果显示CnBu的处理诱导移植瘤细胞凋亡,上调了细胞增殖的生物标志物Ki-67蛋白及磷酸化的重要抗癌因子p53蛋白的表达。这些体内实验结果进一步验证了 CnBu的抗癌功能。结论我们的研究结果显示CnBu可能通过诱导细胞凋亡及提高磷酸化的p53蛋白的表达起到抑癌作用。
朱大诚,肖威[9]（2017）在《蟾酥抗肿瘤作用及其机制研究进展》文中指出经检索主要近五年蟾酥抗肿瘤作用研究的相关文献,发现蟾酥对胃癌、肝癌、肺癌、肠癌、妇科肿瘤、白血病等具有较好的治疗效果。文章就蟾酥抗肿瘤作用及其机制进行总结,旨在为其进一步应用于临床提供参考。
邓松华[10]（2017）在《天马颗粒剂的拆方研究及其精减方对大肠癌PI3K/Akt/mTOR信号通路的作用》文中指出目的:对天马颗粒剂进行拆方研究,通过删减非药效因素,优化天马颗粒剂的配方组成。观察天马颗粒剂精减方体内外抗肿瘤效果,并探讨其对PI3K/Akt/mTOR信号通路的作用。方法:（一）拆方研究:应用SPSS17.0软件,按17因素（17味中药）,2水平（原始剂量和0剂量）,建立正交表L20(217)进行分组。选用体重（200±20）g的SPF级SD大鼠,分别予20组药物,2次/天,连续灌胃7天,腹主动脉采血制备含药血清。20组含药血清以5%、10%、20%的浓度分别处理人大肠癌细胞HCT8、HCT116、HT29、CoLo320、SW480和SW620,分别作用24h、48h和72h,采用CCK-8法检测6种大肠癌细胞增殖活力,每组筛选出最佳细胞增殖抑制率,通过正交设计方差分析,推断天马颗粒剂原方中的有效药物。（二）体外实验:将天马颗粒剂精减方按成人剂量的2.5倍、5倍、10倍和原方按成人剂量10倍对SD大鼠灌胃制备含药血清。各组含药血清以5%、10%、20%的浓度分别处理人大肠癌细胞HCT8、HCT116、HT29、CoLo320、SW480和SW620,分别作用24h、48h和72h,采用CCK-8法检测6种大肠癌细胞增殖活力,筛选出敏感的细胞株及最佳增殖抑制的含药血清浓度、作用时间。用浓度为20%的各组含药血清处理HCT116细胞24h,观察细胞形态的变化,采用AnnexinV-PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡和PI单染法流式细胞术检测细胞周期。（三）体内实验:建立人大肠癌细胞HCT116移植瘤裸鼠模型,天马颗粒剂精减方低、中、高剂量、原方以及纯净水分别对移植瘤裸鼠灌胃,共4周。从给药当天起,每4天用游标卡尺测量各组移植瘤裸鼠肿瘤长短径1次并计算肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线;末次灌胃后处死移植瘤裸鼠,称量各组肿块的长短径和重量;采用Western blot法检测肿瘤组织PI3K/Akt/mTOR信号传导通路蛋白表达;采用肿瘤组织HE染色观察天马颗粒剂精减方体内抗肿瘤的效果。结果:（一）拆方研究:原方中蜈蚣、全蝎、半边莲、黄柏、三棱、大黄、胆南星、海藻、黄芪、山药在天马颗粒剂对大肠癌细胞的增殖抑制中,均发挥主要作用（均P<0.05）,且蜈蚣为方中主药（P=0.001）;而重楼、莪术、夏枯草、当归、党参、车前子、火麻仁在天马颗粒剂对大肠癌细胞的增殖抑制中无明显作用（均P>0.05）。（二）体外实验:（1）HCT116细胞的增殖抑制率均显着高于HCT8、HT29、Colo320、SW480和SW620（均P<0.05）;精减方高剂量组和原方组的20%含药血清对HCT116细胞的增殖抑制无显着差异（P>0.05）,但均显着高于其它组（均P<0.05）;精减方高剂量组20%含药血清作用24h、48h、72h的细胞增殖抑制率比较均无显着差异（均P>0.05）,原方组20%含药血清作用24h和72h的细胞增殖抑制率无显着差异（P>0.05）,且均显着高于作用48h的（均P<0.05）。（2）与对照组相比,各给药组的HCT116细胞变圆,透光性性差,部分细胞形态不规则,可见有细胞脱落漂浮于培养基中;天马颗粒剂精减方各组随剂量增加,细胞形态越来越不规则,透光性越来越差,漂浮的细胞逐渐增多,贴壁生长的细胞越来越稀疏。（3）各给药组HCT116细胞凋亡率与对照组比较均有显着性差异（均P<0.01）;精简方高剂量组的凋亡率与原方组比较无显着差异（P>0.05）,但均高于精减方低、中剂量组（均P<0.01）;精减方低、中、高剂量组的调亡率比较均有显着性差异（均P<0.01）。（4）天马颗粒剂精减方由低剂量到高剂量,随着浓度的增加,G0/G1期细胞逐渐增多,而S期细胞逐渐减少。精减方高剂量组G0/G1期细胞与原方组无显着差异（P>0.05）,均显着多于其它组（均P<0.05）;精减方高剂量组S期细胞和原方组无显着差异（P>0.05）,均显着少于其它组（均P<0.05）。G2期细胞差异无统计学意义（P>0.05）。（三）体内实验:（1）移植瘤体积比较,对照组与精减方低剂量组无显着差异（P>0.05）,与精减方中、高剂量组、原方组差异均有统计学意义（均P<0.05）。精减方低剂量组与中剂量组无显着差异（P>0.05）,与精减方高剂量组、原方组差异均有统计学意义（均P<0.05）;精减方中、高剂量组与原方组,任两组比较差异均无统计学意义（均P>0.05）。各给药组和给药时间的交互作用差异有统计学意义（F=77.659,P<0.01）;（2）移植瘤重量比较,各给药组均显着低于对照组（均P<0.01）;精减方高剂量组与原方组无显着差异（P>0.05）,但均显着低于其它给药组（均P<0.01）;（3）移植瘤相对增殖率比较,精减方低剂量组与精减方中、高剂量组及原方组差异均有统计学意义（均P<0.05）,精减方中、高剂量组、原方组任两组间比较,差异均无统计学意义（均P>0.05）,给药组和给药时间的交互作用有统计学意义（F=2.038,P<0.05）;（4）肿瘤组织PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白表达,各给药组与对照组差异均有统计学意义（均P<0.01）;精减方高剂量组和原方组无显着差异（P>0.05）;精减方低、中、高剂量组间差异均统计学意义（均P<0.01）。（5）移植瘤组织HE染色,各给药组均可见融合成片的坏死区域。随精减方剂量增加,凋亡细胞越来越多。精减方高剂量组和原方组均可见大量空泡,在坏死区域和肿瘤组织区域交界处大量炎症细胞浸润。结论:天马颗粒剂精减方的配方为:蜈蚣2g,全蝎3g,半边莲15g,黄柏6g,三棱10g,胆南星3g,海藻10g,黄芪20g,山药20g,大黄6g。天马颗粒剂精减方可抑制HCT116细胞增殖,诱导HCT-116细胞凋亡,使HCT-116细胞阻滞在G0/G1期。天马颗粒剂精简方可抑制HCT-116细胞移植瘤裸鼠移植瘤生长,可能与其下调PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白表达有关。天马颗粒剂精简方与原方体内外抗肿瘤效果无显着差别。
二、Anti-tumor effect of bufalin on the orthotopic transplantation tumor model of human hepatocellular carcinoma in nude mice（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Anti-tumor effect of bufalin on the orthotopic transplantation tumor model of human hepatocellular carcinoma in nude mice（论文提纲范文）
（1）川芎嗪对结肠癌细胞的抑瘤效应及改变线粒体活性氧代谢介导凋亡通路的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 文献研究 |
| 第一章 中医对结直肠癌病因病机及治疗的认识 |
| 1. 引言 |
| 2. 病症名称的历史沿革 |
| 3. 结直肠癌病因病机 |
| 4. 结直肠癌中医证候研究现状 |
| 5. 结直肠癌中医药治疗 |
| 6. 单味中药及其主要成分治疗结直肠癌的实验研究 |
| 7. 展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 川芎研究概述 |
| 1. 引言 |
| 2. 川芎的历史沿革 |
| 3. 川芎的功效与应用 |
| 4. 川芎主要有效成分川芎嗪的药理作用及临床外科应用 |
| 5. 展望 |
| 参考文献 |
| 第三章 川芎嗪在消化系统肿瘤中的抗癌机制研究进展 |
| 1. 引言 |
| 2. 抑制肿瘤细胞增殖 |
| 3. 促进肿瘤细胞凋亡和自噬 |
| 4. 诱导肿瘤细胞活性氧的生成 |
| 5. 抑制肿瘤细胞侵袭与转移 |
| 6. 抑制肿瘤组织血管生成 |
| 7. 逆转肿瘤细胞多药耐药 |
| 8. 展望 |
| 参考文献 |
| 第四章 活性氧信号通路与肿瘤的研究进展 |
| 1. 引言 |
| 2. ROS的来源与调节 |
| 2.1 ROS的来源 |
| 2.2 ROS的调节 |
| 3. ROS相关信号通路 |
| 3.1 ROS促进细胞增殖 |
| 3.2 DNA损伤和遗传不稳定 |
| 3.3 适应性 |
| 3.4 细胞死亡 |
| 3.5 自噬 |
| 3.6 抗药性 |
| 4. ROS在肿瘤治疗中的作用 |
| 4.1 诱导肿瘤细胞死亡 |
| 4.2 抑制肿瘤细胞增殖 |
| 5. 展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 川芎嗪对结肠癌细胞增殖及凋亡的影响 |
| 引言 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 细胞形态学实验 |
| 2.3 结晶紫染色测定细胞活性 |
| 2.4 CCK-8法检测细胞增殖 |
| 2.5 细胞周期检测 |
| 2.6 Annexin V/PI凋亡检测 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 TMP显着抑制结肠癌细胞增殖 |
| 3.2 TMP对结肠癌细胞的抑制作用具有浓度和时间依赖性 |
| 3.3 TMP通过抑制结肠癌细胞周期S期合成抑制细胞增殖 |
| 3.4 TMP诱导结肠癌细胞发生凋亡 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 活性氧对川芎嗪诱导的结肠癌细胞凋亡的调控机制研究 |
| 引言 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 DCFH-DA探针细胞内ROS检测 |
| 2.2 蛋白印迹实验（Western blot) |
| 2.3 统计学分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 TMP通过促进细胞内ROS产生来诱导结肠癌细胞发生凋亡 |
| 3.2 使用DCFH-DA探针检测结肠癌细胞内ROS的变化情况 |
| 3.3 TMP通过ROS介导结肠癌细胞发生线粒体途径凋亡 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 川芎嗪在裸鼠移植肿瘤中诱导凋亡作用 |
| 引言 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 主要材料 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 裸鼠移植肿瘤模型 |
| 2.2 丙二醛(MDA)检测 |
| 2.3 Caspase 3和Caspase 9蛋白活性检测 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 TMP在裸鼠移植肿瘤中具有抑制肿瘤增殖的效果 |
| 3.2 TMP增加裸鼠移植肿瘤内ROS积累并诱导凋亡 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 总结与展望 |
| 附录 |
| 攻读博士期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（2）华蟾素注射液治疗结肠癌腹水的优效人群分析及对VM的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 恶性腹水的中西医研究进展 |
| 1. 恶性腹水的西医研究进展 |
| 1.1 恶性腹水的形成机制 |
| 1.2 恶性腹水的西医诊断 |
| 1.3 恶性腹水的西医治疗 |
| 2. 恶性腹水的中医研究进展 |
| 2.1 恶性腹水的中医病因病机 |
| 2.2 恶性腹水的中医辨证 |
| 2.3 恶性腹水的中医治疗 |
| 3. 结语 |
| 参考文献 |
| 综述二 血管生成拟态(VM)在结肠癌中的研究进展 |
| 1. 结肠癌VM的发现及生物学特性 |
| 2. VM的形成机制 |
| 2.1 肿瘤缺氧微环境与VM |
| 2.2 肿瘤干细胞与VM |
| 2.3 上皮间质转化与VM |
| 2.4 促血管生成相关因子与VM |
| 2.5 VM形成相关信号通路 |
| 3. VM与结肠癌不良预后的相关性 |
| 4. VM与结肠癌的治疗 |
| 5. 结语 |
| 参考文献 |
| 综述三 华蟾素注射液干预肿瘤血管生成作用的研究进展 |
| 1. 肿瘤血管生成的病理机制 |
| 2. 华蟾素注射液的主要化学成分及其抗肿瘤作用 |
| 3. 华蟾素注射液干预肿瘤血管生成的机制 |
| 3.1 VEGF/VEGFR通路抑制作用 |
| 3.2 MMPs/TIMPs通路抑制作用 |
| 3.3 肿瘤血管内皮细胞诱导凋亡作用 |
| 3.4 其他潜在靶点 |
| 4. 结语 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 临床研究 华蟾素注射液腹腔灌注治疗结肠癌恶性腹水的疗效评价及优效人群分析 |
| 1. 资料与方法 |
| 1.1 研究方法 |
| 1.2 研究对象 |
| 1.3 病例筛选方法 |
| 1.4 治疗方法 |
| 1.5 提取指标 |
| 1.6 疗效评价 |
| 1.7 安全性评价 |
| 1.8 统计方法 |
| 1.9 技术路线图 |
| 2. 研究结果 |
| 2.1 总体资料分析 |
| 2.2 疗效评价 |
| 2.3 安全性评价 |
| 2.4 优效人群特征筛选 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 结肠癌恶性腹水的治疗现状 |
| 3.2 优效人群研究的必要性 |
| 3.3 华蟾素注射液治疗结肠癌恶性腹水的潜在机制 |
| 参考文献 |
| 第三部分 实验研究 基于血管生成拟态(VM)研究华蟾素注射液抑制结肠癌血性腹水的机制 |
| 实验一: 华蟾素注射液抑制裸鼠结肠癌血性腹水生成的研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验二: 华蟾素注射液体外抑制结肠癌细胞增殖、迁移、侵袭的研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验三: 华蟾素注射液体内、体外抑制结肠癌细胞VM形成的研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验四: 华蟾素注射液抑制结肠癌VM形成的机制研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 1. 研究结论 |
| 2. 研究创新性 |
| 3. 不足与展望 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）白花蛇舌草总黄酮对MFC胃癌小鼠抑瘤及免疫调节作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 MFC胃癌小鼠模型的建立 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物及细胞 |
| 1.2 饲养条件 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养溶液的配制 |
| 2.2 MFC细胞培养 |
| 2.3 MFC胃癌小鼠模型的建立 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二章 白花蛇舌草总黄酮对MFC胃癌小鼠抑瘤作用的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 饲养条件 |
| 1.3 白花蛇舌草总黄酮的制备 |
| 1.4 实验药物与试剂 |
| 1.5 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物模型建立 |
| 2.2 动物分组及给药 |
| 2.3 观察指标及方法 |
| 2.4 统计学处理方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 一般状态的评分 |
| 3.2 肿瘤生长曲线的绘制 |
| 3.3 瘤体观察及瘤重、抑瘤率的计算 |
| 3.4 对各组小鼠肿瘤组织病理学改变的影响 |
| 3.5 对各组小鼠血清中CEA、CA72-4 的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 阳性对照药物的选择 |
| 4.2 对各组小鼠肿瘤组织病理学改变的影响 |
| 4.3 对各组小鼠血清中CEA、CA72-4 的影响 |
| 第三章 白花蛇舌草总黄酮对MFC胃癌小鼠免疫作用的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 饲养条件 |
| 1.3 实验药物与试剂 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 模型建立 |
| 2.2 动物分组及给药 |
| 2.3 观察指标及方法 |
| 2.4 统计学处理方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 对各组小鼠脏器指数的影响 |
| 3.2 对各组小鼠血清中IL-2、IL-6 含量的影响 |
| 3.3 对各组小鼠肿瘤组织TLR4、My D88、NF-κB含量的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 对各组小鼠脏器指数的影响 |
| 4.2 对各组小鼠血清IL-2、IL-6 含量的影响 |
| 4.3 对各组小鼠肿瘤组织TLR4、My D88、NF-κB表达的影响 |
| 结语 |
| 1 结论 |
| 2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述 中药总黄酮抗肿瘤活性及机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（4）源于白钻的Gomisin M2抗乳腺癌干细胞机制及体内抗增殖作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 乳腺癌 |
| 1.2 肿瘤干细胞 |
| 1.3 中药及其活性化合物作为抗肿瘤干细胞的潜在疗法 |
| 1.4 斑马鱼作为肿瘤研究中的模式生物 |
| 1.5 肿瘤干细胞和乳腺癌 |
| 1.6 瑶药抗肿瘤研究进展 |
| 1.7 本课题研究意义 |
| 第二章 高内涵对瑶药白钻化合物体外抗肿瘤的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 CD44+/CD24-乳腺癌细胞系的分选以及生物学特性的鉴定研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 化合物GOMISIN M2对CD44+/CD24-乳腺癌干细胞系的影响研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 化合物GOMISIN M2对乳腺癌干细胞体外线粒体启动的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 实验结果与讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 化合物GOMISIN M2对三阴性乳腺癌细胞诱导凋亡的研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.3 实验结果与讨论 |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 GOMISIN M2诱导的抗乳腺癌干细胞体内斑马鱼异种移植以及信号通路的研究 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 材料与方法 |
| 7.3 实验结果与讨论 |
| 7.4 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 展望 |
| 本论文创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（5）自噬在蟾毒灵诱导人肝癌细胞凋亡及有氧糖酵解中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 蟾毒灵对人肝癌细胞增殖、凋亡、自噬、有氧糖酵解的影响 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第二部分 自噬机制在蟾毒灵诱导人肝癌细胞增殖、凋亡及有氧糖酵解的作用 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第三部分 ROS及线粒体动力蛋白相关蛋白Drp1 在蟾毒灵诱导人肝癌细胞死亡中的作用 |
| 一、引言 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 四、实验结果 |
| 五、讨论 |
| 六、小结 |
| 第四部分 蟾毒灵及NAC对人肝癌细胞增殖、凋亡、自噬、有氧糖酵解影响的体内研究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 蟾毒灵抗肿瘤机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（6）基于HIF1α/VEGF信号通路研究天冬多糖抑制肝癌细胞迁移、侵袭和血管形成的机制（论文提纲范文）
| 英文缩略语 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 HIF1α mRNA高表达与肝癌患者临床预后相关性的研究分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 肝癌患者癌组织和癌旁组织收集 |
| 1.2 细胞株 |
| 1.3 主要试剂和耗材 |
| 1.4 实验主要仪器 |
| 1.5 主要试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 数据库数据分析 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 人肝癌细胞病毒感染 |
| 2.4 QRT-PCR实验 |
| 2.5 免疫印迹实验 |
| 2.6 CCK-8实验 |
| 2.7 创伤愈合实验 |
| 2.8 Transwell基质胶侵袭实验 |
| 2.9 HUVEC基质胶血管形成实验 |
| 2.10 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 肝癌组织中HIF1α表达明显上调 |
| 3.2 HIF1αmRNA表达水平与肝癌患者临床病理特征的相关性 |
| 3.3 HIF1αmRNA过表达对肝癌患者生存预后的影响 |
| 3.4 HIF1α过表达和RNA干扰慢病毒稳转人肝癌细胞株的构建 |
| 3.5 HIF1α过表达促进了人肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭和血管形成 |
| 3.6 HIF1αRNA干扰抑制了人肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭和血管形成 |
| 4 分析与讨论 |
| 第二部分 体外天冬多糖通过HIF1α/VEGF信号通路抑制肝癌细胞迁移、侵袭和血管形成 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 天冬多糖储备液的配置 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 CCK-8实验 |
| 2.4 创伤愈合实验 |
| 2.5 Transwell基质胶侵袭实验 |
| 2.6 HUVEC基质胶血管形成实验 |
| 2.7 ELISA实验 |
| 2.8 QRT-PCR实验 |
| 2.9 免疫印迹实验 |
| 2.10 免疫荧光实验 |
| 2.11 统计方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 天冬多糖抑制人肝癌细胞的增殖 |
| 3.2 天冬多糖抑制人肝癌细胞的迁移和侵袭 |
| 3.3 天冬多糖抑制人肝癌细胞诱导的HUVEC细胞血管形成 |
| 3.4 天冬多糖抑制人肝癌细胞HIF1α和 VEGF的表达 |
| 3.5 天冬多糖调节MAPK和 PI3K信号通路抑制人肝癌细胞HIF1α表达 |
| 4 分析与讨论 |
| 第三部分 体外缺氧下天冬多糖通过HIF1α/VEGF信号通路抑制肝癌细胞迁移、侵袭和血管形成 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器 |
| 1.4 部分试剂的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 天冬多糖储备液的配置 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 CCK-8实验 |
| 2.4 Transwell迁移实验 |
| 2.5 Transwell基质胶侵袭实验 |
| 2.6 HUVEC细胞基质胶血管形成实验 |
| 2.7 ELISA实验 |
| 2.8 免疫印迹实验 |
| 2.9 免疫荧光实验 |
| 2.10 统计方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 天冬多糖常氧和缺氧条件下可明显地抑制人肝癌细胞的增殖 |
| 3.2 天冬多糖缺氧条件下可明显地抑制人肝癌细胞的迁移 |
| 3.3 冬多糖缺氧条件下可明显地抑制人肝癌细胞的侵袭 |
| 3.4 天冬多糖缺氧条件下可明显地抑制人肝癌细胞诱导的HUVEC细胞血管形成 |
| 3.5 天冬多糖缺氧条件下可明显地抑制人肝癌细胞HIF1α和 VEGF蛋白的表达 |
| 3.6 天冬多糖缺氧条件下通过调节MAPK和 PI3K信号通路抑制人肝癌细胞HIF1α蛋白的表达 |
| 4 分析与讨论 |
| 第四部分 体内实验研究天冬多糖通过HIF1α/VEGF信号通路抑制肝癌血管形成的机制 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 动物及饲料 |
| 1.3 主要试剂及耗材 |
| 1.4 实验主要仪器 |
| 1.5 部分试剂的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 天冬多糖储备液的配置 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 裸鼠皮下成瘤实验的实施 |
| 2.4 裸鼠肿瘤组织的病理检测 |
| 2.5 免疫印迹检测 |
| 2.6 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 天冬多糖抑制裸鼠皮下肝癌移植瘤的生长 |
| 3.2 天冬多糖抑制裸鼠皮下肝癌移植瘤血管生成 |
| 3.3 天冬多糖通过抑制MAPK和 PI3K信号通路抑制裸鼠皮下肝癌移植瘤的血管形成 |
| 4 分析与讨论 |
| 4.1 目前国内外肝癌临床抗血管生成治疗研究现状 |
| 4.2 目前国内外中医药抑制肿瘤血管生成体内实验研究现状 |
| 4.3 天冬多糖通过HIF1α/VEGF信号通路抗血管生成抑制荷肝癌小鼠肿瘤生长 |
| 创新点 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 已发表综述全文 中药多糖调节肿瘤免疫应答研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录2 在校期间第一作者发表或投稿论文 |
| 附录3 在读期间科研工作情况 |
（7）蟾蜍灵对人脑胶质瘤细胞增殖及端粒酶催化亚基hTERT表达的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（8）华蟾酥毒基抑制肺癌细胞A549增殖及诱导凋亡实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一章 华蟾酥毒基抑制肺癌细胞生长、迁移和侵袭 |
| 一 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 二 结果 |
| 1 抑制肺癌细胞生长检测结果 |
| 2 抑制肺癌细胞迁移和侵袭检测结果 |
| 三 讨论 |
| 四 小结 |
| 第二章 华蟾酥毒基诱导A549细胞凋亡作用 |
| 一 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 二 实验结果 |
| 1 TUNEL&DAPI共染色实验结果 |
| 2 Caspase活性检测结果 |
| 3 线粒体功能检测结果 |
| 4 活性氧检测实验结果 |
| 三 讨论 |
| 四 小结 |
| 第三章 体内实验验证华蟾酥毒基抑制肺癌的特性 |
| 一 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 二 实验结果 |
| 1 具有A549移植瘤的BALB/C裸鼠的体重及体积的检测结果 |
| 2 对A549移植瘤的抑制机理分析结果 |
| 三 讨论 |
| 四 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 成果 |
| 致谢 |
（9）蟾酥抗肿瘤作用及其机制研究进展（论文提纲范文）
| 1 抗肿瘤作用 |
| 1.1 临床应用 |
| 1.1.1 肝癌刘英芳等[1]用扶正散结汤 (黄芪18 g, 莪术12g, 骆 |
| 1.1.4 结直肠癌黄锦林等[12]报道了华蟾素注射液联合化疗治 |
| 1.1.5 胃癌孙永浩等[14]使用复方斑蝥抑瘤胶囊 (主要成分为 |
| 1.1.6 食管癌徐海平等[17]研究了华蟾素注射液在食管癌患者 |
| 1.1.7 胰腺癌李要轩[21]采用蟾酥注射液联合同步放化疗治疗 |
| 1.2 实验研究通过体外和动物实验发现, 蟾酥对肝癌、白血病、 |
| 1.2.1 肝癌细胞冯静等[23]使用蟾酥作用肝癌Hep G2细胞后, |
| 1.2.2 白血病细胞朱大诚等[27]发现蟾酥能够有效的抑制白血 |
| 1.2.4 肺癌细胞及其动物模型金军等[35]观察蟾酥注射液治疗 |
| 1.2.5 其它肿瘤细胞新近还有报道蟾酥通过诱导细胞凋亡达 |
| 2 抗肿瘤机制 |
| 2.1 诱导肿瘤细胞凋亡细胞凋亡可通过多种信号途径如线粒 |
| 2.2 抑制肿瘤细胞增殖正常细胞转变成为肿瘤细胞, 其与细胞 |
| 2.3 抑制肿瘤血管的形成血管新生是肿瘤生长、侵袭、转移过 |
| 2.4 免疫增强作用免疫功能水平直接影响到机体对肿瘤细胞 |
| 2.5 逆转肿瘤细胞多药耐药肿瘤多药耐药的产生既是正常细 |
| 2.6 促进或增强肿瘤细胞的分化肿瘤细胞极少分化和成熟, 这 |
| 3 展望 |
（10）天马颗粒剂的拆方研究及其精减方对大肠癌PI3K/Akt/mTOR信号通路的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 1 中医对大肠癌的认识 |
| 1.1 大肠癌的中医病名 |
| 1.2 病因病机 |
| 1.3 中医治法 |
| 2 天马颗粒剂 |
| 2.1 天马颗粒剂创制的理论基础 |
| 2.2 天马颗粒剂的来源 |
| 2.3 天马颗粒剂的临床应用 |
| 2.4 天马颗粒剂的实验研究 |
| 3 PI3K/AKT/MTOR信号通路 |
| 3.1 PI3K/AKT/MTOR信号通路的物质组成 |
| 3.2 PI3K/AKT/MTOR信号通路的活化过程 |
| 3.3 PI3K/AKT/MTOR信号通路对大肠癌发生发展的作用 |
| 4 研究内容 |
| 4.1 基于正交实验设计的拆方研究 |
| 4.2 筛选对精减方敏感的肿瘤细胞 |
| 4.3 精减方含药血清对HCT116 细胞凋亡和周期的影响 |
| 4.4 精减方对移植瘤裸鼠的抑瘤效果 |
| 第一章 基于正交实验设计天马颗粒剂的拆方研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验细胞及动物 |
| 1.1.2 实验药物 |
| 1.1.3 实验试剂 |
| 1.1.4 实验耗材和仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 正交交实验设计 |
| 1.2.2 含药血清制备 |
| 1.2.3 细胞培养 |
| 1.2.4 制作标准曲线 |
| 1.2.5 细胞增殖检测 |
| 1.3 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 20组含药血清对肿瘤细胞的增殖抑制 |
| 2.2 方差分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 拆方研究与正交实验设计 |
| 3.2 含药血清与血清药理学 |
| 3.3 CCK-8 法细胞增殖检测 |
| 3.4 天马颗粒剂精减方方解 |
| 4 结论 |
| 第二章 天马颗粒剂精减方的体外实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验细胞及动物 |
| 1.1.2 实验药物 |
| 1.1.3 实验试剂 |
| 1.1.4 实验耗材和仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 含药血清制备 |
| 1.2.2 细胞培养 |
| 1.2.3 细胞增殖检测 |
| 1.2.4 观察细胞形态 |
| 1.2.5 细胞凋亡检测 |
| 1.2.6 细胞周期检测 |
| 1.3 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 筛选敏感细胞、含药血清浓度和给药时间 |
| 2.2 HCT116 细胞形态改变 |
| 2.3 对HCT116 细胞凋亡的影响 |
| 2.4 对HCT116 细胞周期的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 细胞凋亡和ANNEXIN-V/PI双染法 |
| 3.2 细胞周期和PI染色法 |
| 4 结论 |
| 第三章 天马颗粒剂精减方的体内实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验细胞及动物 |
| 1.1.2 实验药物 |
| 1.1.3 实验试剂 |
| 1.1.4 实验耗材和仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.2 裸鼠造模 |
| 1.3 观察指标 |
| 1.3.1 肿瘤体积、质量和相对增殖率 |
| 1.3.2 移植瘤组织PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白检测 |
| 1.3.3 肿瘤组织HE染色 |
| 1.4 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 移植瘤体积和生长曲线 |
| 2.2 移植瘤重量 |
| 2.3 移植瘤相对增殖率 |
| 2.4 肿瘤组织AKT/PI3K/MTOR信号通路蛋白表达 |
| 2.5 移植瘤组织HE染色 |
| 3 讨论 |
| 3.1 裸鼠及移植瘤裸鼠模型 |
| 3.2 天马来颗粒剂精减方对移植瘤裸鼠肿瘤生长的影响 |
| 3.3 PI3K/AKT/MTOR信号通路 |
| 4 结论 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
四、Anti-tumor effect of bufalin on the orthotopic transplantation tumor model of human hepatocellular carcinoma in nude mice（论文参考文献）
- [1]川芎嗪对结肠癌细胞的抑瘤效应及改变线粒体活性氧代谢介导凋亡通路的机制研究[D]. 李华. 南京中医药大学, 2021(01)
- [2]华蟾素注射液治疗结肠癌腹水的优效人群分析及对VM的作用机制研究[D]. 王一同. 北京中医药大学, 2021(01)
- [3]白花蛇舌草总黄酮对MFC胃癌小鼠抑瘤及免疫调节作用研究[D]. 王雪. 甘肃中医药大学, 2021(01)
- [4]源于白钻的Gomisin M2抗乳腺癌干细胞机制及体内抗增殖作用的研究[D]. 杨业国. 华南理工大学, 2020(02)
- [5]自噬在蟾毒灵诱导人肝癌细胞凋亡及有氧糖酵解中的作用及机制研究[D]. 韩梦飞. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [6]基于HIF1α/VEGF信号通路研究天冬多糖抑制肝癌细胞迁移、侵袭和血管形成的机制[D]. 程伟. 上海中医药大学, 2019(03)
- [7]蟾蜍灵对人脑胶质瘤细胞增殖及端粒酶催化亚基hTERT表达的影响[D]. 张滢. 辽宁中医药大学, 2018(07)
- [8]华蟾酥毒基抑制肺癌细胞A549增殖及诱导凋亡实验研究[D]. 彭盘俐. 南方医科大学, 2018(01)
- [9]蟾酥抗肿瘤作用及其机制研究进展[J]. 朱大诚,肖威. 时珍国医国药, 2017(06)
- [10]天马颗粒剂的拆方研究及其精减方对大肠癌PI3K/Akt/mTOR信号通路的作用[D]. 邓松华. 湖南中医药大学, 2017(05)