一、硫酸软骨素酶的分离纯化及部分性质（论文文献综述）
赵娜[1]（2021）在《低分子量硫酸软骨素改善5XFAD小鼠认知功能与机制及其分子量与活性的关系研究》文中研究指明阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是多发于老年人的一种神经退行性疾病,患者症状为表现为进行性记忆障碍以及认知、语言和运动等多种功能衰退,这些症状进而发展为个性改变和行为异常,最终导致生活自理能力的丧失。AD的一个重要特征就是脑组织中的老年斑（senileplaque,SP）,而SP是由淀粉样蛋白β（amyloid β protein,Aβ）组成的。Aβ是淀粉样蛋白前体蛋白（amyloid precursorprotein,APP）的级联酶切产物。Aβ及其聚集体可扰乱神经元的能量代谢和钙稳态,促进细胞活性氧的生成,阻碍神经信号的传递,并导致神经元死亡;可持续活化神经胶质细胞,引发慢性炎症;还会引起tau蛋白的结构变化和细胞骨架的降解。课题组在前期研究中对鲨鱼软骨来源的硫酸软骨素（chondroitin sulfate,CS）进行过氧化氢降解,然后用超滤膜截留,获得平均分子量为3928Da的低分子量硫酸软骨素（low molecular weight chondroitin sulfate,LMWCS）。研究发现,该LMWCS可抑制Aβ引起的氧化应激,改善线粒体功能异常紊乱,进而抑制Aβ诱导的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y和大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞PC-12细胞的凋亡。而对侧脑室注射Aβ的AD模型小鼠,口服LMWCS能改善小鼠脑部的氧化应激,维持脑部能量代谢的稳定,改善脑部胆碱能功能,进而改善小鼠的相关行为学功能和指标。基于以上研究成果,本课题将采用5XFAD转基因小鼠评价LMWCS的抗AD活性,并进一步探究LMWCS对AD相关病理变化的影响。在此基础上,本课题将进一步探究CS寡糖的分子量与其抗AD活性和机制之间的关系,从而为LMWCS在抗AD药物应用上的研究提供指导。具体研究内容如下。（1）LMWCS对5XFAD转基因小鼠认知功能损伤的作用与机制研究采用前期研究中使用的LMWCS对2月龄的5XFAD转基因小鼠进行灌胃给药,设定低、中、高3个剂量组,分别为50mg/kg、150mg/kg和450mg/kg,连续给药3个月。采用Morris水迷宫（Morris water maze,MWM）试验和旷场试验（open field test,OFT）评价小鼠的兴奋性、活跃度、空间学习和记忆能力等行为学相关的指标。随后取小鼠的大脑,分离出海马和皮质,并提取各组织的蛋白。采用 ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）法测定小鼠海马中 Aβ1-42含量,并采用蛋白免疫印迹法（Western blot）测定小鼠海马和皮质中的APP及与 APP 酶切相关的酶 PS 1（presenilin l）、BACE1（β-site APP cleaving enzyme 1）和 ADAM10（adisintegrin and metalloproteinase family 10）的表达。采用 ELISA法测定小鼠海马中 IL-1β（interleukin-1β）、TNF-α（tumornecrosisfactorα）和 IL-6含量,并采用Western blot测定小鼠海马和皮质中与炎症相关的GFAP（glial fibrillary acidic protein）、TLR2（toll-like receptor 2）和 pERK 1/2（phospho-extracellular regulated protein kinases 1/2）的表达。利用生色底物法测定具有还原性的谷胱甘肽（glutathione,GSH）的含量;利用生色底物法测定GSH-Px（glutathione peroxidase）的活性;利用 MDA（malondialdehyde）和 TBA（thiobarbituric acid）的显色反应测定小鼠海马中MDA含量;利用氮蓝四唑显色法测定总SOD（superoxidedismutase）活性;,并用Western blott检测小鼠海马和皮质中SOD2的表达。采用Western blot检测phospho-tau（Ser404）的表达,以及与 Tau 蛋白磷酸化有关的酶 phospho-GSK3β（phospho-glycogen synthase kinase 3β）、CDK5（cyclin-dependent kinase 5）、p35 和 p25 的表达。结果表明,在MWM试验中,服用LMWCS的5XFAD小鼠,潜伏期有一定程度的缩短,穿过平台和目标象限的次数有一定的增加,在目标象限的路程和时间也有一定的延长;而在OFT中,LMWCS对5XFAD小鼠穿过中心区域的路程和总路程均有一定的提高。总的来说,LMWCS对5XFAD小鼠的兴奋性、活跃度、空间学习和记忆能力均有一定的改善。LMWCS使5XFAD小鼠海马和皮质中APP和PS 1的表达显着下降,对ADAM10和BACE1的表达也有一定的抑制作用,使5XFAD小鼠大脑中Aβ1-42含量显着下降,减少Aβ1-42的神经毒性。LMWCS显着降低5XFAD小鼠海马和皮质中GFAP和TLR2的表达,并降低5XFAD小鼠大脑中促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6的含量。这表明LMWCS通过阻碍炎症通路的激活而抑制免疫细胞的活化,减少5XFAD小鼠大脑中促炎因子的释放,达到抑制5XFAD小鼠脑部神经炎症的效果。LMWCS使5XFAD小鼠大脑内抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性不同程度地升高,从而使MDA显着下降,GSH显着升高,改善了 5XFAD小鼠脑部的氧化应激状态。LMWCS显着抑制了 5XFAD小鼠海马中Tau蛋白的过磷酸化,这可能是由于LMWCS对引起Tau蛋白过磷酸化的酶有一定的调控作用。综上所述,LMWCS对5XFAD小鼠脑部的Aβ分泌、神经炎症、氧化应激和Tau蛋白过磷酸化均有抑制作用,从而改善5XFAD小鼠的空间学习、空间记忆、好奇心、活跃度等多项行为学指标。（2）不同分子量的CS寡糖的制备和表征利用PCR技术从普通变形杆菌（Proteus vulgaris）的基因组中克隆出硫酸软骨素酶 ABCI（Chondroitinase ABCI,CHSase ABCI）的基因序列。利用 Gibson连接体系将该基因序列与大肠杆菌表达质粒pET-28a（+）连接,构建重组质粒pET-28a（+）-CHSase ABCI。将该重组质粒转入E.coli BL21进行表达。采用0.2 mg/L IPTG、20℃诱导表达 20h,表达出带有 6×His 标签的 CHSase ABC I（His-CHSase ABC I）。利用Ni2+-Sepharose亲和层析柱对His-CHSase ABC I进行分离纯化。对纯化后的His-CHSase ABC I的酶学特性进行分析,确定反应条件。用His-CHSase ABC Ⅰ对鲨鱼软骨来源的CS进行酶解,经过Bio-gel P10和HPSEC（high performance liquid size exclusion chromatograph）对酶解产物进行的分离和纯化,获得 CS DP2（disaccharide）、CS DP4（tetrasaccharide）、CS DP6（hexasaccharide）、CS DP8（octasaccharide）、CS DP10（decasaccharide,CS DP10）和 CS DP12（dodecasaccharide）。对纯化后的CS寡糖进行HPSEC检测和ESI-MS（electrospray ionization mass spectrometry）检测。结果表明,His-CHSase ABCI对CS有较好的底物特异性,其对CS的比酶活可达到2600.7 μmol/min·mg蛋白,而对透明质酸和肝素的比酶活则很低。His-CHSase Ⅰ酶解CS的最适pH为7.5、最适温度为37 ℃、反应体系中NaCl浓度应小于0.5 mol/L。为保证各CS寡糖产量,设定反应条件为,取双蒸水配制的CS溶液（80mg/mL）1 mL,加1个酶活单位的酶液,30℃反应10h。经过分离和纯化后,各CS寡糖的峰纯度均在95%以上。ESI-MS结果也表明各CS寡糖制备成功。（3）CS寡糖的分子量与抗Aβ诱导的氧化应激和线粒体功能紊乱活性的关系研究采用Aβ损伤的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞作为模型评价CS寡糖对Aβ引起的氧化应激和线粒体损伤的影响。采用MTT法测定及Annexin-FITC/PI双染法测定SH-SY5Y细胞凋亡情况。针对氧化应激的变化,采用Griess试剂显色法测定细胞NO生成情况,采用DCFH-DA荧光法测定细胞ROS生成情况,采用前文所述方法测定细胞MDA含量;用前文所述方法测定细胞总SOD和GSH-Px酶活性的变化;Western blot检测与氧化应激相关的酶的表达。针对SH-SY5Y细胞能量代谢的变化,采用荧光探针JC-1测定细胞线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP）的变化,用相应试剂盒测定细胞Na+/K+-ATP酶活性的变化。针对SH-SY5Y细胞凋亡通路,用Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3表达的变化。针对细胞对Aβ聚集体的摄取情况,用Alexa Fluor 647 succinimidyl ester对Aβ聚集体进行标记,然后与各CS寡糖进行共孵育,随后对细胞进行处理,采用流式细胞术测定细胞对Aβ聚集体的摄取情况。计算每个细胞的平均荧光强度（median fluorescence intensity,MFI）作为评价细胞摄取Aβ聚集体的指标。结果表明,对于Aβ损伤的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞,CS寡糖可以抑制Aβ引起的凋亡,这一作用是通过抑制Aβ引起的氧化应激和线粒体功能异常紊乱实现的,且随着CS寡糖分子量的增加,抑制作用逐渐增强。这是由于CS寡糖通过与Aβ聚集体的结合阻止SH-SY5Y细胞对Aβ聚集体的摄取,因此在本课题所研究的不同分子量的CS寡糖中,CS DP12具有最强的抑制活性。（4）CS寡糖的分子量与抗Aβ诱导的神经炎症活性的关系研究采用Aβ损伤的BV2细胞模型评价CS寡糖对Aβ诱导的免疫细胞活化的影响。采用CCK-8法测定BV2细胞活力的变化。针对BV2细胞的活化情况,采用ELISA测定细胞IL-1β和TNF-α的含量;针对BV2细胞炎症通路的变化,用Western blot测定TLR2和NF-κB表达的变化;针对细胞对Aβ聚集体的摄取情况,用Alexa Fluor 647 succinimidyl ester对Aβ聚集体进行标记,然后与各CS寡糖进行共孵育,随后对细胞进行处理,采用流式细胞术测定细胞对Aβ聚集体的摄取情况。计算每个细胞的MFI作为评价细胞摄取Aβ聚集体的指标。结果表明,对于Aβ孵育的BV2细胞,CS寡糖可以抑制Aβ对BV2细胞的活化,抑制促炎因子的生成和细胞内NF-κB的释放。随着CS寡糖分子量的增加,对Aβ诱导的对BV2细胞的炎症反应的抑制作用逐渐减小,CS DP2的抑制作用最强,这是由于不同分子量的CS寡糖阻碍了 Aβ聚集体与TLR2的相互作用,而其中CS DP2的抑制作用最强。综上所述,本课题采用5XFAD转基因小鼠作为模型,进一步验证了 LMWCS的抗AD活性,并发现其抗AD活性与其调控APP酶切过程、抗炎和抗氧化活性密切相关。CS寡糖分子量与抗AD活性的关系研究表明,CS寡糖通过与Aβ聚集体的结合阻止人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y对Aβ聚集体的摄取,从而抑制Aβ诱导的氧化应激和线粒体功能异常紊乱,最终抑制人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的凋亡。且随着CS寡糖分子的延长,其抑制作用逐渐增强。而在CS寡糖的分子量与其抑制Aβ引起的神经炎症的关系的研究中,CS寡糖通过阻碍Aβ聚集体与TLR2的结合而抑制BV2细胞的活化,从而减少炎症因子的释放,而其中CSDP2具有最强的抑制作用。以上研究结果进一步证实了 LMWCS的抗AD活性,并初步探究了基于不同机制,CS寡糖的分子量变化对其抗AD活性的影响,对于糖胺聚糖类药物的抗AD研究具有指导作用,为LMWCS作为抗AD药物的开发提供了依据。
盛安然[2]（2021）在《基于质谱的糖胺聚糖结构表征及其与蛋白互作分子机制研究》文中认为糖胺聚糖（Glycosaminoglycans,GAGs）是一类异质性极高、结构十分复杂的生物大分子,广泛存在于哺乳动物的细胞表面和细胞外基质中。GAGs的糖链骨架主要由己糖醛酸或半乳糖与己糖胺连接的重复二糖单元组成。根据糖苷键连接形式、硫酸化程度以及硫酸化位置的不同,可以将GAGs分为肝素/硫酸乙酰肝素（Heparan sulfate,HS）、硫酸软骨素/硫酸皮肤素（Dermatan sulfate,DS）、硫酸角质素和透明质酸四类。与其他GAGs相比,肝素和HS具有更多变的硫酸化位点和高的负电荷密度,并在生物体内参与多种生物学过程的调控,使其成为GAGs家族中结构最复杂且重要的一类多糖。由于GAGs糖链的分子量大、结构组成复杂,对于糖链结构的表征十分困难。目前,大多数分析方法都集中在对多糖整体的组成单元或寡糖片段的分析上,对于较高分子量的糖链由于色谱分离的分辨率较低难以被具体表征,而GAGs与其靶蛋白的相互作用通常需要一定的糖链长度。因此,本研究的第一个目标是开发适用于较大GAGs糖链的结构表征方法,为直接阐明这些具有更重要生物意义的相对较大的糖链结构提供强有力的工具。GAGs在许多生物过程中起至关重要的作用,包括细胞信号转导、识别、迁移和粘附等。在人体内,GAGs还参与多种疾病的发生和发展,例如肿瘤、炎症和传染性疾病。并且,GAGs还具有广泛的生物学活性,包括抗炎、抗凝、抗肿瘤转移和控制血管生成等。除了作为生物体内重要的活性物质外,GAGs也作为一类重要的生物药物在临床广泛使用了数十年。此外,用于治疗各种急性或慢性疾病的新型的GAGs药物也在持续不断的开发中。GAGs具有上述重要功能主要依赖于其与蛋白的相互作用,两者间的相互作用是通过各自结构中的特征序列特异性识别实现的。例如肝素的抗凝血作用是通过糖链中的一个特定的含有3-O-S的核心五糖序列与抗凝血酶III特异性结合实现的。因此,阐明GAGs与蛋白相互作用中的关键序列和分子机制对于寻找特定靶向GAGs-蛋白相互作用的新型疗法至关重要。本研究的第二个目标是以质谱（Mass spectrometry,MS）为主要技术手段,开发一套GAGs与蛋白相互作用分子机制的研究策略。我们选择以肝素及其相互作用蛋白干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-y）作为模式研究对象,从糖链长度和序列等方面阐明肝素与IFN-γ相互作用的分子机制,为更多GAGs与蛋白相互作用的研究提供快速准确的分析策略。本论文的主要研究成果如下:1.建立了一套聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）与MS联用的糖链分析方法PAGE是表征GAGs结构和性质的强大工具之一,相比于液相色谱方法具有更广泛的糖链分子量分布适用范围,但由于未能提供糖链结构信息,PAGE的应用十分受限。为此,我们将蛋白胶内酶解的策略应用到GAGs的分析中,利用聚丙烯酰胺凝胶可以脱水收缩及吸水溶胀的特点,建立了一套新的GAGs提取方法,将PAGE与具有超高灵敏度的LC-MS/MS结合进行GAGs糖链的表征。通过该方法我们对肝素糖链进行了全面的结构分析。从电泳银染结果看,肝素在PAGE中的分布是连续的,且条带之间没有明显的界限。我们将肝素条带等分成20段,分别进行胶内酶解和LC-MS/MS分析。在其中的12段凝胶中检测到了 8种来源于骨架结构的二糖和3种来源于非还原端（Non-reducingend,NRE）的饱和二糖。根据饱和二糖与骨架二糖的分子量和比例,计算得到糖链的分子量。在PAGE中,肝素糖链的分子量范围为3.9 kDa至46.8 kDa,平均分子量为14.4 kDa,且糖链的迁移距离与分子量的对数成反比关系。在不同的凝胶区间中,肝素糖链的二糖组成基本一致,这表明肝素糖链在PAGE中的分离,不受糖链负电荷密度的影响,按照分子量大小均匀且连续分布。我们还对比了直接酶解和胶内提取方法得到的肝素二糖,两者的二糖组成和含量基本一致,表明PAGE-MS方法能够保证GAGs糖链的结构信息完整。另外,经过方法验证,PAGE-MS方法还具有良好的可靠性和可重复性。PAGE-MS方法结合了 PAGE的高分离能力与MS的高灵敏度和高信息含量,为不同来源的肝素/HS糖链表征以及肝素药物的结构一致性评价提供了强大的工具支持。2.建立了一套琼脂糖凝胶电泳（Agarose-gel electrophoresis,AGE）与MS联用的糖链结构表征方法AGE是另外一种常被用于多组分GAGs糖链的直接分离分析的电泳方法。但由于凝胶性质不同,肝素酶难以进入琼脂糖凝胶,胶内酶解方法对AGE并不适用。因此,我们开发了一套针对AGE的样品提取方法。该方法是基于琼脂糖凝胶在相对较低的温度下加热即可熔化的特点实现的。含有糖链的AGE条带加热熔化为液体,经过强阴离子交换（Strong anion exchange,SAX）瞬时离心柱回收以及GAGs酶处理,得到的组成单元使用LC-MS/MS进行定性和相对定量分析,实现各组分糖链结构的表征。应用这一方法,我们选择了一种具有代表性的多分组GAGs药物舒洛地特进行结构分析。舒洛地特在琼脂糖凝胶中具有三个明显的条带,包括快速移动肝素（Fast-movingheparin,FMH）和DS两个主要的组分,以及含量极少的慢速移动肝素（Slow-movingheparin,SMH）。三个条带分别使用SAX提取和肝素酶或硫酸软骨素酶降解,最后经过优化后的LC-MS/MS方法分析。在FMH中,共定性和定量到17种基本组成单元,分别来自糖链的NRE、中间骨架、核心五糖及还原端（Reducingend,RE）结构。根据末端和骨架结构的比例计算,FMH的平均分子量为10.7 kDa。而在SMH中,共有13种结构被定量,平均分子量为15.4 kDa。根据两者的硫酸化程度判断,SMH具有更典型的肝素结构,FMH则可以看作是分子量较低的低硫酸化肝素。DS的糖链结构相对简单,共鉴定到13种基本组成单元,平均分子量为19.9 kDa。根据LC-MS/MS定量的舒洛地特的三个组成比例与AGE凝胶直接染色得到的结果基本一致。此外,我们还首次应用了核磁技术的一种扩散排序谱（Diffusion-ordered spectroscopy,DOSY）分析了舒洛地特,在谱图的不同扩散系数范围内分别归属到了肝素/HS和DS的特征信号峰,估算两者比例约为3:1,这一结果与AGE-MS方法得到的组成一致。AGE与MS与DOSY方法为直接表征多组分GAGs样品提供了新思路。3.采用氢氘交换-MS 法（Hydrogen/Deuteriumexchange-MS,HDX-MS）研究不同聚合度肝素糖链与IFN-γ的相互作用糖链长度是GAGs与蛋白相互作用的关键因素之一。我们将HDX-MS方法应用到不同聚合度肝素糖链与IFN-γ的相互作用的研究中,通过对不同肽段氘代率的变化和IFN-γ三维构象的分析,阐明两者的结合模式。首先从IFN-γ酶解产物中筛选出10条长度合适且能覆盖氨基酸全序列的肽段用于后续分析,其中包含文献报道的两个已知的肝素结合域D1（KTGKRKR）和D2（RGRR）。然后对氘代时间、肝素与IFN-γ结合比等条件进行优化,再将不同糖链长度的肝素与IFN-γ分别进行HDX-MS分析,计算得到各条肽段的氘代率变化曲线,并将它们分为稳定型、持续下降型、平台稳定型及多平台下降型四类。根据各类肽段氘代率的变化趋势与其在IFN-γ蛋白空间位置、碱性氨基酸分布及分子长度相结合,推测出当糖链长度较短时,糖链与IFN-γ表面的碱性氨基酸簇相互吸引;随着糖链长度增长,糖链在与D1相互作用的同时还向IFN-γ二聚体的另一侧延伸;当糖链长度达到dp20左右时,可以同时覆盖IFN-y二聚体的两个D1区域;并在dp28时糖链与二聚体的构象达到稳定,部分肽段的氘代率不再发生变化,同时糖链开始进一步固定D2区域。在此过程中,IFN-γ的局部构象也因相互作用发生了改变。GAGs与蛋白的HDX-MS分析,不仅可以得到蛋白的特征结合域和构象变化等信息,还可以阐明不同聚合度糖链与蛋白的结合方式,为GAGs与蛋白相互作用的研究提供了强有力的技术支持。4.表征了肝素与IFN-γ相互作用的糖链序列结构GAGs糖链中包含的特殊序列对多糖与蛋白的结合至关重要。我们基于亲和色谱、质谱以及计算机技术,对肝素糖链中IFN-γ的特征结合序列进行了表征。不同聚合度的肝素糖链首先使用IFN-γ亲和柱富集得到具有亲和性的糖链,经LC-MS分析,与未经富集糖链相比,亲和糖链的糖链长度和硫酸化程度较高。分离得到亲和糖链中的dp8进行测序分析。为了解决MS/MS测定复杂混合寡糖序列的难题,我们开发了一款计算机辅助测序软件,该软件是将相同聚合度的混合糖链的二糖组成经过排列组合和概率计算,得到所有可能的糖链序列及其相对含量。亲和dp8经过计算机软件计算和二级质谱测序,最终得到5个确定的糖链序列。这些结构都包含一个五糖序列“-GlcNS6S-IdoA2S-GlcNS6S-IdoA2S-G1cNS6S-”,这一结构无论从单糖个数、硫酸化程度还是序列对称性都满足与二聚体IFN-γ的任意一个D1区域相互作用。并且,在亲和dp24中,含有两个能分别与二聚体IFN-y的两个D1相互作用五糖序列的糖链含量比未经富集的糖链增加了 1.7倍,这一结果也从侧面说明糖链与IFN-γ两个C末端相互作用需要至少两个全硫酸的五糖结构。另外,IFN-γ与五糖序列的分子对接结果表明,糖链主要与D1区域结合,且更易受到IFN-γ两个C端中心区域的碱性氨基酸吸引。两者的结合是由静电力主导,并且D1区域中的四个碱性氨基酸残基和五糖中几乎所有的酸性基团都参与了两者的相互作用。计算机对接结果进一步说明肝素糖链中的五糖结构在两者结合中的重要性。这一序列的发现为设计人工干预IFN-γ的靶向药物提供了重要的理论依据。同时,亲和色谱、计算机辅助测序和质谱测序以及分子对接相结合的分析策略也可以用于更多GAGs特征序列的研究。
张庆冬[3]（2021）在《外切型肝素酶的发现、催化机制研究以及应用》文中研究说明肝素（Heparin,HP）/硫酸乙酰肝素（Heparan sulfate,HS）是由重复二糖单元组成的一类线性的聚阴离子酸性多糖,是一类重要的糖胺聚糖（Glycosaminoglycan,GAG）。HP/HS广泛地分布于细胞表面或细胞间基质中,甚至在某些细胞内环境中也有发现。自1935年起,HP由于其良好的抗凝血活性被广泛地应用于临床治疗中。由于HP/HS在生物合成过程中,其多糖骨架在众多修饰酶的作用下,形成了异常复杂的结构,使得HP/HS能与多种活性蛋白分子相互作用进而参与影响一些生理及病理过程。尽管高度复杂的结构赋予了HP/HS多种多样的生物学活性,但同时也阻碍了研究学者们对HP/HS构效关系的研究。细菌来源的肝素酶（Heparinase,Hepase）是一类专一性降解HP/HS底物的多糖裂解酶。Hepases在HP/HS的构效关系研究、HP/HS寡糖及低分子肝素（Low-molecular-weight-heparin,LMWH）的制备过程中具有着重要的应用。已鉴定的肝素酶分为三类:Hepase Ⅰ、Hepase Ⅱ和Hepase Ⅲ,均为内切型裂解酶。然而,对HP/HS结构研究非常重要的外切型肝素酶（exoHepase）却一直未见报道。我们从 NCBI（The National Center for Biotechnology Information）数据库中筛选到了 5个来自PL152亚家族的exoHepase基因,并对它们进行了克隆表达纯化和深入的酶学性质、底物特异性研究、结构研究以及初步应用。主要成果包括以下几个方面:（1）PL152亚家族肝素酶的筛选及活性鉴定:我们从NCBI数据库中筛选了 5个指认为Hepase的候选基因,分别命名为BIexoHep、BCexoHep、BTexoHep、PAexoHep和BFexoHep。通过对它们进行生物信息学分析,我们发现BIexoHep、BCexoHep、BTexoHep、PAexoHep 和 BFexoHep 归类于 PL152 亚家族,并且它们基本由N端的信号肽,DUF4962结构域以及C端Hepase-Ⅱ-Ⅲ家族结构域组成。并且,它们与已鉴定的肝素酶Hepase Ⅰ,Hepase Ⅱ和Hepase Ⅲ相似度极低,反而与来源于PL151亚家族的外切型褐藻胶裂解酶Atu3025相似度最高。在对BIexoHep、BCexoHep、BTexoHep、PAexoHep 和 BFexoHep 进行异源表达纯化并验证活性之后发现,它们仅降解HP/HS底物,并不降解褐藻胶底物,其中它们对HP底物的活性远高于对HS底物的活性。因此我们得出结论,PL15家族的两个亚家族的酶类具有不同的底物选择性:PL151亚家族中的裂解酶专一性地降解褐藻胶底物;PL152亚家族中的裂解酶专一性地降解HP/HS底物。（2）PL152亚家族肝素酶的酶学性质研究:由于BIexoHep、BCexoHep、BTexoHep、PAexoHep和BFexoHep对HP/HS底物的酶活较低,因此我们首先制备了一批硫酸化度较高的底物HP-FαⅢ（Hepase Ⅲ降解HP的终产物）来对PL152亚家族肝素酶的酶学性质进行研究。实验结果证明:PL152家族的肝素酶大多适应于中性pH以及低温环境,如20℃。当环境温度高于30℃时,它们的酶活急剧下降,表明它们对温度比较敏感。研究显示,Co2+、Hg2+、Ni2+、Pb2+、Cu2+和Zn2+等重金属离子均能对PL152家族的肝素酶的酶活产生强烈的抑制作用。二价金属离子如Ca2+、Ba2+和Mg2+等能对这些肝素酶的活性产生明显的促进作用,与之相应的,二价金属离子螯合剂EDTA和EGTA均能对这些肝素酶的活性呈现出不同程度的抑制作用,表明二价金属离子在PL152亚家族的肝素酶的活性中发挥着非常重要的作用。此外,适当浓度的盐（NaCl或KCl）能够显着地促进上述PL152亚家族肝素酶酶活,表明盐参与了该类肝素酶的催化过程。经研究,BIexoHep、BCexoHep、BTexoHep、PAexoHep 和 BFexoHep 对 HP-FαⅢ的酶活分别为 49.89、61.86、26.75、24.25 和 12.15 U/mg。BIexoHep 和 BCexoHep对 HP 的比酶活分别为 0.75 和 1.14 U/mg。BTexoHep、PAexoHep 和 BFexoHep对 HP 的比酶活极低,小于 0.5 U/mg。此外,BIexoHep、BCexoHep、BTexoHep、PAexoHep和BFexoHep对HS的比酶活均远小于0.5 U/mg。以上结果表明,PL152亚家族的肝素酶倾向于降解硫酸化度较高的底物。（3）PL152亚家族肝素酶的降解模式及降解方向研究:我们分别用PL152亚家族的肝素酶 BIexoHep、BCexoHep、BTexoHep、PAexoHep 和 BFexoHep 对HP多糖进行时间梯度降解,发现在降解过程中仅生成不饱和HP二糖产物,在该过程中没有明显的大分子量不饱和寡糖被检测到;之后我们又用它们对饱和的HP十三糖（DP13）进行时间梯度降解,同样的,在降解过程中仅生成不饱和HP二糖产物。这说明它们都是之前一直未见报道的外切型肝素酶（exoHepase）。进一步地研究表明,本论文中的PL152亚家族的exoHepases不能降解还原端荧光标记的HP DP13,意味着HP糖链还原端标记引入的荧光基团阻碍了 PL152亚家族exoHepases对底物的降解,从而证明该类酶对底物的降解是从还原端开始的,并以二糖为单位向非还原端逐次切割底物。这是Hepases研究领域首次发现的外切型肝素酶,不但填补了该领域的空白状态,更为HP/HS的构效关系研究提供了亟需的工具酶。（4）exoHepases的底物结构选择性研究:为了探究这类PL152亚家族exoHepases的底物特异性,我们首先制备了一些结构确定的HP四糖,分别为:P4-4（AUAl-4GlcNAc6S 1-4GlcA1-4GlcNS6S 和ΔUA1-4GlcNAc6S 1-4IdoA1-4GlcNS6S）、P4-5（AUA1-4GlcNS 1-4GlcA 1-4GlcNS6S和 ΔUA1-4GlcNS1-4IdoA1-4GlcNS6S）、P4-6（ΔUA 1-4GlcNS6S 1-4GlcAl-4GlcNS6S）、P4-7（AUA2S1-4GlcNS6S 1-4GlcA 1-4GlcNS6S）和 P4-8（ΔUA2S1-4GlcNS6S1-4IdoA2S1-4GlcNS6S）。研究发现,HP 四糖 P4-4、P4-5、P4-6、P4-7和P4-8均能被过量的exoHepases彻底降解,说明exoHepases对底物中的糖醛酸构型没有选择性。然而,我们发现exoHepases对糖醛酸构型存在不同的倾向性:exoHepases倾向于降解含IdoA2S的底物,其次为含GlcA的底物,相比之下,对含IdoA的底物的偏好性最差。此外,exoHepases倾向于降解硫酸化度较高的底物,底物的硫酸化度越高,如P4-8（六硫酸化HP四糖）,则exoHepases酶活就越高;底物的硫酸化度越低,如P4-4（三硫酸化HP四糖）,则exoHepases酶活就越低。该种现象解释了为什么exoHepases对高硫酸化度的HP底物降解活性好,却对低硫酸化度的HS底物降解活性好差。尽管exoHepases对高硫酸化度的底物降解活性较强,然而当底物中有3-O硫酸化修饰时,如磺达肝癸钠,便对exoHepases的活性产生了抗性,不能被降解完全。（5）exoHepases的结构及催化模式研究:通过对所鉴定的exoHepases中一个代表性酶BIexoHep进行结构研究,我们发现BIexoHep的结构主要由三个结构域组成:N末端小的β-折叠结构域,中心（α/α）5不完整桶状结构域和C端β-三明治结构域。BIexoHep的晶体结构呈现为单体而不是二聚体形式,并且每个BIexoHep蛋白分子中都含有两个Ca2+。BIexoHep难以单独成晶,需要与HP二糖产物共结合方能产生稳定的蛋白晶体。BIexoHep的结构与已鉴定的肝素酶Hepase Ⅰ、Hepase Ⅱ以及Hepase Ⅲ的结构之间相似度很低,但是通过将BIexoHep与Hepase II叠加分析发现,两者的的活性中心组成尤为相似,意味着两者的催化机制可能存在一定的相似性。关键氨基酸突变研究揭示了 BIexoHep的潜在底物催化机制:（1）降解含IdoA的底物时,His337作为Bronsted碱夺取IdoA中C5的质子,而Tyr390充当Bronsted酸向1-4糖苷键中的氧提供质子,从而完成β消除反应;（2）当降解含GlcA的底物时,Tyr390将同时充当Bronsted碱和酸完成β消除反应。进一步,通过制备和解析BIexoHep与HP四糖底物的共晶结构,我们发现在BIexoHep的结构中,有一个半开放的、狭长的呈“L”形的催化腔。BIexoHep特殊的半开放“L”形反应通道由两个几乎相互垂直的部分组成:带正电荷的进口部分与带负电荷的出口部分。正是该特殊反应通道的存在,赋予了 BIexoHep外切酶活性。结合关键氨基酸突变实验,我们提出exoHepases的底物外切催化机制假设:（1）首先,环境中带负电荷的游离HP糖链在电荷吸引的作用下,其还原端与“L”反应通道带正电的入口部分结合;（2）在电性吸引的作用力下,HP糖链深入“L”反应通道带正电的入口部分,一旦还原端二糖到达“+1”和“+2”位点,还原端二糖将通过β-消除机制被降解下来;（3）被降解下来的HP不饱和二糖在带负电荷的氨基酸残基Asp335的电性排斥作用下,迅速地被推入带负电荷的出口部分,然后在氨基酸残基Pro67和Asp281电性排斥作用下迅速从出口释放。（6）exoHepase的初步应用:我们利用exoHepases从HP/HS底物还原端以二糖为单位进行酶解的特性开发出了一种新型的HP/HS酶学测序方法。该测序方法通过用BIexoHep对HP不饱和寡糖进行不完全降解,进而制备相应的非还原端UDP4、UDP6、UDP8...UDP2n。然后,通过分析比较这些不饱和寡糖的二糖组成,进而推测出完整的HP寡糖序列。在本论文中,我们运用该方法,成功地对 5 种HP 八糖进行了初步测序,分别为:P8-1ΔUA1-4GlcNS6S 1-4HexA2S 1-4GlcNS6S-4HexA2S 1-4GlcNS6S 1-4HexA2S 1-4Glc NS、P8-2ΔUA 1-4GlcNS6S 1-4HexA2S 1-4GlcNS-4HexA2S 1-4GlcNS6S 1-4HexA2S 1-4GlcNS 6S、P8-3ΔUA1-4GlcNAc（S）1-4HexA2S1-4GlcNS6S-4HexA2S1-4GlcNS6S1-4HexA1-4GlcN S6S、P8-4ΔUA1-4GlcNS6S1-4HexUA2S 1-4GlcNS6S 1-4HexUA2S1-4GlcNS6S1-4HexUA2S1-4GlcNS6S 和P8-5△UA1-4GlcNAc（S）1-4HexA2S 1-4GlcNS6S1-4HexA2S1-4GlcNS6S1-4HexA2S1-4G lcNS6S。该方法操作简易,以二糖为单位对HP寡糖进行序列鉴定,大大地简化了实验步骤;利用荧光标记,极大的降低了样品的用量和提高了分析检测的灵敏度;理论上该方法不仅能对复杂HP八糖进行测序,还可以对更大分子量的HP/HS寡糖进行序列分析。本论文对来自PL152亚家族的5个exoHepases进行了详细的酶学性质研究、底物特异性研究、三维结构与催化机制研究和初步应用。本论文对exoHepases的研究不仅填补了 Hepases领域的空白,更是为HP/HS结构研究提供了潜在的工具酶。
李晔,陈振娅,王瑞丽,沈荣,危晴,陈亮[4]（2020）在《不同连接肽在硫酸软骨素酶ABC I重组表达中的应用研究》文中认为硫酸软骨素酶ABC I（ChSase ABC I）是一类能够将硫酸软骨素、软骨素、透明质酸等糖胺多糖降解为寡糖及不饱和二糖的裂解酶。该研究将硫酸软骨素酶ABC I基因与麦芽糖结合蛋白（MBP）基因分别用FFFFF和RRRRR两种连接肽连接,并克隆到pMAL-c2X载体上,在大肠杆菌（Escherichiacoli）BL21（DE3）高效表达。结果表明,重组酶MBP-FFFFF-ChSase ABCI的酶活和比酶活分别为716.5 IU/L发酵液和1.15 IU/mg蛋白,重组酶MBP-RRRRR-Ch Sase ABC I的酶活和比酶活分别为741.0 IU/L发酵液和1.13 IU/mg蛋白。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果表明,重组酶MBP-FFFFF-Ch Sase ABCI和MBP-RRRRR-Ch Sase ABCI的分子质量均为130kDa,并且都为可溶性蛋白。
刘茜茜[5]（2020）在《岩藻糖化糖胺聚糖部分酸水解的动力学及其产物的结构研究》文中指出岩藻糖化糖胺聚糖（Fucosylated glycosaminoglycan,FG）是存在于海参体壁的结构特殊的糖胺聚糖（Glycosaminoglycan,GAG）衍生物。一般认为FG具有类似硫酸软骨素（Chondroitin sulfate,CS）的由-3-Gal NAc-β1-和-4-Glc A-β1-交替连接形成的主链,而存在大量岩藻糖侧链（Fuc）取代。天然FG具有强效的抗凝与抗血栓活性,其机制涉及抑制内源性因子X酶（intrinsic factor tenase,i Xase）以及肝素辅因子II（HCII）依赖的抗凝血酶活性等。FG结构复杂且分子量较大,在其化学结构研究中,常采用部分酸水解（partial or mild acid hydrolysis）处理以选择性地水解FG的硫酸化岩藻糖（Fucose sulfate,Fuc S）侧链,继而分别分析主、侧链结构并通过“bottom-up”（以结构片段拼接完整结构）策略解析FG结构;而在构-效关系研究中,部分酸水解可用于分析Fuc S侧链对其活性的影响。研究显示,部分酸水解处理后,侧链水解程度与温和酸处理的条件相关,增强酸处理强度可增加侧链水解程度,但可能导致部分硫酸酯基和/或主链糖苷键水解。硫酸酯基水解可影响对侧链Fuc S以及CS主链类型的判断;结合甲基化分析等方法解析FG结构时,硫酸酯基水解还可导致对侧链连接位点的误判。鉴于温和酸处理条件与FG侧链水解程度、硫酸酯基水解及主链水解程度的相关性尚未得到澄清,本文拟采用化学结构相对清晰和规则的天然FG,系统分析FG温和酸处理影响主侧链结构及其化学动力学过程,为该方法的技术应用提供清晰的理论依据。本文采用的天然FG包括花刺参（S.variegatus）和象牙参（H.fuscopunctata）体壁FG（Sv FG和Hf FG）。1.FG部分酸水解产物理化性质选择不同的反应温度及反应时间,以0.1M H2SO4处理Sv FG和Hf FG,分离反应产物获得主链（backbone,Bb）部分和侧链（side chaine,Sc）部分;以比旋光度、IR光谱及1H NMR波谱分析所得Bb的基本结构特征;分别采用HPGPC、1H NMR和电导率法分析所得Bb的分子量（weight average molecular weight,Mw）、岩藻糖水解程度（degree of defucosylation,DF）和硫酸酯基（SO3-）含量。实验结果显示,所得Bb的Mw、DF值以及SO3-含量均随反应时间和反应温度增加而减小。2.FG部分酸水解的动力学研究在60?C下,以0.1M H2SO4处理FG,分别于0.25,0.5,1,1.5,2,3,4.5,6,12,18,24和36 h取样并分离Bb部分（Bb-1～-12）,分析所述反应条件下的侧链Fuc S（DF）、硫酸酯基（DS）和主链糖苷键（DH）的水解动力学过程。对（1-DF）、DS和DH-反应时间曲线进行拟合,其速率方程分别为（1-DF）=0.45119+0.4692×e–0.1732t（r2=0.94）、DS%=0.17593-0.13692×e-0.04690t（r2=0.93）和DH=0.02144-0.02284e-0.04227t（r2=0.84）,基本符合一级动力学。其中,Fuc S的水解速率常数(0.0223 h-1)高于硫酸酯基的水解速率(0.0041 h-1,约5.44倍)和主链糖苷键的水解速率(0.0005 h-1,约44.6倍)。根据DF、DS和DH反应速率常数k,计算Sv FG在0.1M H2SO4中50～80?C下水解的反应活化能分别为53.58、92.70、118.92 k J/mol。比较Sv FG和Hf FG的水解动力学过程可见,Fuc3S4S比Fuc2S4S在稀酸中更敏感,更易水解;侧链部分（Sc）的1H NMR分析显示,随着反应时间延长（或温度升高）,部分酸水解过程中侧链硫酸酯基水解程度加深,其中Fuc的O-2/3位硫酸酯基比O-4位硫酸酯基在稀酸中更敏感,更易水解。3.FG部分酸水解侧链（Sc）的结构解析采用1D/2D NMR方法分析了侧链Sc8-1、Sc9-1和Hf Sc1-2的化学结构,解析了六种类型的α/β-Fuc碳氢信号,包括Fuc2S4S、Fuc2S、Fuc3S4S、Fuc3S、Fuc4S和Fuc(除β-Fuc2S外),并通过Sc9和Sc18的ESI-MS谱图确认,侧链中存在单硫酸化和二硫酸化类型的Fuc。而原型Sv FG和Hf FG分别主要含Fuc2S4S和Fuc3S4S,表明岩藻糖侧链在FG的部分酸水解反应中发生了不同程度的硫酸酯基水解。4.FG部分酸水解主链（Bb18）及其寡糖的结构解析主链产物Bb18的1D和2D NMR图谱显示,Gal NAc（A）和Glc A（U）通过β1-3或β1-4糖苷键连接,而在水解时会断裂,形成α/β构型的A或U还原末端。由于主链硫酸酯基水解,形成了不同类型的Gal NAc,该结果进一步通过其寡糖结构确认。采用凝胶层析法从Bb18中分离获得不同分子量的寡糖组分h1～h6,其氢谱的基本结构特征相似。通过强阴离子交换色谱法从还原后的h6分离纯化了寡糖h6a～h6d,结构式如下:h6a:D-β-Glc A-（1,3）-D-β-Gal NAc4S(or 6S)-（1,3）-D-Glc A-ol;h6b:D-β-Glc A-（1,3）-D-β-Gal NAc4S6S-（1,3）-D-Glc A-ol;h6c:D-β-Gal NAc4S6S-（1,3）-D-β-Glc A-（1,3）-D-Gal NAc6S-ol;h6d:D-β-Glc A-（1,3）-D-β-Gal NAc-（1,3）-D-Glc A-ol;采用相同的方法,从h5分离纯化了寡糖h5b～d,NMR结构解析显示h5b和h5c均为相似的四或五糖混合物,但Gal NAc类型有差异;h5d结构式如下:L-α-Fuc2S4S-（1,3）-D-β-Glc A-（1,3）-D-β-Gal NAc6S-（1,3）-D-α/β-Glc A;从h4分离纯化了寡糖h4a～d,结构式如下:h4a:D-β-Glc A-（1,3）-D-β-Gal NAc（6S）-（1,4）-D-β-Glc A-（1,3）-D-Gal NAc（6S）-（1,4）-D-α/β-Glc A;h4b:D-β-Glc A-（1,3）-D-β-Gal NAc6S-（1,4）-D-β-Glc A-（1,3）-D-Gal NAc6S-（1,4）-D-α/β-Glc A;h4c:D-β-Glc A-（1,3）-D-β-Gal NAc4S6S-（1,4）-D-β-Glc A-（1,3）-D-Gal NAc6S-（1,4）-D-α/β-Glc A;h4d:D-β-Glc A-（1,3）-D-β-Gal NAc6S-（1,4）-D-β-Glc A-（1,3）-D-Gal NAc4S6S-（1,4）-D-α/β-Glc A。寡糖分析结果表明,主链Gal NAc的4-O位和6-O位的硫酸酯基在稀酸中存在不同程度的水解,且4-O位比6-O位更易水解。5.FG部分酸水解主链的抗凝活性Sv FG及其酸水解主链产物的抗凝活性分析显示,原型FG具有强效的APTT延长活性,其活性随水解产物分子量和DF值减小而减弱。当DF值为13%时（Bb18）,APTT延长活性基本消失,与前期研究结论一致。因此,侧链岩藻糖残基是抗凝血活性的必要基团。综上所述,FG的部分酸水解反应中,除Fuc S侧链水解外,主链糖苷键,包括D-Glc A-β1,3-和D-Gal NAc-β1,4-糖苷键,也存在一定程度的水解;其水解过程基本符合一级动力学。此外,FG主侧链(Fuc S和Gal NAc4S6S)中的硫酸酯基也可发生一定程度的水解。FG部分酸水解所致侧链水解、主链聚合度降低以及硫酸酯基水解可降低其抗凝活性强度。因此,采用部分酸水解方法分析天然FG结构特征及其药理活性均应考虑该所述反应对化学结构的影响。
周斯仪[6]（2019）在《鱼鳔类肝素的提取分离、结构表征及活性评价》文中提出鱼鳔作为水产品加工副产物之一,富含胶原蛋白、多肽和黏多糖等活性物质,是药食两用的滋补珍品,中医认为其具有补肾益精、散瘀消肿等功效,但其作用效果和功效因子不明。本课题以鱼鳔为原料提取类肝素化合物,并对其进行分离纯化、结构鉴定以及体外抗凝血和抗炎活性评价,以期为进一步阐明鱼鳔糖胺聚糖的结构组成和构效关系提供参考,为鱼鳔功效因子的开发与利用奠定基础。主要研究内容及结果如下:（1）建立并优化鱼鳔类肝素的提取工艺:采用酶法提取类肝素,并在单因素试验基础上,以加酶量、酶解时间和温度为影响因子,以类肝素得率为响应值,采用响应曲面法进行优化。结果表明,最佳提取条件为:2709碱性蛋白酶添加量5.4 mg/mL,酶解温度50℃,时间20 h,在该条件下类肝素得率为（1.79±0.05）%,与预测值相差3.24%。（2）鱼鳔类肝素的分离纯化与理化性质分析:采用大孔阴离子交换树脂吸附、氯化钠溶液梯度洗脱和乙醇沉淀进行分离纯化,并以氯化钠浓度、pH、温度为影响因子,吸附率为响应值,采用响应曲面法优化静态吸附工艺。结果表明,最佳吸附条件为:氯化钠浓度6.0 mg/mL,pH 8.0,温度45℃;梯度洗脱分离出四个组分,F1、F2、F3和F4,其中F4的得率最高,为（2.22±0.02）%。理化性质分析结果显示从F1到F4,类肝素、糖醛酸、氨基己糖和硫酸基含量逐渐升高,蛋白质含量递减;醋酸纤维素薄膜电泳结果显示,F1为单一条带,迁移率最低;F2和F3有四个条带;F4为单一条带,迁移率最大。选取得率最高且理化性质与肝素最接近的组分F4进行结构鉴定。（3）鱼鳔类肝素的结构鉴定:通过紫外光谱、高效凝胶色谱、柱前衍生-高效液相色谱、傅里叶红外光谱、酶裂解-质谱/质谱和核磁共振鉴定F4一级结构。结果表明:F4类肝素含量为（85.79±0.63）%;重均分子质量约为115844±1401 u;单糖组成为葡萄糖醛酸、N-乙酰基半乳糖胺和少量的艾杜糖醛酸、半乳糖;且具有羧基、乙酰氨基、硫酸基轴向伸缩等特征吸收峰。最终确定鱼鳔类肝素主要组成是由重复的二糖单位[→4GlcUAβ1→3Gal NAc（4S）β1→]构成的硫酸软骨素A。（4）不同分子量鱼鳔类肝素抗凝血与抗炎活性评价:为探讨分子量对其抗凝血和抗炎活性的影响,首先采用透明质酸酶对F4进行降解得到两个低分子量类肝素组分:DP1和DP2,其重均分子量分别为6089±33 u和4963±37 u;再通过测定活化部分凝血活酶时间、凝血酶原时间和血浆凝血酶时间评价不同分子量的鱼鳔类肝素体外抗凝血活性;采用LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症模型评价其体外抗炎活性。结果表明,与肝素钠相比,鱼鳔类肝素的抗凝血作用较缓和,且分子量越低抗凝血活性越弱;各组分均能抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型中NO的过量分泌和ROS水平升高并存在剂量依赖性,且分子量越低效果越显着。进一步分析表明,低分子量的鱼鳔类肝素是通过抑制炎症细胞分泌NO、ROS、IL-6、IL-1β和IL-10等炎症介质来缓解LPS诱导RAW264.7细胞发生的炎症反应。
周德健[7]（2019）在《东海乌参（Acaudina leucoprocta）多糖的结构鉴定及活性研究》文中提出东海乌参（学名:白肛海地瓜Acaudina leucoprocta）,属于芋参目（Molpiadida）尻参科（Caudinidae）,盛产于我国浙江沿海海域。本文以东海乌参为研究对象,从其体壁中提取分离多糖成分,采用化学和波谱学的方法对其结构进行系统分析,并对其活性进行评价,研究结果如下:东海乌参经1%KOH 60℃提取3 h后,调节pH至6.7,使用4%木瓜蛋白酶56℃酶解2.5 h最终粗多糖得率为4%。经Q Sepharose Fast Flow（QFF）阴离子交换柱层析以及Sephacryl S-200凝胶渗透柱层析纯化后得到两个多糖组分:WS-1和WS-2。理化性质分析表明WS-1组分总糖含量为59%,蛋白含量为8%,硫酸基含量为15%;WS-2组分总糖含量为54%,蛋白含量为4%,硫酸基含量为30%。单糖组成分析表明WS-1岩藻糖的含量为98%;WS-2主要由岩藻糖、糖醛酸和氨基糖组成。结合理化性质与单糖组成分析,推测WS-1为硫酸化的岩藻聚糖,WS-2为硫酸化的糖胺聚糖。经凝胶排阻色谱测定,多糖组分WS-1和WS-2的分子量分别为593 kDa和359kDa。红外光谱、甲基化分析、二糖组成分析以及核磁共振分析结果表明多糖WS-1组分是由→3)-α-L-Fucp-（1→组成的线性结构,并且在岩藻糖的二位和四位存在硫酸基修饰,其中Fuc2S4S含量为24%,Fuc2S含量为24%,Fuc4S含量为12%,Fuc0S含量为40%,平均8个岩藻糖基存在7个硫酸基修饰;多糖WS-2组分的骨架结构由→3）-β-D-GlcpNAc6S-（1→4）-β-D-GlcpUA-（1→和→3）-β-D-GlcpNAc4S6S-（1→4）-β-D–GlcpUA-（1→组成,并且这两种结构的比例为1.5:1,在糖醛酸的3位可能连有聚合度为1-6并且带有1-3个硫酸基团的岩藻寡糖,岩藻寡糖的连接方式为→3）-α-L-Fucp-(1→,岩藻糖残基有Fuc2S4S、Fuc3S4S、Fuc0S以及Fuc4S四种类型,其中Fuc3S4S在岩藻糖侧链的末端。通过测定APTT、PT和TT评价WS-1和WS-2的体外抗凝血活性,结果表明WS-1组分只能经内源性途径发挥抗凝血作用,而WS-2组分能经内源性以及外源性途径发挥抗凝血作用,并且研究发现WS-2组分还能经抗凝血酶Ⅲ（ATⅢ）介导,抑制凝血因子Ⅱ（FⅡa）和凝血因子Ⅹ（FⅩa）的活性。以RAW264.7巨噬细胞为靶细胞,探究多糖组分WS-1对巨噬细胞的免疫调节作用,结果表明其可提高巨噬细胞的吞噬活性并且增加ROS的产生。通过ELISA试剂盒测定WS-1对巨噬细胞分泌细胞因子的影响,结果表明其可提高细胞分泌iNOS,TNF-α,IL-6,IL-12和IL-1β的水平。进一步通过细胞膜受体拮抗实验,推测WS-1能被TLR4受体识别,从而活化巨噬细胞,调节其免疫功能。抗病毒结果显示:多糖WS-2组分具有良好的抗HSV1病毒活性,其IC50为14.79±1.10μg/mL,并且其安全指数较大（SI指数为135.23）,有进一步研究的价值。本实验对东海乌参多糖进行系统的结构以及活性的研究,实验结果为东海乌参的高值化开发提供了重要参考。
凌小敏[8]（2018）在《多形拟杆菌硫酸软骨素酶的克隆表达及性质研究》文中进行了进一步梳理硫酸软骨素酶（简称ChSase）,可将硫酸软骨素等糖胺聚糖上的β-1,4糖苷键切断,生成的低分子量硫酸软骨素因具有粘度小、溶解性好、易吸收等特点而具有较高的生物学活性。本课题对各种含有ChSase基因的细菌进行筛选,以得到高表达量、有活力的ChSase。利用ChSase对硫酸软骨素进行酶法降解,通过紫外可见分光光度法对酶解产物含量进行测定,利用质谱方法对硫酸软骨素产物进行验证。本课题筛选出多形拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron CAG:40）菌株并克隆出3段编码ChSase的基因,并对其酶学性质进行研究。主要研究内容有:（1）实验选择的B.thetaiotaomicron CAG:40菌株中含有3种ChSase的基因,命名为ChSase-ABC I（Gene ID:524777996）、ChSase-ABC II（Gene ID:524777977）、ChSase-AC（Gene ID:524780449）,分别编码1025、892、719个氨基酸。（2）信号肽分析结果显示3种ChSase分别含有19、14、24个氨基酸为信号肽序列。以来源于B.thetaiotaomicron wal2926的硫酸软骨素裂解酶ABC（PDB ID:2Q1F）为模板,3种ChSase的序列一致性分别为30%,98%,34%,均可得到合理的目标模型。以B.thetaiotaomicron CAG:40基因组DNA为模板,成功克隆出3种ChSase并连接到表达载体pCzn1和pET-30a上,成功构建了3种重组原核表达载体。（3）对重组ChSase-ABC I进行表达及酶学性质表征。诱导ChSase-ABC I表达的最佳诱导剂浓度为0.75 mM,最适诱导温度是25 oC,最佳诱导时间为6 h。纯化后ChSase-ABC I纯度可达到95%以上且分子量约为108 kDa。ChSase-ABC I在70 mM pH8.0的磷酸盐缓冲溶液下具有较高的相对酶活。最适反应温度为37oC,且t1/2=120 min。Mg2+可以促进ChSase-ABC I的酶促反应速率。双倒数曲线图计算动力学参数,ChSase-ABC I的Km值和Vmax分别为0.54 mg/m L和541.3U/mg-protein。（4）当以硫酸软骨素A作为底物时,ChSase-ABC I催化反应生成的最终产物为质荷比为458.30的单硫酸化的不饱和二糖,表明ChSase-ABC I是一种通过降解硫酸软骨素的β-1,4糖苷键生成不饱和二糖的裂解酶。（5）对克隆到的ChSase-AC进行表达研究及酶学性质表征。该ChSase-AC的最佳诱导剂浓度为10μM、最佳诱导温度为15 oC、最佳诱导时间为20 h,且大部分以可溶性形式存在,经Ni-IDA纯化后在80 kDa出现明亮的单一条带。酶催化最佳pH为7.5,最适温度为35 oC。在37 oC中保温4 h仍有80%以上的相对活性。Ca2+可以促进ChSase-AC的酶促反应速率。
尹风新[9]（2016）在《一种新型硫酸软骨素AC外切酶的基因克隆及其催化特性研究》文中研究说明糖胺聚糖（glycosaminoglycans, GAGs）是一类在多种生物学过程中发挥重要作用的多糖,并且与多种疾病息息相关。硫酸软骨素AC外切酶（chondroitin sulfate AC lyase, ChnAC, EC 4.2.2.5）可以降解包括硫酸软骨素（chondroitin sulfate, CS）和透明质酸（hyaluronic acid, HA）在内的多种GAGs,生成非还原端包含4-不饱和葡糖醛酸的相应二糖。研究发现,多种野生微生物可以表达ChnAC,这些酶的编码基因大部分已经确定。天然或者重组表达的微生物来源的ChnAC作为降解工具酶被并广泛的应用于GAGs糖链结构研究和序列分析。本课题的主要内容包括：1.本课题组此前从土壤中筛选到一株高产硫酸软骨素降解酶（chondroitin sulfate lyase, ChSase）的节杆菌属（Arthrobacter sp.）菌株SSAs-1。通过分子生物学手段克隆该菌株表达ChSase的编码基因AsChnAC.首先设计简并引物,PCR扩增得到中间部分基因序列；然后通过inverse PCR方法得到下游基因序列；通过Genome Walking技术得到上游基因序列；最后序列分析确定该基因起始密码子（ATG）和终止密码子（TAG）,确定编码ChSase的基因序列的开放阅读框架。2.实现AsChnAC基因在大肠杆菌表达系统中高效重组表达,并优化了该基因编码的蛋白的诱导和纯化条件。3.通过氨基酸残基序列同源比对分析和纯化酶分子底物特异性分析,确定本课题自节杆菌SSAs-1克隆获得的ChSase为硫酸软骨素AC外切酶ChnAC,并命名为AsChnAC。4.系统分析了该新型AsChnAC的酶学参数,以化学酶法合成的结构确定的寡糖系列底物首次确定了ChSase对底物糖链的酶解方向。尽管微生物ChnAC的底物特异性和蛋白质晶体结构已有一定的研究基础,但由于结构均一确定模式底物的缺乏,使其降解糖链的催化方向性仍然未知。本课题首次利用化学酶法寡糖合成技术制备了四种肝素-软骨素嵌合寡糖底物,通过电喷雾质谱（ESI-MS）技术分析了AsChnAC处理四种寡糖的降解产物的结构。实验结果表明,AsChnAC可以降解位于底物寡糖糖链还原端的-GalNAc-β1,4-GlcA-单位；然而当-GlcNAc-α14-GlcA-单位位于寡糖糖链的还原端时,却阻碍了AsChnAC降解寡糖糖链中间和非还原端的-GalNAc-β1,4-GlcA-单位。上述实验结果直接证明了ChnAC对底物的催化方向为从还原端向非还原端降解。本课题的结论深化了我们对AsChnAC催化模式的认识,对了解微生物来源的糖胺聚糖分解酶的研究具有重要的科学理论意义,而且相关成果可以直接指导AsChnAC在GAG结构分析、低分子量GAG制备等领域的应用,也为未来对该酶分子的定向进化获得功能特定突变体提供了理论基础。
李国云[10]（2015）在《液相质谱新技术和新方法在糖胺聚糖分析中的应用研究》文中研究说明糖胺聚糖（GAGs）是一类由重复二糖结构单元组成的长链大分子,在一系列生理过程如抗凝血、生长发育、血管生成、癌症演变等中起着重要的作用。研究在生理病理变化过程中,细胞、组织和体液等生物样本中GAGs组成和结构的变化,有利于探明其发生发展或病变的机制。而天然的多糖是重要的生物活性物质和药物的来源,几种GAGs衍生物药物已经临床应用。近年来,海洋生物中GAGs类的硫酸多糖由于其特殊的生理功能和潜在的药用价值越来越被研究者所关注。但是这些天然多糖的分子量大且聚合度分散,完整的GAGs分子很难进行直接分析,需要特定的化学降解或酶解过程。因此,目前微量生物样品中GAGs的高通量痕量分析、开发和建立新的寡糖制备方法以及解码其复杂结构序列的新方法均是目前亟待解决的科学问题。本文依据先进的液相色谱质谱联用技术,建立适用于GAGs研究的方法和策略,主要包括亲水作用色谱（HILIC）与高分辨傅里叶变换质谱（FT-MS）联用,应用于GAGs的定性或定量分析；并建立基于质谱多反应监测技术（MRM）的LC-MSMS高通量痕量分析微量生物样本中GAGs方法,进而拓展这些方法在生物样品中的应用。首先,基于在线HILIC-FTMS分析结合糖生物信息化处理数据建立了快速、准确、全面鉴别抗凝血药物低分子量肝素（LMWHs）的Bottom-up方法。该方法度灵敏高,可检测低至0.01%的寡糖组分。色谱分析可在7 min内完成,而糖生物信息化数据处理简化了处理过程,极大的缩短了分析时间。基于本方法,对三种来自不同生产商的LMWHs中主要的不饱和寡糖、含有3-O-硫酸基的四糖、1,6-酐衍生物、非还原端的寡糖以及连接域寡糖等40多个组分的定量分析。该方法可以作为LMWHs的高通量分析方法,用于LMWHs生产过程中的质量控制。基于上述分析方法及建立的自由基降解GAGs的微反应体系,对肝素、硫酸软骨素A、N-硫酸化-heparosan、过硫酸化硫酸软骨素（OSCS）等四种不同类型的GAGs进行了轮廓分析,并研究了不同GAGs寡糖在HILIC色谱柱上的保留特性。将以上策略应用于研究不能被特异性酶解、结构特殊的GAGs海参岩藻糖基化的硫酸软骨素（SC-FCS）的轮廓分析。此外,还针对肝素中三种可能存在过硫酸化的GAGs污染物（OSCS、过硫酸化硫酸乙酰肝素（OSHS）和N-硫酸化OSCS （NSOSCS））因结构相似而难以鉴别的问题,通过自由基降解体系,以降解后产生的特异性二糖或三糖组分作为诊断离子,建立了HILIC-FTMS鉴别和定量分析肝素中复杂污染物的方法。通过本方法明确了2008年肝素污染事件中主要的污染物为OSCS,同时能够检测一种新型潜在的肝素污染物NSOSCS.内源性的糖胺聚糖与许多重大疾病的发病机制相关。本文采用LC-MS分析方法研究了不同致病机制的呼吸衰竭病人血浆中GAGs的变化。在意识不清、间接性肺损伤和直接性肺损伤病人的血浆中CS的浓度未表现出明显性变化,但是组成上,相对于健康对照组,CS-4S含量显着降低,而CS-OS含量显着增加。败血症、胰腺炎等间接性肺损伤病人血浆中HS-GAGs的浓度和硫酸化程度均显着性升高；并在败血症患者血浆中发现一个平均分子量为1.25KDa的特征性HS-GAGs寡糖组分；而胰腺炎病人病情变化过程中血浆HS-GAGs的浓度和硫酸化程度会随着病情的好转而降低,所以HS-GAGs可以作为败血症、胰腺炎等间接性肺损伤疾病的血液学标志物。直接性肺损伤的肺炎病人血浆中HA的浓度比健康对照组增加了31.53倍（p<0.05）,其可以作为肺炎诊断的标志物。呼吸衰竭病人的致病机制不同,血浆中GAGs变化也存在特异性,说明在发病过程中GAGs的作用有差异,为疾病的治疗提供指导和方向。在上述研究基础上,针对微量生物样本中GAGs分析繁琐、难以检测的问题,建立了一种快速灵敏的微量生物样品中GAGs的痕量分析方法。首先,提出了一种新的细胞中GAGs二糖富集的方法,与传统方法相比,其样品处理时间由原来的1-2周缩短为1-2天；其次,建立了以LC-MSMS-MRM技术同时分析17种GAGs二糖的方法,分析的LOD为0.16-1.3pg,较现有的分析方法灵敏度提高了500多倍。在此基础上,应用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞作为模型用于上述分析体系评价,结果显示只需5000～10000个细胞便可定量分析其中所有的二糖组分,而在500个细胞时便可检测到主要的二糖。并进一步利用该体系高通量测定了20株不同的人源细胞株中GAGs组学,丰富了这些细胞株的糖组学信息,并探讨了它们的生物学特性和GAGs组学间的关系。该方法为数目较少或者难以富集的生物样品中GAGs组学研究提供了有效的分析方法。
二、硫酸软骨素酶的分离纯化及部分性质（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、硫酸软骨素酶的分离纯化及部分性质（论文提纲范文）
（1）低分子量硫酸软骨素改善5XFAD小鼠认知功能与机制及其分子量与活性的关系研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写词汇对照表 |
| 第一章 前言 |
| 1 阿尔茨海默病研究现状 |
| 1.1 阿尔茨海默病的发病机制 |
| 1.1.1 淀粉样蛋白级联假说 |
| 1.1.2 tau蛋白病变假说 |
| 1.1.3 氧化应激和线粒体功能紊乱 |
| 1.1.4 神经炎症 |
| 1.2 阿尔茨海默病的治疗药物 |
| 1.2.1 对胆碱能神经递质的调控 |
| 1.2.2 抑制兴奋性谷氨酸毒性 |
| 1.2.3 淀粉样蛋白级联通路的调节 |
| 1.2.4 针对tau蛋白的治疗策略 |
| 1.2.5 神经保护剂 |
| 1.3 阿尔茨海默病研究与治疗中面临的问题 |
| 1.3.1 诊断标准 |
| 1.3.2 早期干预 |
| 1.3.3 药物研发与应用 |
| 1.3.4 研究模型 |
| 2 硫酸软骨素及其在疾病中的作用和药物应用 |
| 2.1 硫酸软骨素的结构 |
| 2.2 硫酸软骨素的生物合成 |
| 2.3 硫酸软骨素和LMWCS类药物的生产 |
| 2.4 硫酸软骨素在疾病中的作用和药物应用 |
| 2.4.1 细胞外基质(extracellular matrix,ECM) |
| 2.4.2 硫酸软骨素在关节炎中的作用及药物应用 |
| 2.4.3 硫酸软骨素在动脉粥样硬化中的作用及药物应用 |
| 2.4.4 硫酸软骨素在肿瘤中的作用及药物应用 |
| 2.4.5 硫酸软骨素在中枢神经系统疾病的作用及药物应用 |
| 2.4.5.1 硫酸软骨素与脑神经可塑性 |
| 2.4.5.2 硫酸软骨素与神经炎症 |
| 2.4.5.3 硫酸软骨素与脑损伤 |
| 2.4.5.4 硫酸软骨素与阿尔茨海默病 |
| 3 本课题研究的主要内容 |
| 第二章 低分子量硫酸软骨素对5XFAD转基因小鼠认知功能损伤的作用与机制研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 材料和试剂 |
| 1.3 实验仪器设备 |
| 1.4 实验所用溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物的饲喂和给药 |
| 2.1.1 动物的饲养和繁殖 |
| 2.1.2 小鼠基因组DNA的抽提 |
| 2.1.3 小鼠基因型检查 |
| 2.1.4 动物的分组和给药 |
| 2.2 行为学检测 |
| 2.2.1 Morris水迷宫（Morris water maze,MWM)实验 |
| 2.2.2 旷场实验（open field test,OFT) |
| 2.3 小鼠实验样本的收集 |
| 2.3.1 小鼠血清样本的收集 |
| 2.3.2 小鼠脑组织样本的收集 |
| 2.3.3 脑组织蛋白的提取 |
| 2.4 蛋白免疫印迹(Western blot) |
| 2.4.1 蛋白样品的准备 |
| 2.4.2 SDS-PAGE蛋白电泳 |
| 2.4.3 湿性膜转印 |
| 2.4.4 目的蛋白的标记 |
| 2.4.5 目的蛋白的检测和分析 |
| 2.5 活性氧相关指标的测定 |
| 2.5.1 GSH和GSSG |
| 2.5.2 MDA的测定 |
| 2.5.3 总SOD活性 |
| 2.5.4 GSH-Px活性 |
| 2.6 蛋白因子水平的测定 |
| 2.7 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 5XFAD小鼠的基因型鉴定 |
| 3.2 LMWCS对5XFAD小鼠行为学变化的影响 |
| 3.2.1 Morris水迷宫 |
| 3.2.2 旷场实验 |
| 3.3 LMWCS对APP及其代谢的影响 |
| 3.4 LMWCS对神经炎症的影响 |
| 3.5 LMWCS对氧化应激的影响 |
| 3.6 LMWCS对tau蛋白磷酸化的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三章 硫酸软骨素寡糖的制备与表征 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 试剂和耗材 |
| 1.3 实验仪器及设备 |
| 1.4 工作溶液的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 硫酸软骨素酶(CHSase) ABC Ⅰ的制备 |
| 2.1.1 重组质粒pET-28a(+)-CHSase ABCⅠ的构建 |
| 2.1.1.1 全基因组的提取 |
| 2.1.1.2 引物的设计 |
| 2.1.1.3 目的基因的扩增 |
| 2.1.1.4 质粒的双酶切 |
| 2.1.1.5 目的基因与质粒的连接 |
| 2.1.1.6 重组质粒转入E.coli DH-5α |
| 2.1.1.7 重组质粒的鉴定 |
| 2.1.2 工程菌株的构建和重组CHSase ABCⅠ的表达与纯化 |
| 2.1.2.1 将重组质粒转化入E.coli BL21 |
| 2.1.2.2 His-CHSase ABCⅠ的诱导表达 |
| 2.1.2.3 菌体的回收和处理 |
| 2.1.2.4 重组CHSase ABCⅠ的纯化 |
| 2.2 重组CHSase ABCⅠ酶学性质的初步研究 |
| 2.2.1 His-CHSaseABCⅠ酶活力的测定 |
| 2.2.2 重组CHSase ABCⅠ的反应条件研究 |
| 2.3 CS寡糖的制备 |
| 2.4 CS寡糖的纯化及结构表征 |
| 3 结果 |
| 3.1 目的基因PCR退火温度的选择 |
| 3.2 菌液PCR鉴定转化子 |
| 3.3 His-CHSase ABCⅠ的重组表达和纯化 |
| 3.4 His-CHSase ABCⅠ的酶学性质研究 |
| 3.5 CS寡糖的初步分离 |
| 3.6 CS寡糖的进一步纯化 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第四章 硫酸软骨素寡糖的分子量与抗Aβ诱导的氧化应激和线粒体功能紊乱活性关系的研究 |
| 1 实验材料和仪器 |
| 1.1 实验所用细胞株 |
| 1.2 试剂和耗材 |
| 1.3 本实验用到的仪器设备 |
| 1.4 溶液的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养及冻存 |
| 2.1.1 细胞的复苏 |
| 2.1.2 细胞的传代 |
| 2.1.3 细胞的冻存 |
| 2.2 细胞的处理 |
| 2.3 细胞活力测定 |
| 2.3.1 不同浓度CS对Aβ损伤的SH-SY5Y细胞活力的影响 |
| 2.3.2 不同CS寡糖对Aβ损伤的SH-SY5Y细胞活力的影响 |
| 2.4 细胞凋亡测定 |
| 2.5 细胞氧化应激水平的测定 |
| 2.5.1 NO的测定 |
| 2.5.2 ROS的测定 |
| 2.5.3 MDA的测定 |
| 2.5.4 总SOD活性的测定 |
| 2.5.5 GSH-Px活性测定 |
| 2.6 CS寡糖对线粒体功能的影响 |
| 2.6.1 MMP的测定 |
| 2.6.2 Na~+/K~+-ATP酶活性测定 |
| 2.7 免疫印迹(western blot)测定蛋白表达 |
| 2.7.1 细胞的处理 |
| 2.7.2 细胞总蛋白的提取 |
| 2.7.3 SDS-PAGE蛋白电泳 |
| 2.7.4 湿性膜转印 |
| 2.7.5 目的蛋白的标记 |
| 2.7.6 目的蛋白的检测和分析 |
| 2.8 细胞对Aβ的摄取 |
| 2.9 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 细胞活力 |
| 3.1.1 不同浓度LMWCS对SH-SY5Y细胞活力的影响 |
| 3.1.2 不同CS寡糖对SH-SY5Y细胞活力的影响 |
| 3.2 不同CS寡糖对SH-SY5Y细胞凋亡的影响 |
| 3.3 不同CS寡糖对SH-SY5Y细胞氧化应激的影响 |
| 3.4 不同CS寡糖对SH-SY5Y细胞线粒体膜电位的影响 |
| 3.5 不同CS寡糖对SH-SY5Y细胞的Na~+/K~+-ATP酶活性的影响 |
| 3.6 不同CS寡糖对SH-SY5Y细胞的细胞凋亡途径的影响 |
| 3.7 不同CS寡糖对SH-SY5Y细胞摄取Aβ的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第五章 硫酸软骨素寡糖的分子量与抗Aβ诱导的神经炎症活性的关系的研究 |
| 1 实验材料和仪器 |
| 1.1 实验所用细胞株 |
| 1.2 试剂和耗材 |
| 1.3 本实验用到的仪器设备 |
| 1.4 溶液的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养及冻存 |
| 2.1.1 细胞的复苏 |
| 2.1.2 细胞的传代 |
| 2.1.3 细胞的冻存 |
| 2.2 细胞的处理 |
| 2.3 细胞活力测定 |
| 2.3.1 不同浓度CS对Aβ孵育的BV2细胞活力的影响 |
| 2.3.2 不同CS寡糖对Aβ孵育的BV2细胞活力的影响 |
| 2.4 细胞促炎症因子分泌水平的测定 |
| 2.5 细胞氧化应激水平的测定 |
| 2.5.1 NO的测定 |
| 2.5.2 ROS的测定 |
| 2.5.3 总SOD活性的测定 |
| 2.5.4 GSH-Px活性测定 |
| 2.6 免疫印迹(western blot)测定蛋白表达 |
| 2.7 细胞对Aβ的摄取 |
| 2.8 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 细胞活力 |
| 3.1.1 不同浓度LMWCS对BV2细胞活力的影响 |
| 3.1.2 不同CS寡糖对BV2细胞活力的影响 |
| 3.2 不同CS寡糖对BV2细胞的炎症因子的影响 |
| 3.3 不同CS寡糖对Aβ引起的BV2细胞氧化应激的影响 |
| 3.4 不同CS寡糖对Aβ激活的信号通路的影响 |
| 3.5 不同CS寡糖对BV2细胞摄取Aβ聚集物的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 论文总结与展望 |
| 1 全文总结 |
| 2 创新点 |
| 3 论文的不足之处 |
| 4 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 附录 |
| 附录1 目的基因CHSase ABC Ⅰ基因序列 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（2）基于质谱的糖胺聚糖结构表征及其与蛋白互作分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 糖胺聚糖概述 |
| 1.1.1 糖胺聚糖的结构与功能 |
| 1.1.1.1 肝素及硫酸乙酰肝素 |
| 1.1.1.2 硫酸软骨素及硫酸皮肤素 |
| 1.1.1.3 透明质酸 |
| 1.1.1.4 硫酸角质素 |
| 1.1.2 糖胺聚糖类药物及应用 |
| 1.1.2.1 肝素 |
| 1.1.2.2 低分子量肝素 |
| 1.1.2.3 超低分子量肝素 |
| 1.1.2.4 多组分糖胺聚糖药物 |
| 1.2 糖胺聚糖的分析方法 |
| 1.2.1 电泳 |
| 1.2.2 高效液相色谱法 |
| 1.2.3 质谱法 |
| 1.2.4 核磁共振波谱法 |
| 1.3 糖胺聚糖与蛋白相互作用 |
| 1.3.1 糖胺聚糖与蛋白相互作用中蛋白的结构特点 |
| 1.3.2 糖胺聚糖与蛋白相互作用中糖链的结构特点 |
| 1.4 糖胺聚糖与蛋白相互作用分析方法 |
| 1.4.1 基于亲和力的方法 |
| 1.4.2 核磁法、X-射线晶体衍射和分子对接 |
| 1.4.3 质谱法 |
| 1.5 论文大纲 |
| 第二章 糖胺聚糖的聚丙烯酰胺凝胶电泳-质谱联用方法研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 试剂与耗材 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 色谱柱 |
| 2.2.4 缓冲液及流动相的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 肝素寡糖制备 |
| 2.3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染 |
| 2.3.3 胶内酶解 |
| 2.3.4 AMAC标记 |
| 2.3.5 肝素寡糖LC-MS分析 |
| 2.3.6 C18-MS/MS MRM分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析GAGs |
| 2.4.2 通过胶内酶解将PAGE与LC-MS/MS结合 |
| 2.4.3 LC-MS/MS-MRM方法建立 |
| 2.4.4 LC-MS/MS MRM分析PAGE分离的肝素 |
| 2.4.5 方法验证 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 糖胺聚糖的琼脂糖凝胶电泳-质谱联用方法研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 药品与试剂 |
| 3.2.1 试剂与耗材 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 色谱柱 |
| 3.2.4 缓冲液及流动相的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 DS寡糖制备及质谱鉴定 |
| 3.3.2 琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.3.3 糖链的提取及酶解 |
| 3.3.4 HILIC-MS/MS MRM分析 |
| 3.3.5 2D NMR分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 琼脂糖凝胶电泳分析多组分GAGs |
| 3.4.2 SAX离心提取及LC-MS/MS方法建立 |
| 3.4.3 LC-MS/MS MRM分析AGE分离的舒洛地特 |
| 3.4.4 方法验证 |
| 3.4.5 舒洛地特的核磁分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 不同聚合度肝素糖链与IFN-γ的氢氘交换质谱研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 试剂与耗材 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 色谱柱 |
| 4.2.4 缓冲液的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 肝素寡糖制备 |
| 4.3.2 IFN-γ覆盖度考察 |
| 4.3.3 氘代时间 |
| 4.3.4 IFN-γ与肝素糖链互作比 |
| 4.3.5 不同聚合度糖链与IFN-γ的氢氘交换实验 |
| 4.3.6 数据处理 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 IFN-γ覆盖度考察 |
| 4.4.2 HDX实验条件优化 |
| 4.4.3 不同聚合度糖链与IFN-γ的HDX研究 |
| 4.4.4 糖链聚合度与IFN-γ相互作用的关系 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 肝素与IFN-γ相互作用的糖链序列结构表征 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 试剂与耗材 |
| 5.2.2 主要仪器 |
| 5.2.3 色谱柱 |
| 5.2.4 缓冲液及流动相的配制 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 肝素寡糖制备 |
| 5.3.2 装填IFN-γ亲和柱 |
| 5.3.3 IFN-γ亲和柱纯化肝素寡糖 |
| 5.3.4 完整糖链LC-MS分析 |
| 5.3.5 酶解基本组成单元及LC-MS分析 |
| 5.3.6 亚硝酸降解及LC-MS分析 |
| 5.3.7 SAX分离IFN-γ亲和dp8 |
| 5.3.8 IFN-γ亲和dp8 LC-MS/MS测序 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 IFN-γ亲和糖链分析 |
| 5.4.2 计算机辅助亲和dp8糖链测序 |
| 5.4.3 LC-MS/MS亲和dp8糖链序列鉴定 |
| 5.4.4 肝素与IFN-γ特异性结合的糖链序列 |
| 5.4.5 亲和dp24糖链序列验证 |
| 5.4.6 分子对接 |
| 5.5 本章小结 |
| 全文总结 |
| 回顾本论文的内容 |
| 本文取得的创新成果 |
| 展望 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文及申请的专利 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（3）外切型肝素酶的发现、催化机制研究以及应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 本章引论 |
| 1.2 肝素/硫酸乙酰肝素 |
| 1.2.1 肝素/硫酸乙酰肝素的发现及结构研究 |
| 1.2.2 肝素/硫酸乙酰肝素的生物学功能 |
| 1.2.3 肝素/硫酸乙酰肝素的应用 |
| 1.3 肝素/硫酸乙酰肝素降解酶 |
| 1.3.1 肝素酶Ⅰ(Hepase Ⅰ) |
| 1.3.2 肝素酶Ⅱ(Hepase Ⅱ) |
| 1.3.3 肝素酶Ⅲ(Hepase Ⅲ) |
| 1.3.4 其它Hepases |
| 1.3.5 HP/HS降解酶的应用 |
| 1.4 选题意义 |
| 第二章 PL15_2家族肝素酶的序列分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 PL15_2亚家族肝素酶异源表达及纯化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与试剂 |
| 3.2.1 菌株与质粒 |
| 3.2.2 试剂 |
| 3.2.3 仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 培养基及试剂配置 |
| 3.3.2 基因组提取 |
| 3.3.3 BIexoHep表达载体的构建 |
| 3.3.4 PL15_2亚家族肝素酶异源表达及纯化 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 PL15_2亚家族肝素酶的活性鉴定 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与试剂 |
| 4.2.1 试剂 |
| 4.2.2 仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 底物HP-F_(αⅢ)制备 |
| 4.3.2 PL15_2亚家族肝素酶底物专一性分析 |
| 4.3.3 PL15_2亚家族肝素酶最适反应条件分析 |
| 4.3.4 PL15_2亚家族肝素酶的酶活测定 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 PL15_2亚家族肝素酶的底物专一性分析 |
| 4.4.2 PL15_2亚家族肝素酶的最适反应条件分析 |
| 4.4.3 PL15_2亚家族肝素酶的酶活测定 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 PL15_2亚家族肝素酶的降解模式 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与试剂 |
| 5.2.1 试剂 |
| 5.2.2 仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 饱和HP13糖DP13制备 |
| 5.3.2 PL15_2亚家族肝素酶时间梯度降解HP |
| 5.3.3 PL15_2亚家族肝素酶时间梯度降解HP DP13 |
| 5.3.4 PL15_2亚家族肝素酶降解2-AB标记的HP DP13 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 PL15_2亚家族肝素酶的降解模式分析 |
| 5.4.2 PL15_2亚家族肝素酶的降解方向分析 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 外切型肝素酶的底物结构选择性研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与试剂 |
| 6.2.1 试剂 |
| 6.2.2 仪器 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 HP UDP4制备 |
| 6.3.2 HP UDP4分离纯化 |
| 6.3.3 HP UDP4各组分序列测定 |
| 6.3.4 BIexoHep降解HP UDP4各组分 |
| 6.3.5 BIexoHep时间梯度降解HP UDP4 |
| 6.3.6 exoHepase降解磺达肝癸钠 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 HP UDP4制备及分离纯化 |
| 6.4.2 HP UDP4各组分序列鉴定 |
| 6.4.3 BIexoHep底物结构选择性分析 |
| 6.4.4 exoHepase降解磺达肝癸钠分析 |
| 6.5 本章小结 |
| 第七章 BIexoHep的三维结构研究 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 材料与试剂 |
| 7.2.1 菌株及质粒 |
| 7.2.2 试剂 |
| 7.2.3 仪器 |
| 7.2.4 缓冲液及培养基配置 |
| 7.3 实验方法 |
| 7.3.1 BIexoHep蛋白表达纯化 |
| 7.3.2 SeMet-BIexoHep蛋白表达纯化 |
| 7.3.3 蛋白结晶及条件优化 |
| 7.3.4 晶体数据采集及结构解析 |
| 7.3.5 BIexoHep分子中金属离子的检测 |
| 7.4 结果与分析 |
| 7.4.1 BIexoHep晶体与结构解析 |
| 7.4.2 BIexoHep蛋白结构整体分析 |
| 7.4.3 BIexoHep结构与已知结构的比较 |
| 7.4.4 BIexoHep蛋白结构中金属离子的确定 |
| 7.4.5 BIexoHep的“L”型反应通道 |
| 7.4.6 底物结合位点 |
| 7.5 本章小结 |
| 第八章 BIexoHep的催化机制研究 |
| 8.1 引言 |
| 8.2 材料与试剂 |
| 8.3 实验方法 |
| 8.3.1 BIexoHep突变体与HP寡糖的共结晶与数据采集 |
| 8.3.2 BIexoHep突变体与HP寡糖的共结晶结构解析 |
| 8.3.3 突变体的构建 |
| 8.3.4 突变体活性检测 |
| 8.4 结果与分析 |
| 8.4.1 BIexoHep突变体与HP UDP4底物的复合结构 |
| 8.4.2 底物结合位点 |
| 8.4.3 BIexoHep分子改造 |
| 8.4.4 BIexoHep中Ca~(2+)作用 |
| 8.4.5 BIexoHep的外切机制 |
| 8.4.6 BIexoHep的催化机制 |
| 8.5 本章小结 |
| 第九章 BIexoHep的初步应用 |
| 9.1 引言 |
| 9.2 材料与试剂 |
| 9.2.1 试剂 |
| 9.2.2 仪器 |
| 9.3 实验方法 |
| 9.3.1 HP UDP8分离纯化 |
| 9.3.2 HP UDP8各组分不完全降解制备非还原端UDP6和UDP4 |
| 9.3.3 HP UDP8各组分及非还原端UDP6和UDP4二糖组成 |
| 9.3.4 HP UDP8各组分非还原端UDP4的还原端二糖组成 |
| 9.3.5 HP UDP8各组分MS及MS/MS鉴定 |
| 9.4 结果与分析 |
| 9.4.1 HP UDP8分离纯化 |
| 9.4.2 HP UDP8各组分序列鉴定 |
| 9.4.3 HP UDP8各组分的MS及MS/MS验证 |
| 9.5 本章小结 |
| 第十章 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 参与项目 |
| 发表论文及发明专利 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（4）不同连接肽在硫酸软骨素酶ABC I重组表达中的应用研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 重组质粒p MAL-c2x-FFFFF-Ch Sase ABC I和p MAL-c2x-RRRRR-Ch Sase ABC I的构建 |
| 1.3.2 重组酶MBP-FFFFF-Ch Sase ABC I和MBP-RRRRR-Ch Sase ABC I的表达 |
| 1.3.3 重组酶MBP-FFFFF-Ch Sase ABC I和MBP-RRRRR-Ch Sase ABC I的纯化 |
| 1.3.4 酶活及酶比活测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 PCR结果验证 |
| 2.2 重组质粒p MAL-c2x-FFFFF-Ch Sase ABC I和p MAL-c2x-RRRRR-Ch Sase ABC I的构建 |
| 2.3 重组酶MBP-FFFFF-Ch Sase ABC I和MBP-RRRRR-Ch Sase ABC I的表达 |
| 2.4 SDS-PAGE验证重组酶MBP-FFFFF-Ch Sase ABC I和MBP-RRRRR-Ch Sase ABC I的分子质量 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（5）岩藻糖化糖胺聚糖部分酸水解的动力学及其产物的结构研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 岩藻糖化糖胺聚糖 |
| 1.1.1 FG结构研究历程及常用的解聚方法 |
| 1.1.2 部分酸水解在FG结构解析中的应用 |
| 1.1.3 部分酸水解反应机理 |
| 1.2 FG及其衍生物的抗凝血活性研究 |
| 1.3 花刺参和象牙参FG的结构 |
| 1.4 课题研究目的及意义 |
| 1.5 主要研究内容 |
| 第二章 FG部分酸水解动力学研究 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 样品与标准品 |
| 2.1.2 试剂与材料 |
| 2.1.3 仪器 |
| 2.2 实验内容与方法 |
| 2.2.1 溶液配制 |
| 2.2.2 反应时间对部分酸水解反应的影响 |
| 2.2.3 反应温度对部分酸水解反应的影响 |
| 2.2.4 HfFG部分酸水解 |
| 2.2.5 SvFG和Bb1~Bb12的IR光谱分析 |
| 2.2.6 SvFG和Bb1~Bb12的比旋光度分析 |
| 2.2.7 反应产物的~1HNMR分析以及主链部分DF值计算 |
| 2.2.8 主链分子量分析 |
| 2.2.9 主链-OSO_3-/-COO-测定 |
| 2.2.10 侧链(Sc1~Sc18,HfSc1&HfSc2)的~1HNMR分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 SvFG部分酸水解主链分析 |
| 2.3.2 SvFG主链的理化性质 |
| 2.3.3 HfFG部分酸水解主链分析 |
| 2.3.4 主链产物的分子量测定 |
| 2.3.5 FG的酸水解动力学 |
| 2.3.6 温度对速率常数的影响 |
| 2.3.7 侧链Sc3~Sc18和HfSc1~2 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 部分酸水解侧链部分所含FucS的结构研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 样品 |
| 3.1.2 试剂和材料 |
| 3.1.3 仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 Sc8和Sc9分离纯化 |
| 3.2.2 Sc9还原 |
| 3.2.3 HfSc1-2的分离纯化 |
| 3.2.4 苯酚半胱氨酸-硫酸法及HPGPC分析 |
| 3.2.5 1D/2DNMR分析 |
| 3.2.6 ESI-MS分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 Sc8和Sc9分离纯化 |
| 3.3.2 Sc8-1的化学结构 |
| 3.3.3 Sc9-1的化学结构 |
| 3.3.4 Sc9还原后(HSc9)的化学结构 |
| 3.3.5 HfSc1-2的化学结构 |
| 3.3.6 Sc9和Sc18质谱分析 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 部分酸水解主链部分所含寡糖的化学结构研究 |
| 4.1 材料与仪器 |
| 4.1.1 样品 |
| 4.1.2 试剂与材料 |
| 4.1.3 仪器 |
| 4.2 实验内容与方法 |
| 4.2.1 Bb18的HPGPC分析和NMR测定 |
| 4.2.2 Bb18的凝胶过滤柱层析法寡糖分离 |
| 4.2.3 h4和h5纯化 |
| 4.2.4 h6的还原与纯化 |
| 4.2.5 纯化寡糖的HPGPC分析和NMR测定 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 Bb18的HPGPC分析结果及其结构解析 |
| 4.3.2 Bb18中寡糖组分的纯化 |
| 4.3.3 h6寡糖纯化及结构解析 |
| 4.3.4 h5寡糖纯化及结构解析 |
| 4.3.5 h4寡糖纯化及结构解析 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 FG及其水解产物抗凝血活性研究 |
| 5.1 材料与仪器 |
| 5.1.1 样品 |
| 5.1.2 试剂 |
| 5.1.3 仪器 |
| 5.2 实验内容与方法 |
| 5.2.1 APTT活性检测 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 缩略语表 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间主要研究成果 |
| 致谢 |
（6）鱼鳔类肝素的提取分离、结构表征及活性评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 鱼鳔功效因子研究与开发利用进展 |
| 1.1.1 鱼鳔化学成分 |
| 1.1.2 鱼鳔功效因子 |
| 1.1.3 鱼鳔开发利用现状 |
| 1.2 类肝素概况 |
| 1.2.1 类肝素结构与功能 |
| 1.2.2 类肝素提取 |
| 1.2.3 类肝素分离纯化 |
| 1.2.4 类肝素一级结构鉴定方法 |
| 1.3 研究目的和意义 |
| 1.4 主要研究内容 |
| 2 鱼鳔类肝素的提取及工艺优化 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 实验材料与试剂 |
| 2.1.2 实验仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 鱼鳔类肝素提取 |
| 2.2.2 蛋白酶的选择 |
| 2.2.3 基本成分测定 |
| 2.2.4 单因素试验设计 |
| 2.2.5 响应曲面设计 |
| 2.2.6 数据处理 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 鱼鳔种类的筛选 |
| 2.3.2 蛋白酶的选择 |
| 2.3.3 单因素试验结果 |
| 2.3.4 响应曲面试验结果 |
| 2.4 小结 |
| 3 鱼鳔类肝素的分离纯化 |
| 3.1 材料与仪器 |
| 3.1.1 实验材料与试剂 |
| 3.1.2 实验仪器与设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.0 树脂预处理 |
| 3.2.1 树脂的筛选 |
| 3.2.2 树脂静态吸附鱼鳔类肝素的单因素试验 |
| 3.2.3 树脂静态吸附工艺优化 |
| 3.2.4 树脂动态吸附与洗脱 |
| 3.2.5 理化性质分析 |
| 3.2.6 醋酸纤维薄膜电泳 |
| 3.2.7 数据处理 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 树脂筛选结果 |
| 3.3.2 树脂静态吸附单因素试验结果 |
| 3.3.3 树脂静态吸附工艺优化 |
| 3.3.4 鱼鳔类肝素分离结果 |
| 3.3.5 理化性质分析 |
| 3.3.6 醋酸纤维素薄膜电泳结果 |
| 3.4 小结 |
| 4 鱼鳔类肝素一级结构鉴定 |
| 4.1 材料与仪器 |
| 4.1.1 实验材料与试剂 |
| 4.1.2 实验仪器与设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 紫外光谱分析 |
| 4.2.2 高效凝胶色谱分析 |
| 4.2.3 单糖组成分析 |
| 4.2.4 傅里叶红外光谱分析 |
| 4.2.5 二糖组成分析 |
| 4.2.6 核磁共振分析 |
| 4.2.7 数据处理 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 F4 纯度及分子量 |
| 4.3.2 单糖组成 |
| 4.3.3 红外光谱扫描结果 |
| 4.3.4 二糖组成 |
| 4.3.5 核磁共振鉴定结果 |
| 4.4 小结 |
| 5 鱼鳔类肝素的降解及体外抗凝血和抗炎活性评价 |
| 5.1 材料与仪器 |
| 5.1.1 实验材料与试剂 |
| 5.1.2 实验仪器与设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 酶法降解鱼鳔类肝素单因素试验 |
| 5.2.2 低分子量鱼鳔类肝素的制备 |
| 5.2.3 分子量测定 |
| 5.2.4 硫酸基含量测定 |
| 5.2.5 红外光谱分析 |
| 5.2.6 体外抗凝血活性测定 |
| 5.2.7 鱼鳔类肝素的体外抗炎活性测定 |
| 5.2.8 数据处理 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 酶法降解鱼鳔类肝素单因素试验结果 |
| 5.3.2 红外光谱分析结果 |
| 5.3.3 鱼鳔类肝素的体外抗凝血活性 |
| 5.3.4 鱼鳔类肝素的体外抗炎活性 |
| 5.4 小结 |
| 6 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
（7）东海乌参（Acaudina leucoprocta）多糖的结构鉴定及活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 海参的研究概况 |
| 1.2 海参多糖的结构研究 |
| 1.2.1 海参岩藻聚糖的结构研究 |
| 1.2.2 海参硫酸软骨素的结构 |
| 1.3 海参多糖的生物活性 |
| 1.3.1 抗凝血活性 |
| 1.3.2 免疫调节活性 |
| 1.3.3 降血脂活性 |
| 1.3.4 抗病毒活性 |
| 1.4 立项背景及研究意义 |
| 第二章 东海乌参多糖分离纯化以及理化性质 |
| 2.1 材料和仪器 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 东海乌参多糖的提取 |
| 2.2.2 东海乌参多糖的脱蛋白 |
| 2.2.3 东海乌参多糖的分离纯化 |
| 2.2.4 东海乌参多糖纯度分析以及分子量测定 |
| 2.2.5 东海乌参理化性质分析 |
| 2.2.6 单糖组成分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 东海乌参多糖的提取 |
| 2.3.2 东海乌参多糖的分离纯化 |
| 2.3.3 纯度及分子量分析 |
| 2.3.4 理化性质测定 |
| 2.3.5 单糖组成分析 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 东海乌参多糖的结构鉴定 |
| 3.1 实验试剂及仪器 |
| 3.1.1 实验试剂 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 红外光谱分析 |
| 3.2.2 乌参岩藻聚糖脱硫酸基 |
| 3.2.3 乌参岩藻聚糖的甲基化分析 |
| 3.2.4 乌参糖胺聚糖的二糖组成及侧链分析 |
| 3.2.5 乌参多糖核磁共振(NMR)分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 红外光谱分析 |
| 3.3.2 WS-1 甲基化分析 |
| 3.3.3 东海乌参糖胺聚糖二糖组成和侧链结构分析 |
| 3.3.4 核磁共振分析 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 东海乌参多糖的活性评价 |
| 4.1 实验试剂及仪器 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 体外抗凝血活性研究 |
| 4.2.2 巨噬细胞RAW264.7 免疫调节实验 |
| 4.2.3 抗病毒活性 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 抗凝血活性分析 |
| 4.3.2 WS-1 对巨噬细胞RAW264.7 免疫调节作用分析 |
| 4.3.3 WS-1和WS-2 抗病毒活性 |
| 4.4 小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文及研究成果 |
（8）多形拟杆菌硫酸软骨素酶的克隆表达及性质研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 硫酸软骨素 |
| 1.1.1 硫酸软骨素的结构 |
| 1.1.2 硫酸软骨素的性质 |
| 1.1.3 硫酸软骨素的现状研究 |
| 1.1.4 硫酸软骨素的应用 |
| 1.1.5 低分子量硫酸软骨素 |
| 1.1.6 低分子量硫酸软骨素的制备方法 |
| 1.2 硫酸软骨素酶 |
| 1.2.2 ChSase的种类 |
| 1.2.3 ChSase的药理作用 |
| 1.2.4 ChSase的应用 |
| 1.2.5 ChSase的克隆表达研究 |
| 1.3 本课题研究的目的及意义 |
| 1.4 本课题研究的主要内容 |
| 第二章 多形拟杆菌中ChSase克隆与表达载体构建 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验试剂 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 菌种的活化与培养 |
| 2.2.2 基因组DNA的获取 |
| 2.2.3 ChSase信号肽分析 |
| 2.2.4 ChSase同源建模及分子对接 |
| 2.2.5 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.6 引物设计与合成 |
| 2.2.7 重组克隆载体的构建 |
| 2.2.8 重组表达载体的构建 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 多形拟杆菌菌种活化及基因组DNA抽提 |
| 2.3.2 ChSase同源建模及分子对接 |
| 2.3.3 ChSase信号肽分析 |
| 2.3.4 ChSase引物设计及PCR结果 |
| 2.3.5 重组质粒构建 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 重组ChSase-ABCI的表达及性质表征 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验试剂 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 ChSase-ABCI酶活力测定方法 |
| 3.2.2 蛋白含量测定方法 |
| 3.2.3 变性聚丙烯凝胶电泳 |
| 3.2.4 重组ChSase-ABCI表达 |
| 3.2.5 重组ChSase-ABCI的纯化 |
| 3.2.6 ChSase-ABCI的性质表征 |
| 3.2.7 LC-MS分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 重组ChSase-ABCI的表达 |
| 3.3.2 重组ChSase-ABCI的纯化 |
| 3.3.3 ChSase-ABCI的性质表征 |
| 3.3.4 LC-MS分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 重组ChSase-AC的表达及性质表征 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验试剂 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 ChSase-AC酶活力测定方法 |
| 4.2.2 蛋白含量测定方法 |
| 4.2.3 重组ChSase-AC表达条件优化 |
| 4.2.4 重组ChSase-AC的纯化 |
| 4.2.5 ChSase-AC的性质表征 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 重组ChSase-AC的表达 |
| 4.3.2 重组ChSase-AC的纯化 |
| 4.3.3 ChSase-AC的性质表征 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文 |
（9）一种新型硫酸软骨素AC外切酶的基因克隆及其催化特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACTS |
| 符号说明 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 硫酸软骨素 |
| 1.1.1 糖胺聚糖 |
| 1.1.2 硫酸软骨素的结构 |
| 1.1.3 硫酸软骨素的应用 |
| 1.2 硫酸软骨素降解酶 |
| 1.2.1 糖胺聚糖降解酶 |
| 1.2.2 硫酸软骨素降解酶的分类 |
| 1.2.3 硫酸软骨素AC降解酶 |
| 1.2.4 硫酸软骨素降解酶的应用 |
| 1.2.5 硫酸软骨素降解酶的基因克隆和重组表达 |
| 1.3 本实验的研究内容与意义 |
| 1.3.1 编码硫酸软骨素降解酶未知基因序列的扩增 |
| 1.3.2 新型硫酸软骨素降解酶的异源表达与纯化 |
| 1.3.3 硫酸软骨素AC降解酶催化方向研究 |
| 1.3.4 研究意义 |
| 第二章 新型硫酸软骨素降解酶编码基因的扩增 |
| 2.1 实验仪器、材料与试剂 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 材料与试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 菌株全基因组提取 |
| 2.2.2 设计简并引物扩增部分目的基因 |
| 2.2.3 利用反向PCR扩增下游基因序列 |
| 2.2.4 应用Genome walking技术克隆剩余基因序列 |
| 2.2.5 扩增全部目的基因 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 中间部分目的基因的扩增 |
| 2.3.2 下游目的基因的扩增 |
| 2.3.3 上游目的基因的扩增 |
| 2.3.4 克隆全部目的基因 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 新型硫酸软骨素降解酶的异源表达及性质研究 |
| 3.1 实验仪器、材料与试剂 |
| 3.1.1 仪器 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 目的基因的制备 |
| 3.2.2 重组表达载体的构建 |
| 3.2.3 重组蛋白的表达 |
| 3.2.4 重组蛋白的纯化 |
| 3.2.5 重组蛋白的活性验证 |
| 3.2.6 重组蛋白的性质研究 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 重组表达载体的构建 |
| 3.3.2 重组蛋白的表达与纯化 |
| 3.3.3 重组蛋白的活性验证 |
| 3.3.4 重组蛋白的性质研究 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 基因工程菌的构建与筛选 |
| 3.4.2 重组蛋白的表达与纯化 |
| 3.4.3 AsChnAC底物适应性的分析及酶学性质研究 |
| 第四章 催化方向的研究 |
| 4.1 实验仪器、材料与试剂 |
| 4.1.1 仪器 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 模式底物合成 |
| 4.2.2 模式寡糖底物的降解 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 三糖底物合成 |
| 4.3.2 AsChnAC降解三糖产物分析 |
| 4.3.3 HP-CS-六糖合成及AsChnAC降解六糖底物分析 |
| 4.3.4 CS-HP-六糖合成及AsChnAC降解六糖底物分析 |
| 4.3.5 总结 |
| 4.4 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
| 附录 |
| 附录1 目的基因AsChnAC序列 |
| 附录2 AsChnAC氨基酸残基序列 |
| 附件 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（10）液相质谱新技术和新方法在糖胺聚糖分析中的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 糖胺聚糖的种类、合成及其生物学功能 |
| 1.1 肝素和硫酸乙酰肝素 |
| 1.2 硫酸软骨素和硫酸皮肤素 |
| 1.3 透明质酸 |
| 1.4 硫酸角质素 |
| 2 糖胺聚糖的提取及分离纯化 |
| 3 糖胺聚糖的解聚 |
| 4 糖胺聚糖的分析技术 |
| 4.1 液相色谱技术 |
| 4.2 电泳技术 |
| 4.3 核磁共振波谱技术 |
| 4.4 质谱技术 |
| 4.5 液相色谱-质谱联用技术在GAGs研究中的应用进展 |
| 4.6 糖生物质谱的信息化分析 |
| 5 海洋源GAGs及其结构类似物研究进展 |
| 6 本文的立体依据、内容及意义 |
| 参考文献 |
| 第1部分 亲水作用色谱和傅里叶变换质谱联用技术在糖胺聚糖研究中的应用 |
| 第一章 基于Bottom up方法HILIC-FTMS高通量分析低分子量肝素精细结构 |
| 1 材料和仪器 |
| 1.1 材料和试剂 |
| 1.2 仪器和设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 LMWHs快速酶解 |
| 2.2 亲水作用色谱与傅里叶变换质谱联用(HILIC-FTMS)分析 |
| 2.3 糖信息化数据处理 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 LMWHs酶解 |
| 3.2 HILIC-FTMS分析LMWHs酶解产物 |
| 3.3 质谱数据的生物信息化处理 |
| 3.4 LMWHs酶解产生连接域寡糖的序列分析 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 自由基降解结合HILIC-FTMS在糖胺聚糖研究中的应用 |
| 第一节 不同类型糖胺聚糖自由基降解产物HILIC-FTMS分析 |
| 1 材料和仪器 |
| 1.1 材料和试剂 |
| 1.2 仪器和设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 自由基降解 |
| 2.2 HILIC-FTMS分析 |
| 2.3 糖信息化数据处理 |
| 3 结果和讨论 |
| 3.1 四种糖胺聚糖的自由基降解 |
| 3.2 GAGs降解产物的HILIC-FTMS分析 |
| 3.3 GAGs寡糖的定量分析 |
| 3.4 海参岩藻糖基化硫酸软骨素寡糖的HILIC-FTMS分析 |
| 4 小结 |
| 第二节 自由基降解结合HILIC-FTMS鉴别和测定肝素中过硫酸化糖胺聚糖污染物 |
| 1 材料和仪器 |
| 1.1 材料和试剂 |
| 1.2 仪器和设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 化学法合成过硫酸化糖胺聚糖 |
| 2.2 肝素及其过硫酸化污染物的自由基降解 |
| 2.3 HILIC-FTMS分析 |
| 2.4 污染肝素样品中OSCS的定量分析 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 过硫酸化的糖胺聚糖标准品的合成及鉴别 |
| 3.2 糖胺聚糖的自由基降解 |
| 3.3 肝素及其过硫酸化的污染物的鉴别 |
| 3.4 污染肝素样品中OSCS的定量分析 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第2部分 基于液质联用技术的微量生物样品中糖胺聚糖组学研究 |
| 第三章 血浆糖胺聚糖作为疾病生物标记物的应用研究 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 材料和试剂 |
| 1.2 仪器和设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 血浆中GAGs的分离纯化 |
| 2.2 GAGs的酶解 |
| 2.3 GAGs二糖荧光标记 |
| 2.4 LC-MS分析 |
| 2.5 血浆中HS-GAGs的分离纯化 |
| 2.6 血浆HS-GAGs聚丙烯酰氨凝胶电泳分析 |
| 2.7 数据处理 |
| 3 结果和讨论 |
| 3.1 血浆中GAGs的分离纯化及LC-MS分析 |
| 3.2 血浆中HS-GAGs二糖组成和定量分析 |
| 3.3 血浆中CS-GAGs二糖组成和定量分析 |
| 3.4 血浆中HA-GAGs定量分析 |
| 3.5 疾病发展过程中血浆GAGs组学的变化 |
| 3.6 血浆中HS-GAGs的分子量分布 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 微量生物样品中糖胺聚糖高通量痕量分析方法的建立及其应用 |
| 1 试剂与仪器 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 仪器和设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 二糖标准品荧光标记 |
| 2.2 LC-MSMS分析条件 |
| 2.3 样品前处理和GAGs二糖的富集 |
| 2.4 分析方法确证 |
| 2.5 LC-MSMS高通量分析人类细胞株中的GAGs |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 MRM分析条件优化 |
| 3.2 色谱条件优化 |
| 3.3 LC-MSMS分析方法评价 |
| 3.4 样品前处理优化和方法评价 |
| 3.5 20株人源细胞株中的GAGs分析 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 总结与展望 |
| 创新点 |
| 附录 |
| 个人简历 |
| 发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
四、硫酸软骨素酶的分离纯化及部分性质（论文参考文献）
- [1]低分子量硫酸软骨素改善5XFAD小鼠认知功能与机制及其分子量与活性的关系研究[D]. 赵娜. 山东大学, 2021(11)
- [2]基于质谱的糖胺聚糖结构表征及其与蛋白互作分子机制研究[D]. 盛安然. 山东大学, 2021(11)
- [3]外切型肝素酶的发现、催化机制研究以及应用[D]. 张庆冬. 山东大学, 2021(11)
- [4]不同连接肽在硫酸软骨素酶ABC I重组表达中的应用研究[J]. 李晔,陈振娅,王瑞丽,沈荣,危晴,陈亮. 中国酿造, 2020(09)
- [5]岩藻糖化糖胺聚糖部分酸水解的动力学及其产物的结构研究[D]. 刘茜茜. 中南民族大学, 2020(07)
- [6]鱼鳔类肝素的提取分离、结构表征及活性评价[D]. 周斯仪. 广东海洋大学, 2019(01)
- [7]东海乌参（Acaudina leucoprocta）多糖的结构鉴定及活性研究[D]. 周德健. 浙江海洋大学, 2019
- [8]多形拟杆菌硫酸软骨素酶的克隆表达及性质研究[D]. 凌小敏. 江苏大学, 2018(02)
- [9]一种新型硫酸软骨素AC外切酶的基因克隆及其催化特性研究[D]. 尹风新. 山东大学, 2016(02)
- [10]液相质谱新技术和新方法在糖胺聚糖分析中的应用研究[D]. 李国云. 中国海洋大学, 2015(07)