一、核基质MINT N端片段(365～1084aa)相互作用蛋白的筛选及鉴定（论文文献综述）
龚文孝[1]（2021）在《G蛋白通路抑制因子2（GPS2）抑制A型流感病毒复制的分子机制研究》文中认为A型流感病毒（Influenza A virus,IAV）是造成人和动物感冒的重要病原,一直是兽医学、病毒学和预防医学等关注的焦点。IAV核输出蛋白（Nuclear Export Protein,NEP）也叫NS2,是由IAV的第8片段通过mRNA可变性剪接后编码。NEP在所有亚型的IAV毒株中高度保守,其主要功能是在病毒复制后期作为接头分子介导v RNPs的出核转运。也有文章报道,NEP能调控聚合酶活力和病毒RNA的复制,然而却没有更多的研究来解释NEP调控聚合酶活力的具体机制。筛选与NEP相互作用的宿主蛋白,一方面可以更多的揭示NEP在病毒复制过程中的生物学功能;另一方面,鉴于NEP氨基酸序列的保守性,挖掘新的生物学功能并阐述分子细节可为抗流感病毒药物的研发提供理论基础。研究表明G蛋白通路抑制因子2（G protein Pathway Suppressor 2,GPS2）通过与病毒蛋白互作,参与并调控乳头瘤病毒和丙肝病毒等基因组的复制。本研究表明GPS2是IAV增殖的抑制因子,它通过抑制PB1和PB2之间的相互作用干扰成熟v RNP的装配,进而抑制病毒基因组RNA的复制过程。此外,IAV NEP与GPS2作用并介导GPS2的核输出,从而激活GPS2蛋白的降解。因此,NEP-GPS2相互作用致弱了GPS2对病毒聚合酶活性的抑制,有利于病毒复制。本论文主要研究内容如下:1.NEP与GPS2互作免疫共沉淀实验结果表明,在瞬时转染过表达条件下IAV NEP蛋白与人源GPS2蛋白发生相互作用,且这种相互作用通过GST-Pull down实验得到证实。在病毒感染A549细胞中,Co-IP实验证实NEP与GPS2之间的相互作用是真实存在的。综合以上实验结果表明,IAV NEP与宿主蛋白GPS2之间存在生物学的相互作用,且这种相互作用是直接的,在流感病毒感染细胞内是真实存在的。2.GPS2抑制IAV的复制在本研究中,siRNA沉默宿主基因GPS2能显着提高细胞培养上清中A型流感病毒WSN/H1N1和DW/H5N1病毒增殖滴度,病毒蛋白NP的合成显着提高;而过表达GPS2的细胞中病毒增殖滴度显着降低,表明GPS2是IAV在细胞上增殖的负调控因子。在进一步的研究中,构建了GPS2敲除的A549细胞系,证实GPS2敲除显着提高病毒增殖滴度。综合以上实验结果表明,GPS2是IAV复制增殖的负调控因子。3.IAV感染促进GPS2蛋白降解在IAV感染细胞中,随着WSN/H1N1或者DW/H5N1感染剂量的增加,细胞中GPS2蛋白水平逐渐降低,而mRNA水平变化不显着,提示病毒感染可能会影响蛋白稳定性。蛋白质半衰期测定实验结果表明病毒感染显着缩短了GPS2蛋白在细胞内的半衰期,且MG132能抑制IAV感染引起的蛋白水平降低。而另一方面,NEP的过表达或者病毒感染均能引起核内GPS2蛋白的出核。进一步的研究表明,病毒感染或者过表达NEP引起的GPS2蛋白的降解与其出核转运相关,LMB处理细胞后能起阻断作用。综合以上实验结果表明,IAV感染促进GPS2蛋白的降解,且这种降解与NEP介导的出核转运相关。4.GPS2抑制IAV聚合酶活性在本实验室建立的WSN/H1N1病毒的聚合酶活性检测系统中考察了GPS2蛋白对聚合酶活力的影响,结果表明在不影响聚合酶亚基蛋白表达的前提下,GPS2的过表达能显着抑制IAV聚合酶活性,且呈剂量依赖性。进一步的研究结果表明,在病毒感染细胞中GPS2能与vRNP组份（PB1、PB2和NP）结合,且能抑制病毒RNA聚合酶Rd Rp组装过程中PB1与PB2间的相互作用,进而影响v RNPs的正常装配。综合以上实验结果表明,GPS2干扰IAV聚合酶的组装,进而抑制聚合酶活性。5.GPS2抑制IAV基因组RNA的合成为了进一步探究GPS2抑制病毒增殖的机制,考察了GPS2对病毒RNA合成的影响。与转染对照siRNA组相比,在A549细胞中沉默GPS2基因能显着增加流感病毒vRNA、cRNA和mRNA的水平;为了排除因复制差异带来的影响,我们考察了IAV感染后一个复制周期内3种病毒RNA水平,进一步证实GPS2抑制流感病毒RNA的合成。为了明确GPS2对流感病毒基因组复制的影响,细胞使用放线菌酮（Cycloheximide,CHX）处理后再测定其对3种RNA合成的影响,表明GPS2并不参与流感病毒基因组RNA的初始转录,即mRNA的合成,但沉默GPS2基因能显着抑制基因组的复制,即vRNA和cRNA的合成。综合以上实验结果表明,GPS2抑制IAV基因组RNA复制过程中的RNA合成,而不影响初始转录。6.NEP致弱了GPS2对IAV聚合酶活性的抑制在本研究中,考察了NEP对GPS2介导的流感病毒聚合酶活性抑制作用的影响。在HEK293T细胞中,转染HA-GPS2（100ng）前提下,NEP的过表达会显着影响双荧光素酶的活性,这就表明NEP 100ng的转染剂量能缓解GPS2对聚合酶活性的抑制,当培养基中加入11nM的LMB处理细胞时,聚合酶活力受到显着影响。而使用MG132处理细胞时聚合酶活力改变不显着。综合以上实验结果表明,NEP通过与GPS2相互作用介导GPS2的核输出来致弱GPS2对病毒聚合酶活性的抑制。
张超[2]（2016）在《青岛和广州鼻咽癌组织中EBV核抗原2基因多态性的比较和分析》文中进行了进一步梳理目的:EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）属疱疹病毒科γ亚科成员,与多种人类肿瘤的发生密切相关,如Burkit’s淋巴瘤（Burkitt’s lymphoma,BL）、何杰金病（Hodgkin’s disease,HD）、鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）、乳腺癌以及胃癌（gastric carcinoma,GC）等。有研究表明有超过90%成人感染过EBV,但EBV相关肿瘤的分布则具有明显的地域性和人群倾向性,除环境因素和遗传因素外,是否存在与EBV相关肿瘤有关的EBV基因变异一直是倍受关注的热点问题。本研究选择青岛和广州地区EBV阳性鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）组织作为研究对象,对EBV核抗原（EBV nuclear antigen,EBNA）2编码基因的多态性进行检测和分析,旨在探讨EBV基因多态性及其在EBV阳性NPC发生中的意义。方法:（1）聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）结合DNA测序检测EBV阳性NPC标本中EBNA2基因的多态性,应用DNAStar 5.0软件中Meg Align对序列进行对比分析,并与EBV标准株B95-8序列进行比较。（2）根据测序结果,将其序列标准化处理后,应用DNAStar 5.0软件生成系统树。（3）根据各基因出现的共有突变结合系统发生树对各基因变异进行分类,初步分析基因变异对相关基因功能的影响。（4）测序结果与我们前期对青岛地区EBV阳性鼻咽癌的检测结果进行比较。结果:本研究广州地区32例EBV阳性NPC及39例TW标本EBNA2基因扩增及测序成功,根据系统发生树中EBNA2的变异模式以及以往EBNA2基因多态性的研究结果,鉴定归纳出E2-A,E2-C和B95-8样3种亚型。（1）E2-A为最常见的亚型（38/71,52.1%）,NPC1为其代表株,该亚型有5个共有突变,包括2个错义突变aa476（Glu→Gly/Trp）和aa486（Ile→Thr）,3个同义突变aa370（cct→cca）,aa417（acg→aca）和aa470（tca→tct）。有6个其它散在的突变,分别为aa331（Pro→Leu）,aa383（cct→cca）,aa390（ggt→gga）,aa411（Val→Ile）,aa438（Ile→Leu）和aa484（Pro→His）。（2）E2-C为次要亚型（NPC3为代表株）,该亚型存在1处共有突变（aa370,cct→cca）和2个aa缺失（aa357和358）,有3处散在的突变分别为aa378（Ger→Tyr）,aa411（Val→Ile）和aa451（Pro→His）。值得注意的是,我们发现E2-C亚型与GD1株序列高度一致,而GD1一直作为我国南方地区NPC的代表毒株。（3）B95-8样亚型为最少见一类亚型（代表株为TA56）,仅有aa370一个位点的变异（cct→cca）。（4）统计学分析结果显示,NPC和健康人群TWs中3种EBNA2亚型的分布有明显差异（P<0.01）,NPC中E2-A亚型所占比例（71.9%,22/32）明显高于TW（38.5%,15/39）,TW中B95-8样亚型所占比例（25.6%,10/39）明显高于NPC（0%,0/32）。结论:（1）E2-A亚型是中国南北方地区的优势流行株。（2）EBNA2各亚型在NPC和TW中分布差异明显,提示E2-A亚型与NPC的发生密切相关,而B95-8样亚型在健康人群中更为常见。（3）E2-A亚型在广州和青岛地区NPC组织中均高频出现,但广州地区NPC组织中E2-A亚型的出现频率远高于青岛地区,提示EBNA2基因变异具有肿瘤特异性而非仅仅地域性变异。
褚小刚[3]（2013）在《NuMA与Astrin在细胞有丝分裂期相互作用的研究》文中指出在真核细胞中,遗传物质的准确分离由双极化的纺锤体结构完成。纺锤体由反相平行的微管结构组成,负端集中在纺锤体两极（Spindle pole）,正端与动粒（Kinetochore）相连接排列在纺锤体赤道面。整个细胞分裂过程是通过纺锤体丝与染色体着丝点的协同作用来完成。正确的微管组织、纺锤体的组装和染色排列是细胞健康的保证,纺锤体组装和染色体排列的异常导致的细胞生长失控是癌症发生的重要分子机制。微管的组织、纺锤体的组装及染色体的分离需要大量的蛋白质的参与,其中包括马达蛋白和非马达蛋白。参与有丝分裂的马达蛋白可通过ATP酶的作用,将能量转化为动力,在微管上运动产生力或者控制微管的动态性来参与纺锤体的组装。非马达蛋白则可通过稳定和组织微管、协助微管成核、调节马达蛋白活性以及微管的动态性、调节纺锤体的形状和大小等机制来调控染色体分离和细胞周期的进程。核有丝分裂器蛋白NuMA是一种大分子的非马达蛋白,在细胞分裂间期,NuMA位于细胞核内,细胞分裂开始后,NuMA与马达蛋白Dynein及其配体Dynactin组成复合物,在Dynein/Dynactin的协同作用下,NuMA逐渐向纺锤体两极移动,在细胞分裂中期（Metaphase）, NuMA集中于纺锤体两极,通过组织和稳定微管、维持纺锤体微管在纺锤体极的集束在细胞分裂过程中发挥重要的作用。大量研究显示在细胞周期进程中,NuMA可与很多马达蛋白、非马达蛋白、结构蛋白、蛋白激酶等相互作用,等形成一个复杂的蛋白质调控网络,在细胞周期、细胞有丝分裂过程中通过参与微管组织、纺锤体组装、染色体排列和细胞周期调控等过程发挥重要作用,但其详细的分子机制尚不清楚。目前NuMA的研究仍然是细胞生物学、分子生物学、发育生物学、肿瘤生物学特别是细胞周期、细胞分裂等领域的热点研究对象。为了深入研究核有丝分裂器蛋白NuMA在哺乳动物细胞有丝分裂过程中的功能及分子机制,我们运用酵母双杂交系统筛选到了一个新的可能与NuMA相互作用的纺锤体相关蛋白:Astrin（Aster-associated protein）。为了验证酵母双杂交的结果,我们运用免疫共沉淀（Co-IP）、GST-Pulldown生物化学实验方法分别从体内水平（in vivo）和体外水平（in vitro）证实NuMA和Astrin能够相互作用,而且NuMA和Astrin的相互作用是通过直接结合而非其他媒介间接完成的。我们进一步利用酵母双杂交系统及Co-IP生化实验方法详细分析了NuMA和Astrin蛋白相互作用的分子位点,确认NuMA和Astrin相互作用位点都位于C端。为了了解NuMA和Astrin两种蛋白在哺乳动物细胞生长周期是否存在相互作用的条件,我们运用免疫荧光的方法,分别观察了NuMA和Astrin在HeLa细胞中的亚细胞定位和共定位情况,结果显示在细胞分裂间期,NuMA位于细胞核内而Astrin位于细胞浆内,二者无共定位。从细胞有丝分裂期开始,核膜破裂后,Astrin和NuMA共定位于纺锤体。在细胞分裂中期,Astrin和NuMA共定同集中于纺锤体两极,Astrin和NuMA的共定位一直持续到细胞分裂后期,直至细胞分裂结束。作为一个非微管结合蛋白,Astrin在细胞有丝分裂中的纺锤体微管定位机制尚不清楚。我们利用荧光免疫影像技术外源性过量表达NuMA和Astrin,观察NuMA和Astrin在细胞中的相互作用情况。我们的研究证实NuMA可以辅助Astrin定位于微管,结果说明Astrin在细胞有丝分裂期的纺锤体定位可能与NuMA相关。为了了解NuMA和Astrin在哺乳动物细胞内相互作用的功能和分子机制,我们利用RNA-基因沉默技术（（?）Knock-down）和外源性基因过量表达（over-expression）技术干扰内源性NuMA的正常功能,观察NuMA的功能缺失（loss of function）对Astrin的细胞定位及对细胞周期进程及纺锤体活动的影响。结果显示内源性NuMA的降低可导致Astrin在有丝分裂纺锤体、纺锤体极和动粒的降低。我们还运用外源性过量表达LGN抑制NuMA和Astrin的相互作用,结果与内源性NuMA的敲除相似,外源性过表达的LGN的细胞,包括纺锤体极、纺锤体极动粒上的Astrin均大幅降低。少数LGN高表达的细胞,Astrin抑制明显,纺锤体上的Astrin几乎无法检测。NuMA Knock-down和过量表达LGN的结果共同说明,细胞有丝分裂期,Astrin的纺锤体和纺锤体极的定位是通过NuMA的辅助完成的。为了研究NuMA的分布是否依赖于Astrin,我们利用RNA-i基因沉默技术和外源性基因过量表达技术分别干扰内源性Astrin表达和功能,结果显示NuMA在纺锤体上的分布不直接依赖于Astrin,但Astrin的敲除可通过影响微管-动粒的连接稳定间接影响NuMA在纺锤体极的聚集。Astrin的一个独特之处在于它在细胞分裂期具有两个分布池：纺锤体极和动粒,在细胞分裂的不同时期, Astrin在两个分布池呈动态分布。为了深入研究NuMA对Astrin在细胞有丝分裂期动态分布的影响,我们运用shRNA敲除动力蛋白Dynein,以此抑制NuMA在纺锤体极的聚集,结果显示Dynein的敲除导致纺锤体极的Astrin显着下降,而Astrin在动粒的分布则有所增强。而过量表达NuMA片段则能够降低Astrin在动粒的分布。以上实验证实Astrin在纺锤体极的聚集是通过动力蛋白Dynein的运输完成的,同时NuMA可平衡Astrin在纺锤体极和动粒两个分布池之间的动态分布。作为两种重要的非马达蛋白,NuMA和Astrin在细胞有丝分裂期相互作用,并与其他马达蛋白、非马达蛋白一起组成一个相互影响、相互依赖、相互配合的分子调控网络。在细胞周期的不同阶段,在纺锤体的不同部位动态分布,在细胞有丝分裂、纺锤体的组装、微管的组织、微管和动粒的稳定、染色体的排列、细胞周期的调控等过程中发挥了重要作用。
伍慧玲[4]（2009）在《E3连接酶SIAH及其与PHC2和EEF1D蛋白的相互作用研究》文中提出本论文的工作是关于人E3泛素连接酶SIAH-1b（下简称SI AH）及其相互作用蛋白的研究。我们通过酵母双杂交技术以SIAH作为诱饵蛋白,在人胎肝文库中筛选到两个新的相互作用的蛋白：PHC2和EEF1D.围绕这两个蛋白质与SIAH的关系,我们开展了两部分工作：第一部分是关于SIAH降解PHC2的研究；第二部分是关于EEF1D调控SIAH的E3连接酶活性的研究。E3连接酶SIAH与果蝇SIAN（seven-in-absentia）同源,可识别底物蛋白并使其经泛素-蛋白酶系统降解。SIAH在细胞周期调控、肿瘤发生和神经退行性病变等生理学过程都发挥了作用。在第一部分中,我们发现SIAH可结合PHC2并通过泛素化—蛋白酶体途径将其降解。PHC2 （polyhomeotic homolog 2）是PcG基因群中的一员。PcG基因群编码一类蛋白,形成多聚复合物结合到染色质上,稳定地抑制一些发育必须基因（如Hox基因簇）的转录表达。我们的实验结果表明：SIAH能够与PHC2在体内外发生相互作用,并可共定位于HeLa细胞的细胞核中；SIAH的Cys-rich domain、PHC2的PxVxAxP基序在两者结合中起到重要作用；在哺乳动物细胞293T中,SIAH可促进PHC2的泛素化,并使之由泛素-蛋白酶体途径降解。为了验证两者的E3酶—底物关系,我们构建了两个突变体SiahR及Siahm,前者可与PHC2结合但失去E3连接酶活性,后者保有E3转接酶活性但与PHC2结合能力大大下降。结果表明这两个突变体泛素化降解PHC2的能力远逊于野生型,证实了PHC2是SIAH的泛素化降解底物。PcG基因的突变会导致动物体发育缺陷、肿瘤形成,PHC2作为classⅡPcG复合物中的重要一员,在胚胎形成、脑的早期发育中也都有重要作用,因此研究SIAH对PHC2的降解调控对探索PHC2在发育早期的调控机制有重要意义。在第二部分中,我们发现EEF1D能与SIAH相互作用并抑制其E3连接酶活性。EEF1D （eukaryotic translation elongation factor 1 delta,也称为eEF1Bδ或eEF1δ）是真核生物翻译延伸因子eEFIB复合物中的一个亚基。eEFIB复合物是的eEFIA的转换因子（exchange factor, GEF）,可激活eEF1A上的核苷转换,使脱离核糖体的非活性eEF1A-GDP转变为可再度结合核糖体的活性eEF1A-GTP,从而完成eEFIA的活力循环。前人的研究表明EEF1D在病毒感染、细胞周期、肿瘤发生中都发挥了作用。我们发现SIAH能够与EEF1D在体内外发生相互作用；共定位实验结果显示两者能够共定位于HeLa细胞细胞质中；系列缺失实验发现SIAH的Cys-rich domain在两者结合中起到重要作用。在293T细胞中,EEF1D蛋白质水平不随SIAH的增加而变化,该结果提示其不是SIAH的底物。但是,SIAH蛋白质水平却会随EEF1D表达量增加而增加,蛋白稳定性测试的实验结果表明这种增加缘于EEF1D会抑制SIAH的降解,从而导致SIAH蛋白水平的增加。此外,EEF1D能抑制SIAH的自泛素化,也能抑制SIAH对PHC2的降解。根据以上结果,我们发现EEF1D可抑制SIAH的E3连接酶活性,从而导致其自身降解水平及降解某些底物能力的下降,这为研究SIAH的调控机制提供了新线索。
刘昌财[5]（2008）在《西伯利亚蓼抗病基因克隆、双价载体构建及遗传转化》文中指出根据西伯利亚蓼抑制消减文库（SSH）中获得的硫堇基因（THI）、几丁质酶基因（CHI）和葡聚糖酶基因（GLUC）的部分序列,应用RACE技术同时克隆了THI、CHI和GLUC基因全长的cDNA序列,生物信息学分析表明,西伯利亚蓼THI（PsTHI1）与鼠尾草（Salvia miltiorrhiza）等植物THI有较高的同源性,具保守的植物THI标签,此成熟THI带正电荷,偏碱性,推定可能具有抗病原微生物活性,为一种新的植物THI;西伯利亚蓼CHI（PsCHI1）具保守的植物几丁质酶（CHI）家族19标签1序列特征,与植物classⅣCHI前体序列具有高度的同源性,推测为植物classⅣCHI,分泌到细胞外,无跨膜区,根据其它植物CHI的结构域,确定PsCHI1具有能够水解真菌细胞壁的结构,推测其可能有抗真菌病的功能;西伯利亚蓼GLUC（PsGLUC1）所编码的蛋白（PsGLUC1）呈酸性,带负电荷,该编码蛋白与水稻（Oryza sativa L.japonica）内切型1,3;1,4-β-D-葡聚糖酶（endo-1,3;1,4-beta-D-glucanase）有较高的同源性,故初步推断PsGLUC1属于葡聚糖酶家族。采用实时荧光定量PCR技术,研究了PsGLUC1和PsCHI1基因在西伯利亚蓼不同组织、不同时间的盐碱胁迫及去胁迫过程中表达特性。结果表明,PsCHI1基因表达具明显的组织特异性,无论在非胁迫、NaHCO3胁迫还是去胁迫过程叶部的表达量明显高于茎部的表达量。PsGLUC1基因表达不具明显的组织特异性,在茎和叶中均有表达。在盐碱胁迫条件下,两个基因在茎和叶中均具有不同的表达模式。另外,无论在茎还是叶部,PsCHI1基因与PsGLUC1基因均受盐碱胁迫的影响。以已构建的PsCHI1/pROKⅡ和PsGLUC1/pROKⅡ两个单价载体为基础,采用“中间载体pGEM-T easy更换酶切位点法”和“35S和Tnos引物PCR方法”,均成功构建35S-PsGLUC1-Tnos-35S-PsCHI1-Tnos/pROKⅡ植物双价表达载体。通过对两种方法的分析比较,结果表明“35S和Tnos引物PCR方法”能够快速高效构建具完整表达框的pROKⅡ植物双价表达载体。应用此法去除了中间载体更换酶切位点的繁琐过程,减少了连接、转化的次数,明显地提高了工作效率。构建了EHA105（PsCHI1/pROKⅡ）、EHA105（PsGLUC1/pROKⅡ）两个单价农杆菌工程菌株和EHA105（PsCHI1-PsGLUC1/pROKⅡ）一个植物双价农杆菌工程菌株。并应用此双价农杆菌工程菌株成功将均具完整表达框的35S-PsGLUC1-Tnos-35S-PsCHI1-Tnos双价基因同时导入烟草基因组中,获得卡那抗性植株17株,对6个转化株系进行PCR检测,结果全部为阳性。RT-PCR分析表明,转入的外源PsGLUC1基因和PsCHI1基因能够在转录水平上表达。
冯珊珊[6]（2007）在《RIP3诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制研究》文中指出细胞凋亡是一种由基因控制的主动性的细胞死亡过程，它对于维持机体内环境的稳定是至关重要的。RIP3（receptor—interacting protein 3）是RIP丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶家族成员之一，它具有自磷酸化、诱导细胞凋亡和激活NF-κB的作用。此外，RIP3还能通过其C端独特的结构域与RIP结合并募集到TNFR1信号转导复合物中。但到目前为止，关于RIP3的细胞定位以及促凋亡的分子机制仍不清楚。前人的研究已经表明：RIP3的N端的激酶结构域对于其激酶活性和自磷酸化是必需的，而C端的独特结构域对于其促凋亡活性和激活NF-κB的功能是非常关键的。为了研究其促凋亡的具体机制，我们将RIP3的C端作为研究的重点。我们发现过量表达一个仅包含RIP3的C端从224位到518位氨基酸的缺失突变体，RIP3△N223（tRIP3），就可以在人肝癌细胞系QGY-7703中诱导显着的细胞凋亡。FADD是死亡受体介导的细胞凋亡通路中的关键成员，FADD的显性负性突变体（FADD-dominant negative，FADD-DN）可以在多种细胞系中阻断TNF-α，Fash，或TRAIL激活的死亡受体通路。为了探讨FADD与RIP3在TNFR1信号通路中的相互关系，我们研究发现FADD-DN能明显阻止tRIP3诱导的凋亡；然而RIP3的显性负性突变体（RIP3-dominant negative，RIP3-DN）却不能阻止FADD诱导的凋亡。因此我们推断在TNFR1介导的凋亡信号通路中，tRIP3可能在FADD的上游发挥作用。意外的是：FADD-DN不能阻止RIP3诱导的凋亡。这种差别暗示全长的RIP3与tRIP3可能通过不同的通路诱导凋亡。考虑到已经有文献报道RIP家族的RIP和RIP4会在死亡受体诱导的凋亡途径中被半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶caspase剪切，我们设想RIP3也会有类似的情况。与预期一致，我们发现在人宫颈癌细胞系HeLa中，RIP3分子会在凋亡刺激下被Caspase-8于天冬氨酸D328位后剪切，这个剪切过程可以被广谱的caspase抑制剂Z-VAD-FMK完全抑制，而不能被Caspase-8特异性的抑制剂Z-IETD-FMK所抑制，提示RIP3还可能被其它的分子剪切。全长的RIP3可以同时诱导caspase依赖和非依赖的细胞凋亡，同时还可以激活NF-κB。剪切后产生的两个片段分别包含完整的激酶结构域（N端片断，RIP3-N，aa 1-328）和主要的独特结构域（C端片断，RIP3-C，aa 329-518）。全长RIP3主要在胞质中弥散分布；RIP3-N在整个细胞中都均匀分布；RIP3-C在低表达的情况下保留了RIP3的定位方式，但高表达时可在细胞质中形成点状或丝状的结构。RIP3-N丧失了全长RIP3的一些生理活性，如促凋亡和激活NF-κB；RIP3-C保留了这两种功能但有所改变。RIP3-C只能诱导caspase依赖的细胞凋亡，而且RIP3-C比RIP3诱导NF-κB激活的能力强得多。值得注意的是，外源的RIP3是一个不稳定的蛋白，它的两个剪切片断比全长RIP3的稳定性强，暗示了RIP3的两个结构域对于其不稳定性都有贡献。我们还观察了RIP3的点突变对其功能的影响。RIP3不被剪切的突变体，RIP3（D328A），表现出与野生型RIP3相似的细胞定位和促凋亡能力。RIP3的赖氨酸K50位对于它的激酶活性和ATP结合都很关键，在RIP家族中十分保守。RIP3（K50A），一个失去激酶活性的点突变体，与去掉激酶结构域的RIP3-C一样，只能诱导caspase依赖的细胞凋亡，这暗示了RIP3的激酶活性对于其诱导的caspase非依赖的凋亡是必需的。本实验室以前的工作阐明了RIP3是一个核质穿梭蛋白，我们发现RIP3（D328A）也可以进行核质穿梭。有趣的是，RIP3（K50A）与RIP3-N都丧失了核质穿梭能力。RIP3-C在胞质弥散分布时可以核质穿梭，然而一旦形成了点状或丝状结构则不能进行核质穿梭。这些结果表明RIP3的核质穿梭与其诱导caspase非依赖的凋亡能力是密切相关的。我们还发现RIP3和RIP3（D328A）在凋亡时均可从胞质进入到细胞核，暗示了RIP3可能在细胞核中诱导caspase非依赖的细胞凋亡。
郝军元[7]（2006）在《凋亡素重组蛋白导向治疗肿瘤的研究》文中认为凋亡素是鸡贫血病毒（CAV）vp3基因编码一个功能性蛋白,主要引起鸡单核细胞凋亡。多年来对凋亡素研究证明它能够特异诱导肿瘤细胞发生凋亡而对正常体细胞无损伤作用。凋亡素在肿瘤的治疗中是一个独立的因子,凋亡素诱导的细胞凋亡不依赖于p53基因,在肿瘤细胞内高水平表达的Bcl-2能够促进凋亡素诱导的凋亡。凋亡素的这些特征在肿瘤治疗中体现了巨大的潜力,已成为肿瘤治疗研究领域的热点。为探索凋亡素蛋白导向治疗肿瘤的方法,本研究将凋亡素基因与生长抑素基因和绿脓杆菌外毒素转膜系统基因重组,重组蛋白能以生长抑素为导向富集于肿瘤组织,并通过绿脓杆菌外毒素转膜系统将凋亡素进入肿瘤细胞,以促进肿瘤细胞的凋亡。本研究首先采用原核表达系统表达了凋亡素蛋白并制备其抗体为下一步凋亡素重组蛋白的检测奠定基础,随后通过PCR重叠延伸技术将凋亡素基因与生长抑素基因和绿脓杆菌外毒素转膜系统基因重组,获得凋亡素重组蛋白基因,并在杆状病毒和酵母表达系统实现了凋亡素重组蛋白的表达。凋亡素重组蛋白在体外对肿瘤细胞的凋亡作用试验表明,凋亡素重组蛋白对肿瘤细胞有凋亡作用,能够抑制肿瘤细胞增殖,但不同肿瘤细胞凋亡率存在差异。通过上述实验,证实凋亡素重组蛋白能够诱导肿瘤细胞凋亡,为进一步利用凋亡素治疗肿瘤奠定基础。
叶霞[8]（2006）在《苹果、梨铁蛋白基因的克隆及菜豆铁蛋白基因在转基因苹果和番茄植株中的表达特性研究》文中研究表明铁蛋白是一种铁贮藏结合蛋白，广泛存在于植物、动物、微生物中，由24个亚基组成450KD的巨大复合体，可以储藏结合4500个可溶、非毒性、可利用的铁原子，在生物体内铁的代谢方面起着关键作用。 苹果是世界范围内广泛栽培的果树，但目前关于苹果铁蛋白基因的克隆和表达特性的研究却很少。本试验研究了苹果和梨铁蛋白基因和启动子的克隆，以及铁蛋白基因在转基因和非转基因苹果基因组中的表达特性，对转基因苹果基因组中铁蛋白基因表达的影响因素进行了探讨，并利用番茄作为模式植物对外源铁蛋白基因在转基因苹果基因组内的表达进行了预测。 1．根据已报道植物铁蛋白基因（ferritin）的保守区域设计引物，用RT-PCR和RACE的方法从‘嘎拉’苹果（Malus domestica Borkh．cv‘Gala’）叶片中获得苹果铁蛋白基因（MdFer）的全长序列。该基因已被GenBank数据库收录，登录号为DQ099429。该cDNA共含1043个碱基，编码区831bp，编码277个氨基酸残基的蛋白质，终止密码子后有209bp左右的3’端尾随序列区。通过GenBank同源性比对发现，该基因与大豆、豇豆、拟南芥、烟草、小金海棠、小麦、水稻、玉米铁蛋白基因氨基酸序列同源性分别为85％、83％、82％、80％、75％、74％、72％、71％。Southern杂交结果显示，Ferritin基因在‘嘎拉’苹果基因组中至少有7个拷贝存在。0.5mM的柠檬酸铁处理‘嘎拉’苹果试管苗的茎段不同时间后的定量RT-PCR表明，该基因随着诱导时间的延长表达量增加，说明‘嘎拉’苹果的铁蛋白基因在转录水平上受铁诱导表达。同时利用Promoter Walking方法从‘嘎拉’苹果基因组中克隆出MdFer的启动子序列。该启动子序列具有G-box、BlockⅡ、SHS等铁蛋白基因启动子所共有的序列特征，并且在-83—-70bp的位置与ZmFer1启动子的IDRS（Iron-dependent Regulation Sequence）区域同源性较高。 2．根据已报道植物铁蛋白基因的保守区域设计引物，用RT-PCR和RACE的方法从‘翠冠’梨（Pyrus pyrifolia Nakai．cv‘Cuiguan’）叶片中克隆到四种铁蛋白基因的全长序列。这四种基因已被GenBank数据库收录，登录号分别为DQ417207、DQ417208、DQ417209、DQ417210。第一种梨铁蛋白基因PpFer1的全长为795bp，编码265个氨基酸残基的蛋白质，终止密码子后有292bp的3’端尾随序列区；第二种梨铁蛋白基因
董潇[9]（2005）在《鸟苷酸交换因子Vav1与核基质蛋白MINT相互作用的初步研究》文中研究指明MINT（Msx2-interacting nuclear target protein）是在研究与MSX2（Muscle segment homeobox 2）相互作用的蛋白时,发现的一个核基质蛋白,MSX2是一个同源盒转录抑制因子,参与颅骨和神经的发育。MINT属于在多个发育过程中都发挥着重要作用的Spen蛋白家族。Spen家族蛋白大小相差较大,从90～600kD不等,但都特征性的在N末端包含数个RRMs（RNA recognition motifs）结构域,在C末端包含一个保守的SPOC（Spen paralog and ortholog C-terminal domain）结构域,其主要负责介导与SMRT/N-CoR等共抑制因子的相互作用。后来又确认了MINT蛋白的人同源物SHARP（SMRT/HDAC1 associated repressor protein）,受到核受体募集参与转录抑制调控复合体。MINT/SHARP介导的转录抑制对于HDAC（Histone deacetylases）的抑制剂TSA敏感,同时SHARP也是HDAC共抑制复合体中的新的组成之一,说明MINT/SHARP介导的转录抑制是HDAC依赖性的。最近,Kuroda以及Oswald等人研究发现MINT蛋白及
常丽青[10]（2005）在《单子叶石蒜科植物黄花石蒜甘露糖结合凝集素基因的克隆及序列分析；风雨花凝集素基因转化烟草及其在转基因烟草中的表达》文中研究表明黄花石蒜凝集素（Lycoris chinensis Agglutinin, LCA）是来源于石蒜科的具有多重生物学活性的甘露糖结合蛋白,属于单子叶甘露糖结合凝集素。这类凝集素由于具有独特的糖结合特异性、逆转录病毒抑制活性和保护农作物免受昆虫和线虫攻击而引起人们浓厚的兴趣。本文采用同源克隆的方法,通过对黄花石蒜球茎RNA的提取,反转录成cDNA,从Genbank上比较已登录的石蒜科凝集素的序列,找出其保守序列,并结合软件设计了简并引物,进行3’RACE末端快速扩增,得到了3’端的部分序列（序列号为AY690318）,序列长为516bp,然后根据已得到的序列设计特异性引物,应用在cDNA的3’端随机添加若干PolyA的方法,在cDNA模板3’端加上PolyA,再以此为模板进行PCR,从而克隆得到了黄花石蒜5’端的部分序列（序列号为AY763111）,序列长为411bp,将3’与5’序列合并,就能获得cDNA全长序列（序列号为AY763112）。 以获得的全长cDNA序列和推导出的氨基酸序列与石蒜科其他植物凝集素在Genbank中的Blast上进行比较,可知黄花石蒜的全长cDNA序列由683个核苷酸组成,开放阅读框长486bp,编码162个氨基酸,起始密码子位于第37-39bp,终止密码子位于在523-525bp处,在起始密码子上游有一个由36个碱基组成的5’非编码区:在终止密码子下游有一个由141个碱基组成的3’非编码区,包括两个加poly（A）信号和一段真核生物mRNA所特有的poly（A）序列。通过序列的测定,发现LCA基因均编码前体蛋白:含有信号肽序列、成熟蛋白序列和C-末端剪切序列。该成熟蛋白由109个氨基酸组成,分子量为12.1KD。
二、核基质MINT N端片段(365～1084aa)相互作用蛋白的筛选及鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、核基质MINT N端片段(365～1084aa)相互作用蛋白的筛选及鉴定（论文提纲范文）
（1）G蛋白通路抑制因子2（GPS2）抑制A型流感病毒复制的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(abbreviation) |
| 1 前言 |
| 1.1 流感病毒概述 |
| 1.2 流感病毒编码蛋白质 |
| 1.3 vRNP的结构 |
| 1.4 vRNP转运入核 |
| 1.4.1 脱壳 |
| 1.4.2 依赖IMPα–IMPβ1途径入核 |
| 1.5 IAV基因组的转录 |
| 1.5.1 RdRP与宿主mRNA帽结构的结合 |
| 1.5.2 抢帽机制 |
| 1.5.3 转录起始延伸和终止 |
| 1.6 IAV基因组的复制 |
| 1.6.1 病毒RNA从头合成 |
| 1.6.2 启动子结合 |
| 1.6.3 反式作用或反式激活的顺式RNP |
| 1.6.4 宿主蛋白ANP32与vRNA复制 |
| 1.6.5 新合成cRNA的稳定 |
| 1.7 子代vRNP的装配 |
| 1.7.1 RdRP的组装 |
| 1.7.2 影响RdRP组装的宿主因子 |
| 1.7.3 NP蛋白分子伴侣及翻译后修饰 |
| 1.7.4 影响vRNP组装宿主因子 |
| 1.8 NEP与vRNP转运出核 |
| 1.9 抗流感病毒药物的开发与应用 |
| 1.9.1 针对M2离子通道的抗病毒策略 |
| 1.9.2 针对神经氨酸酶NA的抗病毒策略 |
| 1.9.3 针对血凝素HA的抗病毒策略 |
| 1.9.4 针对RdRP的抗病毒策略 |
| 1.10 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞与病毒 |
| 2.1.2 抗体和小分子化合物 |
| 2.1.3 分子相关试剂 |
| 2.1.4 质粒和小干扰RNA |
| 2.1.5 主要培养基和缓冲液的配制 |
| 2.1.6 主要实验仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 基因克隆 |
| 2.2.2 质粒提取(去内毒素质粒提取) |
| 2.2.3 细胞传代培养、转染和病毒感染 |
| 2.2.4 细胞活力测定 |
| 2.2.5 稳定表达细胞系及基因敲除细胞系的构建 |
| 2.2.6 流感病毒半数细胞培养物感染剂量(TCID_(50))测定 |
| 2.2.7 细胞RNA提取、反转录及定量PCR |
| 2.2.8 细胞总蛋白提取、定量和Western blot分析 |
| 2.2.9 哺乳动物细胞基因双杂交 |
| 2.2.10 聚合酶活性检测 |
| 2.2.11 GST Pull-Down |
| 2.2.12 免疫共沉淀 |
| 2.2.13 间接免疫荧光 |
| 2.2.14 细胞核细胞质分离提取 |
| 2.2.15 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 流感病毒核输出蛋白NEP与宿主蛋白GPS2产生相互作用 |
| 3.2 GPS2是IAV增殖的抑制因子 |
| 3.3 A型流感病毒感染促进GPS2蛋白的降解 |
| 3.3.1 病毒感染致GPS2蛋白降解 |
| 3.3.2 流感病毒感染通过蛋白酶体途径降解GPS2蛋白 |
| 3.4 GPS2的降解与核输出相关 |
| 3.4.1 MG132处理后细胞质中GPS2蛋白量增加 |
| 3.4.2 GPS2蛋白降解与相互作用引起的出核相关联 |
| 3.4.3 LMB抑制流感病毒感染引起的GPS2蛋白降解 |
| 3.5 病毒感染致GPS2出核由NEP介导 |
| 3.5.1 NEP上相互作用区域的确定 |
| 3.5.2 NEP介导GPS2出核 |
| 3.6 GPS2延迟病毒vRNP的出核 |
| 3.7 GPS2抑制IAV聚合酶活性 |
| 3.7.1 GPS2上相互作用区域的确定 |
| 3.7.2 GPS2抑制流感病毒聚合酶活性 |
| 3.7.3 GPS2与聚合酶亚基间的相互作用 |
| 3.7.4 GPS2抑制流感病毒RNA合成 |
| 3.8 GPS2 抑制流感病毒聚合酶组装 |
| 3.8.1 GPS2抑制PB1与PB2间的相互作用 |
| 3.8.2 GPS2抑制聚合酶的组装 |
| 3.9 NEP致弱GPS2对病毒聚合酶活性的抑制 |
| 4 讨论 |
| 4.1 GPS2抑制A型流感病毒复制的分子机制 |
| 4.2 GPS2抑制vRNA的合成 |
| 4.3 NEP促进GPS2蛋白降解 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（2）青岛和广州鼻咽癌组织中EBV核抗原2基因多态性的比较和分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 1.1 仪器、试剂和耗材 |
| 1.2 标本采集 |
| 1.3 核酸提取 |
| 1.4 EBV阳性标本的筛选 |
| 1.5 EBV潜伏期基因序列多态性检测 |
| 1.6 统计学析 |
| 结果 |
| 2.1 EBV阳性标本的鉴定 |
| 2.2 EBV基因多态性分析 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 EBNA1在病毒DNA复制和持续感染中的作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（3）NuMA与Astrin在细胞有丝分裂期相互作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 利用酵母双杂交系统筛选到一个新的与NuMA相互作用的纺锤体相关蛋白：Astrin |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 NuMA和Astrin在体内、体外的相互作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 NuMA-Astrin蛋白相互作用在细胞有丝分裂中的功能分析 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 博士期间的成果 |
| 致谢 |
（4）E3连接酶SIAH及其与PHC2和EEF1D蛋白的相互作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 SIAH通过泛素—蛋白酶体途径降解PHC2 |
| 一. 摘要 |
| 二. 前言 |
| 三. 材料和方法 |
| 四、实验结果 |
| 1. 用酵母双杂交方法筛选与SIAH相互作用的蛋白 |
| 2. SIAH与PHC2相互作用的进一步验证 |
| 3. SIAH与PHC2相互作用结构域的研究 |
| 4. SIAH通过泛素-蛋白酶体途径降解PHC2 |
| 5. SIAH降解PHC2后引起的细胞生物学功能初探 |
| 五. 讨论 |
| 六、小结 |
| 七. 参考文献 |
| 第二部分 EEF1D抑制SIAH的E3连接酶活性 |
| 一. 摘要 |
| 二. 前言 |
| 三. 材料和方法 |
| 四. 实验结果 |
| 1. 用酵母双杂交系统筛选与SIAH相互作用的蛋白 |
| 2. SIAH与EEF1D相互作用的进一步验证 |
| 3. SIAH与EEF1D相互作用结构域的研究 |
| 4. EEF1D可抑制SIAH的E3连接酶活性 |
| 五. 讨论 |
| 六. 小结 |
| 七. 参考文献 |
| 论文总结 |
| 综述:E3连接酶Siah的研究进展 |
| (一) Siah的起源 |
| (二) Siah相关的泛素化降解系统简介 |
| (三) Siah的结构 |
| (四) Siah结合蛋白的保守基序 |
| (五) Siah的功能 |
| (六) 关于Siah的调控 |
| 参考文献 |
| 研究生期间参与发表的文献及出版的书籍 |
| 攻读研究生期间参与的国家项目 |
| 致谢 |
（5）西伯利亚蓼抗病基因克隆、双价载体构建及遗传转化（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 绪论 |
| 1.1 目的意义 |
| 1.2 植物抗病基因的克隆 |
| 1.2.1 植物抗病基因的克隆技术 |
| 1.2.2 抗病基因克隆的快捷策略 |
| 1.3 植物抗真菌病害基因工程的策略 |
| 1.3.1 导入植物防卫反应基因增强植物抗病性 |
| 1.3.2 导入降解或抑制病原菌致病因子的基因使植物抗病 |
| 1.4 硫堇蛋白的研究与应用 |
| 1.4.1 硫堇蛋白 |
| 1.4.2 硫堇蛋白的分类及一级结构特征 |
| 1.4.3 硫堇蛋白的功能、作用机理及应用 |
| 1.5 植物几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的研究及其应用 |
| 1.5.1 植物几丁质酶的研究进展 |
| 1.5.2 植物几丁质酶的结构特征及分类 |
| 1.5.3 几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的特性、作用机理及应用 |
| 1.6 多基因转化策略 |
| 1.7 关于西伯利亚蓼的研究 |
| 2 西伯利亚蓼抗病基因的克隆、序列分析及表达特性研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株与质粒 |
| 2.1.3 分子生物学及生化试剂 |
| 2.1.4 寡聚核苷酸引物 |
| 2.1.5 培养基 |
| 2.1.6 RNA提取缓冲液的配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 植物材料西伯利亚蓼的处理 |
| 2.2.2 从SSH中分析筛选抗病相关基因EST |
| 2.2.3 西伯利亚蓼总RNA的提取 |
| 2.2.4 5'RACE及3'RACE模板的cDNA合成 |
| 2.2.5 西伯利亚蓼硫堇基因的克隆和序列分析 |
| 2.2.6 西伯利亚蓼几丁质酶基因的克隆、序列分析 |
| 2.2.7 盐胁迫下西伯利亚蓼葡聚糖酶基因的克隆、序列分析 |
| 2.2.8 盐胁迫下PsCHI1和PsGLUC1基因在西伯利亚蓼中的表达特性研究 |
| 2.2.9 结果与分析 |
| 2.2.10 讨论 |
| 2.2.11 本章小结 |
| 3 快速构建pROKⅡ植物双价表达载体的方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 菌株与质粒 |
| 3.1.3 分子生物学及生化试剂 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 大肠杆菌质粒DNA的提取 |
| 3.2.2 PsCHI1/pROKⅡ和PsGLUC1/pROKⅡ单价表达载体的构建 |
| 3.2.3 PsCHI1-PsGLUC1/pROKⅡ双价载体构建策略 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 PsCHI1/pROKⅡ和PsGLUC1/pROKⅡ单价载体质粒的酶切验证 |
| 3.3.2 "中间载体"更换酶切位点法构建双价载体的产物鉴定 |
| 3.3.3 35S和Tnos引物PCR方法构建双价载体的产物鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 双价表达载体在烟草中的遗传转化分析 |
| 4.1 材料与试剂 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 菌株与质粒 |
| 4.1.3 酶及生化试剂 |
| 4.1.4 储备液的制备 |
| 4.1.5 仪器设备 |
| 4.1.6 烟草组织培养所需培养基 |
| 4.1.7 DNA提取缓冲液的配制 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 单价载体及双价表达载体转化农杆菌 |
| 4.2.2 双价基因烟草的遗传转化 |
| 4.2.3 转基因烟草植株的分子鉴定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 农杆菌重组质粒的PCR鉴定 |
| 4.3.2 烟草的遗传转化 |
| 4.3.3 转基因烟草植株的分子鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录1 构建两个单价载体流程 |
| 附录2 "中间载体更换酶切位点法"构建双价载体流程 |
| 附录3 "35S和Tnos引物PCR法"构建双价载体流程 |
| 附录4 几种植物表达载体35S启动子序列比对 |
| 附录5 几种植物表达载体Tnos序列比对 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（6）RIP3诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 细胞凋亡及其信号转导 |
| 1.1.1 细胞凋亡的概念及其基本特征 |
| 1.1.2 凋亡、坏死及其它细胞死亡方式 |
| 1.1.3 细胞凋亡的生理意义和发展前景 |
| 1.1.4 细胞凋亡信号转导通路 |
| 1.2 RIP家族蛋白 |
| 1.2.1 概述 |
| 1.2.2 RIP |
| 1.2.3 RIP2 |
| 1.2.4 RIP3 |
| 1.2.5 RIP4 |
| 1.3 选题的背景及意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 常用实验技术及方法 |
| 2.2.1 聚合酶链式反应(Polymerase chain Reaction,PCR) |
| 2.2.2 基于PCR技术的定点突变 |
| 2.2.3 DNA样品的琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.5 DNA的酶切、回收、连接与转化 |
| 2.2.6 大肠杆菌质粒DNA的小规模抽提 |
| 2.2.7 细胞培养和转染 |
| 2.2.8 细胞凋亡率的测定 |
| 2.2.9 收获细胞及处理蛋白样品 |
| 2.2.10 蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 2.2.11 Western Blot |
| 2.2.12 免疫沉淀 |
| 2.2.13 体外剪切实验 |
| 2.2.14 双荧光素酶报告基因检测 |
| 第三章 研究结果 |
| 3.1 tRIP3在QGY-7703细胞的凋亡通路中可能位于FADD的上游 |
| 3.1.1 引言 |
| 3.1.2 tRIP3能明显诱导QGY-7703细胞凋亡 |
| 3.1.3 FADD-DN可以阻止tRIP3在QGY-7703细胞中诱导的凋亡 |
| 3.1.4 RIP3-DN不能阻止FADD在QGY-7703细胞中诱导的凋亡 |
| 3.1.5 tRIP3的两个保守氨基酸的突变不影响其凋亡活性 |
| 3.1.6 分析与讨论 |
| 3.2 RIP3剪切机制研究 |
| 3.2.1 引言 |
| 3.2.2 RIP3可以在凋亡刺激下被Caspase-8所剪切 |
| 3.2.3 确定RIP3分子上的切割位点 |
| 3.2.4 RIP3的剪切产物比全长RIP3更稳定 |
| 3.2.5 RIP3的剪切产物表现出不同的细胞定位和凋亡活性 |
| 3.2.6 RIP3的激酶活性对于它诱导caspase非依赖的凋亡是必需的 |
| 3.2.7 RIP3的剪切产物表现出不同的NF-κB激活能力 |
| 3.2.8 分析与讨论 |
| 第四章 工作总结 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略语 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
（7）凋亡素重组蛋白导向治疗肿瘤的研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 第一篇:文献综述 |
| 第一章 导向治疗的研究进展 |
| 1 肿瘤导向治疗 |
| 2 肿瘤导向治疗药物的研究进展 |
| 3 导向治疗肿瘤的前景与展望 |
| 第二章 细胞凋亡与肿瘤的发生和治疗 |
| 1 细胞凋亡 |
| 2 细胞凋亡的机制 |
| 3 细胞凋亡与肿瘤的发生发展 |
| 4 细胞凋亡与肿瘤的浸润和转移 |
| 5 细胞凋亡的调控基因与肿瘤 |
| 6 细胞凋亡与肿瘤治疗 |
| 第三章 凋亡素重组蛋白各组件研究进展 |
| 1 生长抑素 |
| 2 绿脓杆菌外毒素(PEA)转膜系统 |
| 3 Apoptin 的研究进展 |
| 第二部分:研究内容 |
| 第一章 凋亡素原核表达及其抗体的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 凋亡素重组蛋白在杆状病毒表达系统的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 凋亡素重组蛋白纯化及在体外对肿瘤细胞的抑制作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 凋亡素重组蛋白在酵母表达系统中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的主要论文 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
| 导师简历 |
| 个人简历 |
（8）苹果、梨铁蛋白基因的克隆及菜豆铁蛋白基因在转基因苹果和番茄植株中的表达特性研究（论文提纲范文）
| 原创性声明 |
| 学位论文版权使用授权书 |
| 目录 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 铁蛋白的结构 |
| 2 铁蛋白基因的种类 |
| 3 铁蛋白的分布 |
| 4 植物铁蛋白的功能 |
| 4.1 铁蛋白在植物铁平衡中的作用 |
| 4.2 铁蛋白在植物发育中的作用 |
| 4.3 铁蛋白在植物对胁迫反应中的作用 |
| 4.3.1 铁蛋白是一种普遍存在的胁迫反应蛋白 |
| 4.3.2 铁蛋白与生物胁迫 |
| 4.3.3 铁蛋白与非生物胁迫 |
| 5 植物铁蛋白的合成调节 |
| 6 铁蛋白基因的克隆 |
| 7 铁蛋白的转基因应用 |
| 7.1 粮食作物的转基因应用 |
| 7.2 园艺作物的转基因应用 |
| 7.3 其它植物 |
| 8 结语 |
| 第二章 苹果铁蛋白基因和启动子的克隆及表达特性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 总DNA的提取 |
| 1.2.2 DNA的检测与定量 |
| 1.2.3 总RNA的提取 |
| 1.2.4 总RNA中DNA的消化 |
| 1.2.5 基因保守片段的克隆 |
| 1.2.6 3'RACE |
| 1.2.7 5'RACE |
| 1.2.8 Southern blotting检测 |
| 1.2.9 RT-PCR定量检测 |
| 1.2.10 启动子的克隆 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 苹果ferritin基因的克隆 |
| 2.1.1 苹果ferritin基因保守片段的克隆 |
| 2.1.2 3'RACE |
| 2.1.3 5'RACE |
| 2.1.4 苹果ferritin基因全长cDNA的克隆 |
| 2.1.5 苹果ferritin基因组序列及特征分析 |
| 2.1.6 氨基酸序列的同源性分析 |
| 2.1.7 基因组DNA的Southern blotting分析 |
| 2.2 苹果铁蛋白基因的表达特性 |
| 2.3 苹果铁蛋白基因启动子的克隆 |
| 2.3.1 基因组DNA的酶切 |
| 2.3.2 启动子目的条带的扩增 |
| 2.3.3 启动子序列的分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 梨铁蛋白基因和启动子的克隆 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 总DNA的提取 |
| 1.2.2 DNA的检测与定量 |
| 1.2.3 总RNA的提取 |
| 1.2.4 总RNA中DNA的消化 |
| 1.2.5 ferritin基因保守片段的克隆 |
| 1.2.6 3'RACE |
| 1.2.7 5'RACE |
| 1.2.8 Southern blotting检测 |
| 1.2.9 启动子的克隆 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 梨ferritin基因保守片段的克隆 |
| 2.2 3'RACE |
| 2.3 5'RACE |
| 2.4 梨ferritin基因全长cDNA的克隆 |
| 2.5 梨铁蛋白基因组序列及特征分析 |
| 2.6 氨基酸序列的同源性分析 |
| 2.7 基因组DNA的Southern杂交分析 |
| 2.8 启动子目的条带的扩增 |
| 2.9 启动子序列的分析 |
| 3 讨论 |
| 第四章 超声波介导菜豆铁蛋白基因转化苹果的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 质粒DNA |
| 1.3 化学试剂和仪器 |
| 1.4 质粒的DNA提取 |
| 1.5 超声波转化 |
| 1.6 转化愈伤组织的筛选 |
| 1.7 PCR扩增目标DNA |
| 1.8 Southern blotting检测 |
| 1.9 RT-PCR检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 超声强度和时间对转化的影响 |
| 2.2 转菜豆铁蛋白基因苹果植株的获得 |
| 2.3 PCR检测 |
| 2.4 基因组DNA的酶切 |
| 2.5 Southern blotting检测 |
| 2.6 RT-PCR检测 |
| 3 讨论 |
| 第五章 转菜豆铁蛋白基因的苹果植株的分子鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 化学试剂 |
| 1.3 转基因株系和非转基因株系继代所用的培养基 |
| 1.4 菌种和质粒 |
| 1.5 质粒的DNA提取 |
| 1.6 PCR检测 |
| 1.7 PCR-Southern杂交检测 |
| 1.8 Southern blotting检测 |
| 1.9 RT-PCR检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 PCR检测 |
| 2.2 PCR-Southern blotting检测 |
| 2.3 基因组DNA的酶切 |
| 2.4 Southern blotting检测 |
| 2.5 RT-PCR检测 |
| 3 讨论 |
| 第六章 铁蛋白基因在转基因苹果基因组中的表达特性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 总DNA和RNA的提取 |
| 1.2.2 荧光定量RT-PCR检测 |
| 1.2.3 外源铁蛋白基因在不同转基因株系茎段中的转录表达检测 |
| 1.2.4 铁蛋白基因的铁诱导转录表达检测 |
| 1.2.5 铁蛋白基因在转基因植株不同部位的转录表达检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 转基因植株基因组中外源铁蛋白基因的表达检测 |
| 2.1.1 RT-PCR产物特异性检验 |
| 2.1.2 标准曲线的绘制 |
| 2.1.3 外源菜豆铁蛋白基因cDNA相对定量 |
| 2.2 在铁诱导条件下的铁蛋白基因的转录表达特性 |
| 2.3 铁蛋白基因在转基因植株不同部位的转录表达特性 |
| 3 讨论 |
| 第七章 转菜豆铁蛋白基因番茄植株的分子鉴定及表达研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 化学试剂 |
| 1.3 菌种和质粒 |
| 1.4 转化植株的分子鉴定 |
| 1.4.1 转基因番茄植株的PCR检测 |
| 1.4.2 PCR-Southern blotting检测 |
| 1.4.3 Southern blotting检测 |
| 1.4.4 RT-PCR检测 |
| 1.5 转基因植株铁、锌、锰含量的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 PCR检测 |
| 2.2 PCR-Southern blotting检测 |
| 2.3 Southern blotting检测 |
| 2.4 RT-PCR检测 |
| 2.5 转基因番茄组织中的铁、锌、锰含量的变化 |
| 3 讨论 |
| 全文讨论 |
| 1 苹果、梨铁蛋白基因的序列比较和功能预测 |
| 1.1 铁蛋白基因的克隆 |
| 1.2 铁蛋白基因的序列比较与功能预测 |
| 1.3 铁蛋白基因启动子的克隆 |
| 2 在转基因植株中影响铁蛋白基因表达的因素 |
| 2.1 转化方法对外源基因表达的影响 |
| 2.2 外源基因插入的拷贝数与表达的关系 |
| 2.3 外源基因和内源基因的同源性与表达的关系 |
| 2.4 外源基因的铁诱导表达特性 |
| 2.5 启动子对铁蛋白基因表达的影响 |
| 2.6 不同种类铁蛋白基因的表达特性 |
| 3 今后进一步研究方向 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士期间发表论文 |
| 致谢 |
（9）鸟苷酸交换因子Vav1与核基质蛋白MINT相互作用的初步研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 正文 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 2.1.酵母双杂交系统中质粒构建及相互作用检测 |
| 2.2.Vavl全长的克隆构建 |
| 2.3.免疫共沉淀 |
| 3.实验结果 |
| 3.1.酵母双杂交验证MINT-F1与Vav1-C端相互作用并对其具体作用区域的初步探讨 |
| 3.2.Vav1全长分子的获得 |
| 3.3.哺乳动物细胞内Co-IP确证MINT-F1与Vav1的相互作用 |
| 4.讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历及研究成果 |
| 致谢 |
（10）单子叶石蒜科植物黄花石蒜甘露糖结合凝集素基因的克隆及序列分析；风雨花凝集素基因转化烟草及其在转基因烟草中的表达（论文提纲范文）
| 第一部分 目录 |
| 一、摘要 |
| 二、Abstract |
| 三、论文 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料、菌株及常用质粒载体 |
| 2.1.2 试剂盒、酶 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 药品 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 黄花石蒜总 RNA的提取 |
| 2.2.2 反转录及聚合链式扩增法 |
| 2.2.2.1 3'RACE PCR反应 |
| 2.2.2.2 5'RACE PCR反应 |
| 2.2.3 PCR扩增片段的回收、连接 |
| 2.2.3.1 PCR扩增片段的回收 |
| 2.2.3.2 PCR扩增片段的连接 |
| 2.2.4 PCR扩增片段的转化和鉴定 |
| 2.2.4.1 感受态细胞的制备 |
| 2.2.4.2 转化 |
| 2.2.5 测序和序列分析 |
| 3 结果和分析 |
| 3.1 黄花石蒜总 RNA的提取 |
| 3.2 黄花石蒜凝集素cDNA基因的克隆 |
| 3.2.1 黄花石蒜凝集素cDNA基因3’末端片段的克隆 |
| 3.2.2 黄花石蒜凝集素cDNA基因5’末端片段的克隆 |
| 3.3 黄花石蒜凝集素基因全长核苷酸序列及推导的蛋白序列的分析 |
| 3.4 LCA前体蛋白推测的氨基酸序列的同源性分析 |
| 3.5 LCA成熟蛋白编码氨基酸序列的同源性分析 |
| 3.6 LCA蛋白信号肤的氨基酸序列分析 |
| 3.7 LCA蛋白的性质与结构的预测 |
| 3.7.1 蛋白质分子量、等电点 |
| 3.7.2 蛋白质的氨基酸组成 |
| 3.7.3 蛋白质的疏水区预测 |
| 3.7.4 LCA成熟蛋白序列中结构域的预测分析 |
| 3.7.5 LCA专一性结合糖基化位点盒分析 |
| 3.7.6 LCA成熟蛋白质的二级结构预测 |
| 3.7.7 LCA成熟蛋白质的高级结构预测 |
| 3.7.8 蛋白质修饰位点预测 |
| 3.7.9 蛋白质的跨膜结构区预测 |
| 3.8 黄花石蒜凝集素基因与大肠杆菌密码子使用频率的比较 |
| 3.9 LCA和其他单子叶甘露糖结合凝集素的进化关系 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 6 参考文献 |
| 第二部分 目录 |
| 一、摘要 |
| 二、Abstract |
| 三、论文 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料、菌株及常用质粒载体 |
| 2.1.2 试剂盒、酶 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 药品 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 风雨花总 RNA的提取 |
| 2.2.2 风雨花凝集素基因的制备 |
| 2.2.2.1 特异性引物的设计 |
| 2.2.2.2 风雨花凝集素基因的获得 |
| 2.2.2.3 风雨花凝集素基因的双酶切 |
| 2.2.3 PBI121载体的构建 |
| 2.2.3.1 PBI121载体质粒的提取及双酶切 |
| 2.2.3.2 风雨花凝集素片段与PBI121载体的连接 |
| 2.2.3.3 转化 |
| 2.2.3.4 鉴定 |
| 2.2.3.5 测序及序列分析 |
| 2.2.4 载体对农杆菌的转化及鉴定 |
| 2.2.4.1 农杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.4.2 PBI121重组质粒的提取 |
| 2.2.4.3 冻融法转化农杆菌 |
| 2.2.4.4 鉴定 |
| 2.2.5 农杆菌介导的烟草的转化 |
| 2.2.5.1 农杆菌对烟草叶片的感染 |
| 2.2.5.2 转基因烟草苗的获得及形态观察 |
| 2.2.5.3 转基因植株的检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 ZGA基因的扩增 |
| 3.2 表达载体的构建 |
| 3.2.1 表达载体 PBI121的制备 |
| 3.2.2 目的片段的制备 |
| 3.2.3 表达载体的鉴定 |
| 3.2.4 农杆菌中重组质粒的鉴定 |
| 3.3 Kan抗性植株的分化与形态观察 |
| 3.4 转基因植株的鉴定 |
| 3.4.1 PCR检测 |
| 3.4.2 反转录聚合链式扩增检测 |
| 3.4.3 凝血活性检测 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 6 参考文献 |
| 文献综述 目录 |
| 一、前言 |
| 二、植物凝集素的概述 |
| 2.1 植物凝集素的命名与分类 |
| 2.2 植物凝集素的生理及生物学功能 |
| 2.2.1 在植物防御中的作用 |
| 2.2.2 充当植物储存蛋白 |
| 2.2.3 在结瘤中的作用 |
| 三、植物凝集素的转基因研究进展 |
| 3.1 植物抗虫基因工程研究进展 |
| 3.1.1 Bt毒蛋白基因 |
| 3.1.2 外源植物凝集素基因 |
| 3.1.3 蛋白酶抑制剂基因 |
| 3.1.4 淀粉酶抑制剂基因 |
| 3.1.5 提高抗虫基因在植物体内的表达 |
| 3.2 植物基因工程方法研究进展 |
| 3.2.1 基因枪法 |
| 3.2.2 PEG法 |
| 3.2.3 微注射法、电击法及激光法 |
| 3.2.4 花粉管通道法 |
| 3.2.5 农杆菌介导法 |
| 3.3 植物转基因沉默 |
| 3.3.1 转基因沉默机理 |
| 3.3.2 转录水平的基因沉默 |
| 3.3.3 转录后水平的基因沉默 |
| 3.4 转基因的安全性 |
| 3.4.1 转基因植物的环境安全性 |
| 3.4.2 转基因植物的食品安全性 |
| 四、前景与讨论 |
| 五、参考文献 |
| 六、致谢 |
| 声明 |
四、核基质MINT N端片段(365～1084aa)相互作用蛋白的筛选及鉴定（论文参考文献）
- [1]G蛋白通路抑制因子2（GPS2）抑制A型流感病毒复制的分子机制研究[D]. 龚文孝. 华中农业大学, 2021
- [2]青岛和广州鼻咽癌组织中EBV核抗原2基因多态性的比较和分析[D]. 张超. 青岛大学, 2016(04)
- [3]NuMA与Astrin在细胞有丝分裂期相互作用的研究[D]. 褚小刚. 武汉大学, 2013(07)
- [4]E3连接酶SIAH及其与PHC2和EEF1D蛋白的相互作用研究[D]. 伍慧玲. 复旦大学, 2009(01)
- [5]西伯利亚蓼抗病基因克隆、双价载体构建及遗传转化[D]. 刘昌财. 东北林业大学, 2008(11)
- [6]RIP3诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制研究[D]. 冯珊珊. 中国科学技术大学, 2007(08)
- [7]凋亡素重组蛋白导向治疗肿瘤的研究[D]. 郝军元. 吉林大学, 2006(09)
- [8]苹果、梨铁蛋白基因的克隆及菜豆铁蛋白基因在转基因苹果和番茄植株中的表达特性研究[D]. 叶霞. 南京农业大学, 2006(02)
- [9]鸟苷酸交换因子Vav1与核基质蛋白MINT相互作用的初步研究[D]. 董潇. 第四军医大学, 2005(06)
- [10]单子叶石蒜科植物黄花石蒜甘露糖结合凝集素基因的克隆及序列分析；风雨花凝集素基因转化烟草及其在转基因烟草中的表达[D]. 常丽青. 四川大学, 2005(02)