血液病骨髓单个核细胞Leptin mRNA表达的研究

一、血液疾病时骨髓单个核细胞内Leptin mRNA表达的研究（论文文献综述）

孙睿婕^[1]（2021）在《自噬异常在免疫性血小板减少症发病机制中的作用探讨》文中研究表明免疫性血小板减少症（ITP）是一种多因素介导的自身免疫性出血性疾病,特点是血小板破坏过多和/产生减少,ITP约占临床上出血性疾病的30%左右。与许多自身免疫性疾病一样,免疫性血小板减少症的发生发展与复杂的免疫系统失调有关。最初认为,ITP的出血现象是由于血浆抗体攻击血小板自身抗原所致。自身抗体不仅破坏血小板,而且抑制血小板的产生和骨髓中巨核细胞的成熟。虽然自身抗体在ITP的发病机制中起着关键作用,但仅有50%左右的ITP患者体内可以检测到自身抗体。因此,传统观点已被更为复杂的机制所取代,如调节性T细胞、调节性B细胞和抗原提呈细胞介导的血小板生成受损和免疫效应紊乱。另外,ITP患者血浆白细胞介素（interleukin,IL）-35、IL-10 和转化生长因子（transforming growth factor,TGF）浓度降低等因素对ITP的发病也起到重要作用。近年来,实验和临床证据表明,一些自身免疫性疾病如类风湿关节炎（RA）、系统性红斑狼疮（SLE）和ITP与自噬活动紊乱密切相关。自噬相关基因的缺失和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的过度表达在ITP中也有报道。这些发现可能有助于进一步解释ITP患者免疫失耐受的原因。自噬也称为自噬—溶酶体途径,是真核生物体内的一种高度保守的生物学过程,作用是将有缺陷的细胞器和大分子传递到溶酶体,形成自噬溶酶体进行分解消化。自噬被分为多个部分:起始、延伸、融合和分解。其中Beclinl（酵母中的Atg6）特异性参与哺乳动物的自噬,它通过参与自噬Ⅲ类磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）的组装,完成自噬的起始阶段。在延伸阶段,LC3的募集和定位在自噬体形成中起着至关重要的作用,是评价自噬水平的重要标志。在这一过程中,定位于细胞质的LC3I被Atg4切割成LC3Ⅱ,然后与Atg3及磷脂酰乙醇胺形成复合物,组成自噬小体,因此,LC3Ⅱ的含量代表自噬小体的丰度。p62也被称为sequestosome 1（SQSTM1）,可以通过泛素化选择性降解底物。p62负责将错误折叠的或不需要的蛋白质装载到自噬体中,用于溶酶体降解,它作为一个开关,将自噬转化为一种低效的形式。作为自噬的经典底物,p62的增加表明自噬减少或降解受损蛋白的能力降低。PI3K/Akt/mTOR信号通路是调节自噬的一个重要的信号通路,通过调控下游信号分子,参与免疫反应的调节和炎症因子的释放。mTOR是PI3K/Akt/mTOR信号通路中的关键激酶和负调控因子,在生理条件下和环境应激条件下,mTOR可通过感知细胞内营养水平调控细胞增殖、生长、存活和血管生成。当细胞缺乏营养物质时,mTOR通过诱导自噬抑制细胞内代谢,并恢复胞质成分向细胞提供营养物质。Akt在PI3K通路中的中心作用使其成为最活跃的下游效应因子之一。Akt与GPIbα的胞质结构域相互作用,并根据vWF GPIbα的相互作用转导信号,导致血小板激活。PTEN作为自噬的关键阳性调节分子,可阻断该通路对自噬的抑制作用,从而激活自噬,形成自噬小体。Hou等人在体外实验观察到靛玉红可以恢复ITP患者CD4+T细胞的程序性细胞死亡1（PD1）和PTEN的表达,进而导致Akt/mTOR通路的衰减,维持ITP患者T细胞的稳态。因此,我们可以推测,PTEN突变导致PI3K/Akt/mTOR通路的激活和自噬的抑制,并在ITP的启动和进展中发挥作用。自噬不仅参与细胞发育、肿瘤抑制、细胞内稳态、饥饿适应、衰老、先天免疫等一般生理过程,而且在维持造血微环境稳态及造血干细胞、巨核细胞、血小板功能中也发挥着重要作用。自噬相关基因（Atgs）缺失的动物模型已经证实,自噬对于正常的巨核细胞生成和维持血小板功能是必不可少的。然而,过度或减弱的自噬都会导致病理情况。新近研究发现,ITP小鼠与正常小鼠相比,前者的特征是出现未成熟巨核细胞/血小板和祖细胞的频率更高,以及存在明显异常的自噬活动。ITP患者中也存在异常的自噬活动,mTOR通过过度表达抑制自噬活动,继而影响造血干细胞的表面标记物（如CD41、CD61）的表达以及巨核细胞的形成和分化,导致血小板的功能和数量下降,最终导致ITP发病。除此之外,自噬在维持T细胞的稳态和生存作用中也发挥着重要作用。许多基因模型也已证实了自噬对T细胞的特定作用,例如,Atg5-、Atg7-、Atg3-T细胞小鼠的淋巴和脾脏中,T细胞数量和有效增殖能力显着减少,凋亡水平增加。本研究以临床样本为基础,通过蛋白质谱测定差异蛋白,通过Real-time PCR测定自噬相关蛋白Beclinl,LC3I,P62及自噬通路蛋白PTEN,PI3K,Akt,mTOR的mRNA表达情况,探究ITP中异常的自噬活动。通过体外培养Dami细胞,使用雷帕霉素增强Dami细胞自噬活动,诱导巨核细胞分化发育,从细胞水平及分子水平探讨自噬活动异常在ITP发病机制中的作用。探究ITP中异常的自噬活动有望深入了解ITP的免疫失耐受机制,寻求新的靶向治疗方法。第一部分ITP中存在自噬相关蛋白的异常表达目的:探讨ITP患者中自噬相关蛋白的差异表达情况;探讨ITP患者自噬关键蛋白 Beclinl,LC3I,P62 及自噬通路调节蛋白 PTEN,PI3K,Akt,mTOR的表达情况。方法:（1）收集20例急性期ITP患者外周血及骨髓血,20例健康供者外周血及骨髓血于EDTA管中;（2）应用Ficoll-Paque密度梯度离心法对每个样本进行单个核细胞提取;（3）应用蛋白质谱分析确定差异表达蛋白;功能富集分析确定与自噬相关的差异蛋白;（4）应用Real-time PCR检测ITP患者组及对照组骨髓及外周血中Beclinl,LC3I,P62,PTEN,PI3K,Akt,mTOR的表达,进一步验证ITP患者自噬活动异常。结果:（1）经蛋白质谱检测显示:与正常对照相比,ITP患者自噬相关蛋白HSPA8、PARK7、YWHAH、ITGB3表达水平下调,自噬相关蛋白CSF1R表达上调,提示自噬活性异常参与ITP的发生发展;（2）经Real-time PCR检测显示:与正常对照组的外周血单个核细胞（PBMCs）相比,ITP患者组LC3I及P62的mRNA表达水平升高,骨髓单个核细胞（BMMCs）结果呈现相同趋势;与正常对照组BMMCs相比,ITP患者中Beclin1的mRNA表达水平升高,而PBMCs表达呈相反趋势。（3）经Real-time PCR检测显示:与正常对照组的PBMCs相比,ITP组的Akt及mTOR的mRNA表达水平增高,PTEN及PI3K表达表达水平下降,BMMCs中的mRNA结果除Akt并未表现出明显的统计学差异外,其余结果与PBMCs趋势相同,进一步验证该通路参与ITP的发生发展。结论:ITP患者自噬功能失调,存在自噬相关蛋白表达及活性异常,自噬异常可能参与ITP发生发展。第二部分 雷帕霉素通过增强Dami细胞自噬活动诱导巨核细胞分化发育目的:通过体外培养Dami细胞,使用不同剂量浓度的雷帕霉素调节自噬活动,分析自噬活性变化后巨核细胞分化及成熟情况,以探究自噬水平改变对巨核细胞分化发育的影响。方法:（1）通过不同浓度的雷帕霉素作用于Dami细胞系,增强自噬活性;（2）应用流式细胞术检测Dami细胞CD41+表达率,从细胞分子水平上探究自噬活性改变对巨核细胞分化的作用;（3）应用流式细胞术检测Dami细胞在雷帕霉素作用下的多倍体（4N）表达,显微镜下观察对巨核细胞发育的影响。结果:（1）通过雷帕霉素增强Dami细胞自噬表达水平,流式细胞技术检测巨核细胞CD41+表达率,结果表明,CD41+表达率明显升高,且呈剂量依赖性,证明雷帕霉素增强自噬水平,促进巨核细胞分化;（2）通过雷帕霉素增强Dami细胞自噬表达水平,进行DNA倍体化分析,结果表明,4N 比例明显升高,且呈剂量依赖性,证明雷帕霉素增强自噬水平,改善巨核细胞成熟度。结论:通过比对不同剂量的雷帕霉素对Dami细胞自噬、成熟及分化的影响,证明了自噬在巨核细胞分化和代谢调控中所发挥的重要作用,这可能为ITP的自噬靶向治疗提供新的策略。

谷梨花^[2]（2021）在《调节性B细胞与IL-9/IL-9R在再生障碍性贫血患者中的变化及临床意义》文中提出背景再生障碍性贫血（再障aplastic anemia,AA）是由多种原因引起的一种骨髓衰竭综合征。骨髓血细胞生成减少导致粒细胞、网织红细胞、单核细胞以及血小板均减少,临床表现为不同程度的贫血、出血和感染。目前公认,AA是T细胞介导的自身免疫性疾病。AA患者体内存在辅助性T细胞0（helper T lymphocyte 0,Th0）向辅助性T细胞1（helper T lymphocyte 1,Th1）极化和辅助性T细胞2（helper T lymphocyte 2,Th2）相对减少的免疫异常现象,导致Th1/Th2细胞比例失衡并向Th1细胞偏移,进而出现细胞免疫亢进、自身免疫被打破。这一变化可能与异常激活的T细胞分泌的细胞因子如白介素12（interleukin 12,IL-12）、干扰素γ（interferon-γ,IFN-y）等抑制骨髓造血干细胞的增殖分化有关。Th1细胞以分泌IFN-γ为特征,介导细胞免疫;Th2细胞以分泌IL-4为代表,参与体液免疫。本实验通过观察IFN-γ、IL-4的蛋白表达情况来间接观察AA患者体内Th1、Th2细胞的免疫状态。B细胞来源于造血干细胞,在骨髓成熟、次级淋巴器官激活,合成并分泌抗体,介导体液免疫。活化的B细胞表达多种细胞因子受体（cytokine receptor,CKR）、分泌多种细胞因子、参与抗原呈递、活化T细胞共同参与疾病免疫调节导致免疫紊乱。B细胞根据功能可分为效应性B细胞和调节性B细胞（regulatory B cells,Breg）。Breg细胞是类似于调节性T细胞（regulatory T cells,Treg）的具有免疫抑制功能的一组特殊B细胞亚群。Breg细胞主要通过分泌细胞因子IL-10、转化生长因子β（transforming growth factor-β,TGF-β）发挥免疫调节作用,影响其他免疫细胞,抑制过强的免疫应答,维持免疫耐受。Breg细胞中IL-10的表达与STAT家族磷酸化改变有关,在系统性硬化病中Breg细胞的缺乏与STAT3受损密切相关,进一步证明了Breg细胞分泌IL-10依赖STAT3的磷酸化。IL-10是一具有多种生物活性的免疫抑制因子,具有抑制CD4+T细胞增殖分化及分泌IFN-γ、抑制Th1和Th2细胞向两极分化、诱导T细胞分化为Treg细胞及分泌IL-10的免疫调节功能。TGF-β通过抑制骨髓造血细胞、抑制T细胞和B细胞的增殖、抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞的分化、抑制IFN-γ等炎性细胞因子的产生、诱导Treg细胞的分化及分泌细胞因子发挥免疫调节作用。另一方面Breg细胞可通过细胞间作用影响Treg细胞数量及功能而发挥免疫调节作用。在多种免疫系统疾病中Breg细胞的数量和功能均有不同程度减低,如强制性脊柱炎（ankylosing spondylitis,AS）、系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）、免疫性血小板减少症（immune thrombocytopenia,ITP）、慢性移植抗宿主病（chronic graft-versus-host disease,cGVHD）等。同为自身免疫性疾病的AA,Breg细胞在其发生发展中的作用及免疫调节机制如何?Breg细胞在AA患者体内发生怎样的变化及与其他免疫细胞的关系如何?为研究Breg细胞在AA发生发展中的作用,本研究首先分析了 AA患者骨髓及外周血中IL-10+CD19+Breg细胞亚群、TGF-β+CD19+Breg细胞亚群的变化;通过检测IL-10、TGF-β基因及蛋白水平表达情况,分析Breg细胞在AA患者体内的功能状态;通过分析与外周血反映骨髓增生程度相关临床指标（中性粒细胞计数、网织红细胞计数、血小板计数）的相关性,进而评估Breg细胞与AA疾病病情严重度程度及治疗预后转归的关联性。探讨Breg细胞在AA发病机制中的作用及临床意义,为AA的免疫治疗提供新的观点及方向。IL-9是一种单链糖蛋白,分子量为14kDa,是γ家族受体成员之一,主要由T细胞分泌,如Th2、Th9、Th17、Treg细胞等。IL-9与效应细胞上的白介素9受体（interleukin 9 receptor,IL-9R）结合后发挥免疫调节作用,与TGF-β协同诱导幼稚CD4+T细胞分化成Th17细胞,可增强Foxp3+Treg细胞的逆转录抑制功能。当IL-9与IL-9R结合时可通过激活JAK中的JAK1、JAK3相互磷酸化,促使STAT磷酸化,特别是STAT3磷酸化,之后它们移至细胞核以激活IL-9诱导的基因的表达,从而发挥影响细胞的增殖与凋亡作用。多项研究提示IL-9对免疫系统具有双向调节作用,不同情况下对各种疾病的抑制或促进作用各异。在实验性自身免疫性脑脊髓膜炎（experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）的小鼠模型中,提示IL-9具有抑制EAE发病的作用;在类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis,RA）、系统性硬化病（systemic sclerosis,SSc）患者体内 IL-9含量明显高于健康对照组,提示IL-9具有促进疾病发生发展的作用。既然IL-9在上述自身免疫性疾病的发生发展中具有一定的促进作用,那么对作为自身免疫性疾病的AA的发生发展作用如何呢?本研究应用酶联免疫吸附实验（ELISA）、实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）、蛋白印记分析（Western blot）技术检测AA患者外周血、骨髓中IL-9与IL-9R在基因及蛋白水平的表达情况,分析IL-9、IL-9R与AA患者体内反映骨髓增生程度的各临床特征之间的相关性。探讨IL-9、IL-9R在AA发病机制中的作用及临床意义,为基于IL-9的靶向治疗提供理论依据。第一部分调节性B细胞在再生障碍性贫血患者中的变化及临床意义目的:研究AA患者体内Breg细胞亚群分布与健康人群间的差异及与反映骨髓增生程度临床指标的相关性,探讨Breg细胞亚群在AA患者体内的功能,尝试发现Breg细胞在AA发生发展中的作用及临床意义。材料与方法:1.研究对象选取:选取初诊AA患者共40例包括16例重型再生障碍性贫血（重型再障severe aplastic anemia,SAA）、24例非重型再生障碍性贫血（非重型再障 non-severe aplastic anemia,NSAA）、治疗后再生障碍性贫血（Remission）20例及健康志愿者（Control）20例,收集入组研究对象的骨髓及外周血各5-10 ml。2.单个核细胞提取及细胞培养:采用密度梯度离心原理提取骨髓及外周血中的单个核细胞,计数后于含10%小牛血清的1640培养基中调整细胞浓度为1-2×106/ml。加入25 ng/mL佛波酯（联科生物公司）、0.5μg/mL离子霉素（联科生物公司）、0.5μL/mL Brefeldin A（联科生物公司）（PIB）,再加入5μg/mL CpG（ODN 7909 Invivogen）、0.5 μg/mL CD40L（RD公司）在5%CO2 37℃孵育箱内孵养共刺激培养5小时;收集骨髓上清和血清。3.Breg细胞亚群检测:采用流式细胞免疫荧光术、细胞免疫荧光术分别检测IL-10+CD19+Breg细胞亚群、TGF-β+CD19+Breg细胞亚群在SAA、NSAA、Remission、Control组骨髓及外周血单个核细胞中的表达。4.细胞因子（IL-10、TGF-β）基因水平检测:采用RT-PCR技术检测IL-10、TGF-β在SAA、NSAA、Remission、Control组骨髓及外周血单个核细胞中mRNA水平的表达。5.细胞因子（IL-10、TGF-β、INF-γ、IL-4）蛋白水平检测:采用ELISA技术检测IL-10、TGF-β、INF-γ、IL-4在SAA、NSAA、Remission、Control组骨髓上清及血清中蛋白水平的表达。6.临床评价:完整的病史,体格检查,采集4组研究对象的晨起空腹外周血用血常规分析仪检测中性粒细胞计数、血小板计数、网织红细胞计数。7.统计分析:所有结果均采用SPSS 21.0软件包进行统计学分析。结果:1.骨髓:SAA、NSAA、Remission、Control组的CD19+B细胞占单个核细胞的百分比四组依次为（7.62±3.54%、6.95±2.61%、7.62±1.98%、7.11 ±2.13%）,统计学分析示:SAA、NSAA、Remission组分别与Control组相比无明显升高和降低（P>0.05）,SAA、NSAA组与Remission组相比无明显升高和降低（P>0.05）。2.外周血:SAA、NSAA、Remission、Control组的CD19+B细胞占单个核细胞的百分比四组依次为（6.84±2.67%、7.32±2.49%、7.12±2.92%,8.17±3.35%）,统计学分析示:SAA、NSAA、Remission组分别与Control组相均降低（P>0.05）,SAA、NSAA组与Remission组相比无明显升高和降低（P>0.05）。3.骨髓:SAA、NSAA、Remission、Control组的IL-10+CD19+Breg细胞亚群占CD19+B细胞的百分比四组依次为（0.55±0.17%、1.39±0.41%、2.99±0.72%、3.28±1.04%）,TGF-β+CD 19+Breg细胞亚群占CD 19+B细胞的百分比四组依次为（1.16±0.26%、2.49±0.90%、4.80±1.04%、5.42±1.08%）,统计学分析示:SAA组 VS Control组显着减低（P<0.001）,NSAA组 VS Control组显着减低（P<0.001）,SAA组 VS Remission组显着减低（P<0.001）,NSAA组 VS Remission组显着减低（P<0.001）,SAA组 VS NSAA组减低（P<0.05）。4.外周血:SAA、NSAA、Remission、Control组IL-10+CD19+Breg细胞亚群占CD19+B细胞的百分比四组依次为（0.65±0.19%、1.54±0.40%、2.97±0.69%、3.33±0.85%）,TGF-β+CD 19+Breg细胞亚群占CD19+B细胞的百分比四组依次为（0.98±0.20%、2.71±0.79%、4.16±1.27%、4.64±1.27%）,统计学分析示:SAA组 VS Control组显着减低（P<0.001）,NSAA组 VS Control组显着减低（P<0.001）,SAA组 VS Remission组显着减低（P<<0.001）,NSAA组 VS Remission组显着减低（P<0.001）,SAA组VS NSAA组减低（P<0.05）。5.骨髓:SAA、NSAA、Remission、Control组的单个核细胞中IL-10的mRNA表达四组依次为（0.54±0.12、0.57±0.14、0.92±0.11、1±0.15）,TGF-β的mRNA表达四组依次为（0.54±0.10、0.69±0.16、0.89±0.21、1±0.16）;外周血:SAA、NSAA、Remission、Control组单个核细胞中IL-10的mRNA表达依次为（0.48±0.08、0.56±0.13、0.92±0.13、1±0.12）,TGF-β的mRNA表达四组依次为（0.46±0.14、0.59±0.18、0.92±0.15、1±0.15）,统计学分析示:统计学分析示:SAA组 VS Control组显着减低（P<0.001）,NSAA组 VS Control组显着减低（P<0.001）,SAA组VS Remission组显着减低（P<0.001）,NSAA组 VS Remission组显着减低（P<0.001）,SAA组 VS NSAA组减低（P<0.05）。6.骨髓上清:SAA、NSAA、Remission、Control组中IL-10的蛋白水平表达四组依次为（19.77±6.23 ng/mL、23.69±4.48 ng/mL、55.86±8.22 ng/mL、61.12±9.67 ng/mL）,TGF-β的蛋白水平表达四组依次为（34.99±6.35 ng/mL、42.40±12.00 ng/mL、77.71±9.79 ng/mL、85.01±14.00 ng/mL）;外周血清:SAA、NSAA、Remission、Control组中IL-10的蛋白水平表达四组依次为（22.27±5.86 ng/mL、26.45±5.19 ng/mL、57.20±12.80 ng/mL、63.30±11.01 ng/mL）,TGF-β的蛋白水平表达四组依次为（36.13±6.40 ng/mL、41.88±8.55 ng/mL、68.23±12.40 ng/mL、71.96±14.93 ng/mL）,统计学分析示:SAA组VS Control组显着减低（P<0.001）,NSAA组VS Control组显着减低（P<0.001）,SAA组VS Remission组显着减低（P<0.001）,NSAA组 VS Remission组显着减低（P<0.001）,SAA组 VS NSAA组减低（P<0.05）。7.骨髓上清:SAA、NSAA、Remission、Control组中IFN-γ/IL-4比值四组依次为（3.03±0.62、2.39±0.53、1.40±0.21、1.28±0.15）;外周血清:中IFN-y/IL-4比值四组依次为（2.81±0.45、2.35±0.54、1.37±0.24、1.26±0.13）,统计学分析示:SAA组VS Control组显着升高（P<0.001）,NSAA组VS Control组显着升高（P<0.001）,SAA组 VS Remission组显着升高（P<0.001）,NSAA组 VS Remission组显着升高（P<0.001）,SAA组VS NSAA组升高（P<0.05）。8.SAA、NSAA组骨髓及外周血中IL-10+CD19+Breg细胞亚群、TGF-β+CD1 9+Breg细胞亚群与AA反应骨髓增生程度相关临床指标（中性粒细胞计数、网织红细胞计数、血小板计数）分别呈正相关（P<0.05）,而Remission组则无明显相关性（P>0.05）。结论:1.AA患者CD 19+B细胞占单个核细胞的比例较健康对照组无显着性差异。2.骨髓及外周血中SAA、NSAA组Breg细胞（IL-10+CD19+Breg细胞亚群、TGF-β+CD19+Breg细胞亚群）占CD19+B细胞的比例较Remission、Control组显着性降低,SAA组较NSAA组降低,且与外周血反映骨髓增生程度的临床指标呈正相关;IL-10、TGF-β在基因及蛋白水平均较Remission、Control组显着性降低,SAA组较NSAA组降低,提示Breg细胞在AA的发生发展、疾病病情严重程度及预后转归中可能起一定的作用。3.AA患者骨髓及外周血中INF-y/IL-4较Remission、Control组显着升高,进一步证实AA患者体内存在Th1/Th2细胞比例失衡的细胞极化现象。第二部分IL-9/IL-9R在再生障碍性贫血患者中的变化及临床意义目的:研究AA患者骨髓及外周血中IL-9、IL-9R在基因及蛋白水平的表达及与反映骨髓增生程度临床指标（中性粒细胞计数、网织红细胞计数、血小板计数）的相关性;探讨IL-9、IL-9R在AA发病机制中的作用及临床意义,为基于IL-9的免疫治疗提供理论依据。材料与方法:1.研究对象选取:选取初诊AA患者共40例包括16例SAA、24例NSAA、Remission及Control各20例,收集入组研究对象的骨髓及空腹外周血各5-10 ml。2.单个核细胞提取:采用密度梯度离心原理提取骨髓及外周血中单个核细胞,并提取单个核细胞中的cDNA和蛋白;同时收集骨髓上清和血清并于-80℃冻存。3.采用ELISA技术检测AA患者骨髓上清及血清中IL-9蛋白水平的表达,检测结果与反映骨髓增生程度的相关临床指标行相关性分析。4.采用RT-PCR、Western blot技术检测IL-9、IL-9R在AA患者骨髓及外周血单个核细胞中基因及蛋白水平的表达,检测结果与反映骨髓增生程度的相关临床指标行相关性。5.统计分析:所有结果均采用SPSS 21.0软件包进行统计学分析。结果:1.IL-9在SAA、NSAA、Control组骨髓上清中蛋白表达三组依次为（2.48±0.56 ng/mL、2.25±0.32 ng/mL、1.28±0.40 ng/mL）,统计学分析示:SAA组 VS Control组升高（P<0.05）,NSAA组VS Control组升高（P<0.05）,SAA组VS NSAA组升高（P>0.05）,与反应骨髓增生程度相关指标呈负相关（P<0.05,r<0）。2.IL-9在SAA、NSAA、Control组血清中蛋白表达三组依次为（3.15±0.39 ng/mL、3.01±0.46 ng/mL、1.18±0.50ng/mL）,统计学分析示:SAA组 VS Control组升高（P<0.05）,NSAA组VS Control组升高（P<0.05）,SAA组VS NSAA组升高（P>0.05）,与反应骨髓增生程度相关指标呈负相关（P<0.05,r<0）。3.IL-9在SAA、NSAA、Control组骨髓单个核细胞中mRNA表达三组依次为（1.88±0.21、1.81±0.28、1.0±0.13）,IL-9R在上述三组骨髓单个核细胞中mRNA表达依次为（1.73±0.19、1.62±0.26、1.0±0.17）;IL-9在SAA、NSAA、Control组三组骨髓单个核细胞中蛋白水平表达依次为（2.38±0.27、1.84±0.02、1.0±0.16）,IL-9R在上述三组骨髓单个核细胞中蛋白水平表达依次为（2.96±0.22、2.13±0.10、1.0±0.04）。统计学分析示:SAA组 VS Control组升高（P<0.05）、NSAA组 VS Control组升高（P<0.05）,SAA组VSNSAA组升高（P>0.05）,与反应骨髓增生程度相关指标呈负相关（P<0.05,r<0）。4.IL-9在SAA、NSAA、Control组外周血单个核细胞中mRNA表达三组依次为（1.52±0.33、1.44±0.35、1.0±0.14）,IL-9R在上述三组外周血单个核细胞中mRNA表达依次为（1.66±0.18、1.55±0.22、1.0±0.15）;IL-9在SAA、NSAA、Control组外周血单个核细胞中蛋白水平表达三组依次为（3.23±0.08、2.12±0.25、1.0±0.16）,IL-9R在上述三组外周血单个核细胞中蛋白水平表达依次为（3.63±0.18、2.38±0.20、1.0±0.03）。统计学分析示:SAA组 VS Control组升高（P<0.05）、NSAA 组VS Control组升高（P<0.05）,SAA组 VS NSAA组升高（P>0.05）,与反应骨髓增生程度相关指标呈负相关（P<0.05,r<0）。结论:5.AA患者骨髓上清及外周血清中IL-9蛋白水平升高,SAA组升高更显着,与反映骨髓增生程度的临床指标呈负相关。6.AA患者骨髓及外周血单个核细胞中IL-9、IL-9R在基因及蛋白水平含量较健康对照明显升高,SAA组升高更显着,与反映骨髓增生程度的临床指标呈负相关。7.IL-9、IL-9R的异常表达与AA发生及疾病程度的严重性之间存在一定关联。补充:如我们所阐述,Breg细胞分泌IL-10与STAT3磷酸化密切相关;IL-9与IL-9R结合后发挥相应的生物学作用亦与STAT3磷酸化相关,提示Breg细胞与IL-9在发挥免疫调节作用时可能存在关联。在本课题中,我们进行了 Breg细胞亚群与IL-9、IL-9R的相关性分析,发现无明显的关联,考虑与本实验样本量较少有关,后续我们将扩大样本量,用于验证Breg细胞及IL-9/IL-9R与AA发生发展的关系如何。

刘芹芹^[3]（2020）在《树突状细胞NLRP3炎症小体及免疫失衡在急性髓系白血病作用和机制研究》文中认为急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）是恶性的血液系统疾病,其特征是骨髓造血干祖细胞克隆性增生、分化异常及凋亡受阻,在外周血、骨髓内及其他组织内大量增殖及浸润。AML骨髓微环境以免疫抑制为特征,与AML的发生发展相关,可促进免疫耐受和白血病细胞免疫逃逸。近年来虽然AML的治疗方法不断改进,但是许多患者仍然出现耐药、难治及复发,长期生存及预后不容乐观。树突状细胞（dendritic cells,DCs）是机体重要的抗原提呈细胞,在机体免疫应答中发挥重要的核心作用。DCs是连接机体适应性免疫和先天性免疫重要的桥梁,具有强大的抗原提呈能力,可以“驾驭”B细胞和T细胞两种重要的免疫细胞,在机体对病原体和抗肿瘤的保护性免疫应答中发挥重要的作用。DCs可以刺激体内的T细胞产生免疫应答,并在对肿瘤细胞杀伤的免疫反应中起重要作用。DCs具有免疫调节特性可以克服骨髓的免疫耐受,增强骨髓微环境免疫并诱导抗白血病特异性T细胞的增殖。活化的T细胞能够识别AML细胞上表达的抗原,并随后介导AML细胞杀伤。可以通过DCs免疫刺激自体T细胞减少或消除残留的白血病细胞预防AML复发,因此基于DCs的免疫疗法可能在根除AML患者残留白血病细胞方面更加成功。炎症小体是参与固有免疫的主要成分之一,NLRP3炎症小体是目前为止研究最多、最透彻的。NLRP3炎症小体在感染性疾病和免疫性疾病中影响Th亚群分化,但在AML中的研究很少。NLRP3炎症小体活化后,释放IL-1β活性细胞因子,可以诱导T细胞产生并释放细胞因子IL-2,维持T细胞的存活和促进T细胞增殖。T细胞是机体抗肿瘤反应的重要免疫细胞,通过释放细胞因子和细胞毒性物质来清除白血病细胞,NLRP3炎症小体通过调节T细胞增殖和分化,最终达到调控肿瘤的作用。尽管多数AML化疗后病情会缓解,但长期生存率并不理想。免疫抑制的骨髓微环境有利于白血病细胞的生长和免疫逃逸,具有免疫调节特性的治疗可以克服免疫耐受,提高骨髓微环境的免疫力,增强肿瘤的免疫原性,改善AML的预后。因此探究AML骨髓DCs细胞NLRP3炎症小体对骨髓微环境免疫的作用,研究免疫相关基因的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）与AML的关系,探索骨髓微环境免疫在AML发生发展中的作用及其机制,从而进一步探索抗白血病细胞免疫治疗的方法,为AML的免疫治疗提供策略。第一部分树突状细胞NLRP3炎症小体在急性髓系白血病骨髓Th1亚群分化的作用及机制研究背景急性髓系白血病（AML）机体免疫功能异常在其发生发展和耐药中发挥重要作用,免疫紊乱的骨髓微环境促进了免疫耐受,有利于白血病细胞逃逸,其作用机制可能与骨髓Th亚群失衡有关。免疫细胞主要包括T细胞、B细胞和NK细胞,是骨髓微环境免疫的重要组成部分,其中T细胞中的Th细胞免疫失衡引起了研究者的高度关注。AML骨髓中T细胞增殖和产生细胞因子的能力明显降低,AML白血病细胞通过骨髓髓系来源的抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）对T细胞发挥抑制作用,或阻止T细胞进入细胞周期或分泌Th1相关细胞因子。Th1细胞参与机体细胞免疫,在细胞免疫中发挥重要作用。Th1细胞与AML发病及预后密切相关,但其分子机制尚未明确。NLRP3炎症小体是一种细胞内传感器,感受“危险”信号后将细胞因子IL-1β和IL-18前体转变成其活性形式,该信号可以是宿主或病原体。NLRP3炎症小体是参与机体免疫的多蛋白复合物,其作用机制可能与介导Th亚群分化有关。NLRP3炎症小体在肿瘤微环境中能诱导Th1、Th2、Th17细胞及CTL细胞的分化并能抑制肿瘤的免疫逃逸。AML骨髓微环境免疫失衡及功能失调可以导致白血病的发生,且与治疗后残留白血病细胞的免疫逃逸相关,免疫功能紊乱的骨髓微环境可导致AML的复发及难治。研究发现AML骨髓Th1/Th2及Th17/Treg免疫失衡参与了白血病细胞的免疫逃逸,在AML发生发展和耐药中发挥重要作用。但是,目前树突状细胞NLRP3炎症小体是否参与了 AML骨髓T细胞分化尚未明确,尤其是Th1亚群分化的机制尚待研究。研究目的本研究旨在研究Th1亚群在AML骨髓微环境中是否存在免疫失衡;探索树突状细胞NLPR3炎症小体对AML骨髓中Th1亚群分化的影响及机制;研究树突状细胞NLRP3炎症小体对Th1相关细胞因子IFN-γ水平及相关转录因子表达的影响,进而分析NLRP3炎症小体对骨髓Th1亚群分化影响的关键分子,通过对关键分子的干预观察对Th1亚群的影响,明确NLRP3炎症小体参与AML免疫失衡尤其是Th1亚群分化的作用机制。研究方法（1）临床标本收集:本研究收集来自山东大学齐鲁医院的37例AML患者、30例AML治疗完全缓解（CR）患者、23例难治复发AML患者及16例对照的骨髓液,分离骨髓单个核细胞和CD4+T细胞,留取骨髓上清。（2）Th1细胞与AML患者临床特征的关系:收集、整理AML患者白细胞计数、治疗疗效等临床资料,流式细胞术检测骨髓中Th1细胞比例,分析骨髓Th1细胞比例与临床资料的相关性。（3）IFN-γ细胞因子水平与AML患者关系:酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测骨髓上清中的IFN-γ细胞因子水平,分析与AML的临床相关性。（4）树突状细胞及CD4+T细胞培养:AML患者骨髓单个核细胞（BMMCs）用IL-4和GM-CSF诱导培养为树突状细胞,并用流式细胞术检测树突状细胞CD14、CD11c、CD80、CD83、CD86分子表达情况及诱导DCs转化率。MACS分选骨髓BMMCs中的CD4+T细胞并用流式细胞术检测分选率。（5）树突状细胞NLRP3炎症小体活化及抑制:将诱导培养的树突状细胞分成三组:①实验组（LPS+ATP,LA）:树突状细胞先用脂多糖LPS预处理6小时,然后加ATP激活45分钟;②NLRP3炎症小体抑制组:LPS处理前,LPS处理前先加入炎症小体抑制剂MCC950作用1小时（MLA）;③对照组:加入对应量的无菌PBS。检测树突状细胞NLRP3炎症小体相关分子NLRP3、ASC、IL-18、Caspase-1、IL-1β及 NF-κB 的表达情况。（6）树突状细胞NLRP3炎症对CD4+T细胞分化影响:将以上3组DCs与CD4+T细胞共培养,7天后流式细胞术检测Th1、Th2、Th17及Treg细胞比例。（7）细胞因子检测:用多细胞因子阵列检测树突状细胞培养上清液中IL-12p70、IL-10、IFN-γ、IL-1β、IL-17A、IL-7、IL-4、IL-5、IL-6、IL-2、IL-8等细胞因子水平,用ELISA方法再次检测相关细胞因子水平。（8）IL-1β对Th1细胞分化的影响:在BMDCs和CD4+T细胞共培养对照组和抑制组加入重组人IL-1β细胞因子,在实验组加入人IL-1β中和抗体,流式细胞术检测Th1细胞比例。（9）树突状细胞NLRP3炎症小体促进Th1细胞分化的方式:将树突状细胞与CD4+T细胞进行接触或用小室分离共培养,流式细胞术检测CD4+T细胞中Th1比例,ELISA方法检测DCs与CD4+T细胞共培养上清液中IFN-y及IL-1β细胞因子水平。（10）IL-1β影响Th1细胞分化的机制:将分离的CD4+T细胞分为3组:①单独加入IL-12;②IL-12联合重组人IL-1β细胞因子;③加入对应量无菌PBS,RT-PCR检测各组CD4+T细胞中IFN-γ、IFN-γ受体和STAT1的表达。（11）树突状细胞NLRP3炎症小体对体内Th1细胞分化的影响:体外培养野生型（WT）或Nlrp3-/-C57BL/6J小鼠的树突状细胞,将WT小鼠树突状细胞分为3组:①实验组:LPS和ATP处理;②抑制组:炎症小体抑制剂MCC950作用1小时后LPS和ATP处理;③对照组:加入对应量的无菌PBS。Nlrp3-/-小鼠的树突状细胞分为实验组和对照组,然后将各组DCs通过尾静脉注入WT小鼠体内,观察树突状细胞NLRP3炎症小体对小鼠Th1亚群的影响,流式细胞检测小鼠骨髓、脾脏中Th1细胞比例。（12）IL-1β对小鼠Th1细胞分化的影响:将鼠IL-1β中和抗体注射到实验组小鼠体内,观察IL-1β对小鼠体内Th1亚群影响,流式细胞检测小鼠骨髓和脾脏中Th1细胞比例。研究结果:（1）AML初诊患者骨髓中Th1细胞比例与对照组相比显着降低,治疗达CR后患者骨髓Th1细胞比例明显增高;骨髓中Th1细胞比例与AML初诊患者外周血白细胞计数呈负相关,Th1细胞比例≤10%的AML患者外周血白细胞计数明显高于Th1>10%AML患者。（2）AML初诊患者骨髓上清液中细胞因子IFN-γ水平明显低于对照组,患者治疗骨髓达CR后骨髓上清液中细胞因子IFN-γ水平升高。（3）树突状细胞培养及CD4+T细胞:流式细胞仪检测结果为树突状细胞表达CD11c,不表达CD80和CD14,少量表达CD83和CD86,DCs诱导转化率在>90%。利用CD4+MACS磁珠分选骨髓中CD4+T细胞的分离纯度>90%。（4）树突状细胞NLRP3炎症小体活化及抑制:RT-PCR检测实验组较对照组树突状细胞NLRP3炎症小体激活后caspase-1和IL-1β的表达增加,抑制组caspase-1和IL-1β的表达较实验组有降低趋势。ELISA检测实验组与对照组相比BMDCs上清液中的IL-1β水平升高,而MCC950抑制组IL-1β分泌明显较实验组降低。此外,western blot结果表明,IL-1β的活化形式IL-1β（p17）蛋白在实验组树突状细胞NLRP3炎症小体活化后表达增加。（5）树突状细胞NLRP3炎症小体对CD4+T细胞分化影响:流式细胞术检测结果显示:实验组NLRP3炎症小体激活的BMDCs促进CD4+T细胞向Th1细胞分化,而NLRP3炎症小体被MCC950抑制后促进Th1细胞分化的作用明显降低。Th2、Th17和Treg细胞比例无明显变化。（6）细胞因子检测:多细胞因子阵列检测树突状细胞培养上清液,发现实验组NLRP3炎症小体激活后上清液中的IL-1β显着升高,MCC950抑制组较实验组明显降低。用ELISA方法检测验证了 12例AML患者树突状细胞NLRP3炎症小体激活后上清中的IL-1β水平升高,而MCC950抑制后降低。（7）IL-1β对Th1细胞分化的影响:在对照组和抑制组加入重组人IL-1β细胞因子后Th1细胞比例升高,IL-1β可以促进CD4+T细胞向Th1细胞分化,并且IL-1β可逆转抑制组MCC950的抑制作用,在实验组加入人IL-1β中和抗体后Th1细胞比例降低,IL-1β中和抗体可抑制NLRP3炎症小体激活的DCs促进CD4+T细胞向Th1细胞分化的作用。（8）树突状细胞NLRP3炎症小体促进Th1细胞分化的方式:树突状细胞和CD4+T细胞无论是接触共培养还是小室分离共培养,DCs NLRP3炎症小体激活促进CD4+T细胞向Th1分化的作用是一样的,而且共培养上清液中细胞因子IFN-y和IL-1β的水平没有显着差异。（9）IL-1β影响Th1细胞分化的机制:RT-PCR检测CD4+T细胞IFN-γ、IFN-γ受体和STAT1表达在IL-1β和IL-12联合组明显升高,IL-12单独刺激或PBS组升高不明显。（10）树突状细胞NLRP3炎症小体在体内对Th1细胞分化的影响:WT小鼠树突状细胞NLRP3炎症小体激活促进WT小鼠骨髓或脾脏中Th1细胞的分化,Th1细胞比例高于对照组,而抑制组MCC950可抑制这种作用。但是Nlrp3-/-小鼠树突状细胞无论在实验组还是对照组均不能促进WT小鼠中Th1细胞分化。（11）IL-1β对小鼠Th1细胞分化的影响:将鼠IL-1β中和抗体注射到实验组小鼠体内,与未注射IL-1β中和抗体的实验组小鼠相比Th1细胞比例明显降低。研究结论1.AML初诊患者骨髓Th1细胞比例及IFN-γ水平降低,且Th1细胞比例降低与白细胞计数呈负相关,提示AML骨髓微环境中存在免疫失衡。2.树突状细胞NLRP3炎症小体激活促进的Th1细胞分化需要一个有功能的炎症小体,该结果为纠正AML骨髓微环境的免疫失衡提供新的研究方向。3.树突状细胞NLRP3炎症小体激活不依赖于细胞接触通过IL-1β分泌的方式促进Th1细胞分化,表明IL-1β是促进Th细胞分化的关键分子,可以通过干预IL-1β提高骨髓微环境的免疫。第二部分树突状细胞NLRP3炎症小体在急性髓系白血病抗白血病作用及机制的研究研究背景急性髓系白血病（AML）是一种侵袭性致命的血液系统恶性肿瘤,为成人急性白血病最常见的一种,占儿童白血病的20%。AML标准诱导化疗方案可使50%到75%的AML患者得到缓解,由于化疗耐药性克隆的出现,标准疗法通常不足以维持持久缓解,细胞遗传学不良的AML即使采用积极的化疗效果也较差,大多数患者会复发并死于自身疾病,其5年生存率约为25%。但是年龄大于65岁的患者其预后并没有得到改善,最新报道其生存率低于10%,因此,迫切需要新的治疗方案,正是在这种情况下,免疫疗法在近年来脱颖而出。近年来基于免疫的治疗方法已经使某些晚期癌症患者的生存率得到意想不到的提高。免疫疗法治疗的前提是肿瘤会抑制免疫系统,肿瘤微环境中的T细胞功能受到抑制,并且可能与AML发病有关,而且新诊断的AML患者骨髓微环境中的T细胞浸润与总生存期之间存在显着关联。使用AML/树突状细胞融合的疫苗接种可引起白血病特异性T细胞的扩增,预防疾病复发,因此新型的个性化树突状细胞疫苗是一种新的治疗方法,产生防止疾病复发的免疫记忆,具有治疗AML的潜力。通过DCs刺激可以使T细胞产生免疫应答,并在针对肿瘤杀伤的免疫应答反应中起重要作用。活化的T细胞能够识别AML细胞上表达的抗原,并随后介导对AML细胞杀伤作用。近年来,DCs作为AML免疫治疗的工具引起了人们的极大兴趣,通过DCs免疫刺激自体T细胞是一种创新策略,可减少或消除残留的白血病细胞来预防AML复发,因此基于DCs的免疫疗法可能在根除AML患者中残留白血病细胞方面更加成功。AML患者在接受相当数量的DCs治疗后,可以获得非特异性和抗原特异性的免疫效应。NLRP3炎症小体在癌症发生和发展中的作用具有争议性。NLRP3炎症小体及其成分促进了恶性肿瘤如黑素瘤、肺癌、乳腺癌和多发性骨髓瘤的生长、增殖、侵袭和转移。但是,在NLRP3基因敲除动物模式中使用氧化偶氮甲烷（AOM）及葡聚糖硫酸钠（DSS）（AOM/DSS）诱发结肠癌的实验研究中,NLRP3炎症小体对癌变具有保护作用。NLRP3炎症小体在不同肿瘤中的功能也突出了炎症小体的治疗潜力。前期我们研究结果显示AML患者骨髓中Th1细胞比例降低,存在骨髓微环境免疫抑制,树突状细胞炎症小体激活可以促进CD4+T细胞向Th1细胞分化,Th1细胞效应细胞因子为IFN-γ,IFN-γ具有抗肿瘤免疫的作用,然而树突状细胞NLRP3炎症小体激活促进AML骨髓Th1细胞分化对白血病细胞是否具有杀伤作用及其机制尚待研究。研究目的本研究旨在探究树突状细胞NLRP3炎症小体激活促进AML骨髓Th1细胞分化是否对白血病细胞增殖和凋亡有影响;研究影响AML白血病细胞增殖和凋亡的关键分子,通过干预关键分子分析其对白血病细胞增殖和凋亡影响的机制,从而明确NLRP3炎症小体参与AML骨髓免疫促进Th1亚群分化抗白血病的作用机制。研究方法（1）树突状细胞NLRP3炎症小体对白血病细胞增殖和凋亡的影响:将AML患者BMDCs分成三组:①NLRP3炎症小体激活实验组（LA）:DCs先用脂多糖LPS预处理6小时,再加ATP作用45分钟,激活NLRP3炎症小体;②抑制组（MLA）:LPS处理前,预先加入炎症小体抑制剂MCC950作用1小时,抑制NLRP3炎症小体活性;③对照组:加入对应量的无菌PBS。用小室将CD4+T细胞与三组BMDCs共培养,共培养后的CD4+T细胞再与THP-1或U937 AML细胞系共培养,流式细胞术检测THP-1及U937白血病细胞的凋亡,用CCK-8检测细胞增殖试剂盒检测白血病细胞的增殖。（2）影响白血病细胞增殖和凋亡的机制:ELISA方法检测共培养细胞上清液中的Th1细胞主要效应细胞因子IFN-γ水平。在实验组共培养体系中加入人IFN-γ中和抗体,流式细胞术检测THP-1及U937白血病细胞的凋亡,CCK-8检测细胞增殖试剂盒检测白血病细胞的增殖,探讨细胞因子IFN-γ对影响白血病细胞的凋亡和增殖的影响。（3）树突状细胞NLRP3炎症小体对AML白血病小鼠的影响:体外培养WT或Nlrp3-/-C57BL/6J小鼠的树突状细胞,将WT小鼠树突状细胞分为3组:①激活NLRP3炎症小体实验组:LPS和ATP处理;②抑制NLRP3炎症小体抑制组:先用NLRP3炎症小体抑制剂MCC950作用1小时后LPS和ATP处理;③对照组:加入对应量的无菌PBS。Nlrp3-/-小鼠的树突状细胞分为实验组和对照组。先通过WT小鼠尾静脉注射了 MLL-AF9-GFP白血病细胞,3天后将各组BMDCs通过尾静脉注入小鼠体内,7天后检测各组白血病小鼠脾脏和肝脏体积和重量,流式细胞术检测小鼠骨髓、脾脏及肝脏中MLL-AF9-GFP白血病细胞比例。（4）IFN-y对白血病小鼠体内白血病细胞的影响:将MLL-AF9-GFP白血病细胞通过WT小鼠尾静脉注射入小鼠体内,3天后将对照组和实验组WT/BMDCs通过尾静脉注入小鼠体内,将鼠IFN-γ中和抗体在第4、6和8天注射入部分实验组小鼠体内,第10天检测各组白血病小鼠脾脏和肝脏体积和重量,流式细胞术检测小鼠脾脏、肝脏及骨髓中MLL-AF9-GFP白血病细胞比例。（5）IL-1β对白血病小鼠体内白血病细胞的影响:将MLL-AF9-GFP白血病细胞通过WT小鼠尾静脉注射入小鼠体内,3天后将对照组和实验组WT/BMDCs通过尾静脉注入小鼠体内,将鼠IL-1β中和抗体连续4天注射入部分实验组小鼠体内,第10天检测各组白血病小鼠脾脏和肝脏体积和重量,流式细胞术检测小鼠脾脏、肝脏及骨髓中MLL-AF9-GFP白血病细胞比例。研究结果（1）树突状细胞NLRP3炎症小体对白血病细胞增殖和凋亡的影响:与对照组相比,实验组CD4+T细胞与THP-1或U937白血病细胞共培养后白血病细胞凋亡明显增加,而抑制组MCC950会降低这种促凋亡作用。与对照组或抑制组的BMDCs组共培养的CD4+T细胞相比,实验组CD4+T细胞使THP-1或U937白血病细胞的增殖明显降低。（2）影响白血病细胞增殖和凋亡的机制:ELISA检测实验组NLRP3炎症小体激活的BMDCs与CD4+T细胞共培养上清液中的细胞因子IFN-γ水平明显高于对照组,而抑制组IFN-γ的水平显着降低。在实验组共培养体系中加入人IFN-γ中和抗体后THP-1或U937白血病细胞的凋亡显着降低。同样,在实验组共培养体系中加入IFN-γ中和抗体后THP-1或U937白血病细胞的增殖较未加入IFN-γ的实验组明显增加。（3）树突状细胞NLRP3炎症小体对白血病小鼠肿瘤影响:与对照相比,注射NLRP3炎症小体激活WT/BMDCs的实验组白血病小鼠的脾脏和肝脏的体积和重量显着降低,且骨髓、脾脏和肝脏中的MLL-AF9-GFP白血病细胞比例低于对照组,而MCC950可逆转WT/BMDCs NLRP3炎症小体激活抑制白血病细胞增殖的这种作用。但是Nlrp3-/-小鼠的实验组BMDCs NLRP3炎症小体激活后注射入白血病小鼠体内后,未观察到对白血病小鼠白血病细胞的抑制作用。（4）IFN-γ对白血病小鼠体内白血病细胞的影响:与未注射鼠IFN-γ中和抗体的实验组小鼠相比,注射鼠IFN-γ中和抗体的实验组小鼠的脾脏体积或肝脏重量和体积显着增加,小鼠中骨髓、脾脏或肝脏中的MLL-AF9-GFP白血病细胞比例显着增加。（5）IL-1β对白血病小鼠体内白血病细胞的影响:实验组小鼠注射鼠IL-1β中和抗体后,与未注射鼠IL-1β中和抗体的实验组小鼠相比白血病小鼠的脾脏和肝脏的体积和重量显着增加,且骨髓、脾脏和肝脏中的MLL-AF9-GFP白血病细胞比例显着增加。研究结论1.NLRP3炎症小体激活的BMDCs促进Th1细胞分化有抗白血病的作用,为AML的免疫治疗提供新的研究方向。2.IFN-γ是BMDCs NLRP3炎症小体激活抗白血病作用重要的效应分子。3.NLRP3炎症小体通过IL-1β/Th1/IFN-γ参与抗白血病作用,调节树突状细胞NLRP3炎症小体和IL-1β有望成为AML治疗新的靶点。第三部分免疫相关基因单核苷酸多态性在急性髓系白血病中的研究研究背景急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）是髓系原始幼稚细胞在骨髓内大量增殖导致正常造血功能受损,并伴有遗传学异常,是成人发病率最高的血液系统恶性肿瘤。恶性肿瘤存在免疫失衡,AML患者骨髓存在免疫系统损伤,免疫系统最重要的组成部分T细胞存在数量和功能上的缺陷。免疫T细胞是至关重要的抗肿瘤免疫细胞,通过释放细胞因子和细胞毒性物质消灭AML白血病细胞。同时,AML白血病细胞也会影响T细胞的分化和增殖,并通过释放抑制性细胞因子等方式发挥免疫抑制作用。T辅助（Th）细胞在T细胞免疫系统网络中起着举足轻重的作用,Th1/Th2及Th1 7/Treg失衡与实体瘤的发病机理以及血液系统恶性肿瘤有关,但是Th细胞在AML骨髓微环境中研究不多。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）是最常见的遗传变异类型,其功能在生物学的许多领域被发现,特别是在人类各种疾病方面的研究最多。炎症相关的SNPs在AML患者中的作用已已有相关研究,并且发现SNPs与化疗敏感性、疾病预后和生存时间相关的SNPs。例如IL-1β（rs16944）GA基因型与AML遗传学预后良好相关,而含有IL-18（rs1946518）GT基因型的AML患者生存率较差。Zhu等报道IL-17F的G单突变体和GG突变纯合子与AML易感性有关。TNF-α、IL-10、TGF-β1等功能性变异可能与AML的发病机制有显着相关性。我们在前期研究中发现AML骨髓中Th亚群失衡及其相关细胞因子分泌紊乱,并发现失衡的Th亚群与紊乱的细胞因子可能共同参与AML的发生和发展。因此,我们进一步研究免疫相关基因（包括促炎或抗炎细胞因子以及T细胞亚群的关键调节因子）的SNPs与AML的关系,探索SNPs在AML发病过程中涉及一些尚未发现的功能及病理机制,寻找新的治疗AML重要的免疫靶点。研究目的本研究旨在探索免疫相关基因的单核苷酸多态性与AML易感性、预后危险分层和生存分析之间的关系;分析免疫相关基因的单核苷酸多态性不同基因型与AML临床特征之间的关系;结合相关基因mRNA表达和功能分析,进一步确定了潜在的信号通路,寻找AML新的免疫治疗靶点。研究方法标本收集:本研究收集来自山东大学齐鲁医院的269例初诊AML患者及200例健康对照标本,分离单个核细胞并提取DNA及RNA。收集整理患者临床相关资料。（1）将AML患者及健康对照标本进行质谱SNPs分型信息采集及分析。Sequenom MassARRAY平台对21个候选SNPs进行了引物延伸质谱的基因分型,得出269例AML病例和200例健康对照的基因分型准确性结果。本研究利用Hardy-Weinberg平衡和微小等位基因频率（MAF）对21个候选SNPs的适用性进行了评价。（2）实时荧光定量PCR检测AML骨髓单个核细胞中IL-12 mRNA的表达。研究结果:（1）免疫相关基因SNPs与AML易感性的关系:IL4（rs2070874、rs2243250）和IL22 rs1179251在显性模式下基因型频率与AML易感性显着相关;单因素logistic回归分析显示,调整年龄和性别后,在显性模式下只有IL4（rs2243250）与AML的易感性显着相关,但是经过Bonferroni多重校正后,没有SNPs与AML的易感性相关。（2）免疫相关基因SNPs与骨髓原始幼稚细胞的关系:在隐性模式下IL2（rs2069762）基因型频率在骨髓高幼稚细胞（≥42%）和低幼稚细胞（<42%）组间差异有统计学意义。（3）免疫相关基因SNPs与外周血白细胞的关系:IL22（rs2227491）在显性、共显性和等位基因模式下的基因型频率与白细胞计数显着相关;另外IL4（rs2243250）等位基因频率也与白细胞计数显着相关;rs2227491在显性和等位模式下的基因型频率经Bonferroni多重校正后与白细胞计数也显着相关;在调整年龄和性别后,IL22（rs2227491）在显性模式下AML患者携带TT基因型发生高白细胞计数的风险是TC/CC基因型携带患者的4.2倍,IL22 rs2227491等位基因的分布也有统计学差异。（4）免疫相关基因SNPs与血红蛋白、血小板及乳酸脱氢酶的关系:在共显性和显性模式下STAT6（rs324011）和IL12A（rs2243115）的基因型频率在高血红蛋白（≥80g/L）和低血红蛋白（<80/L）间差异有统计学意义;在共显性和隐性模式下IFN-γ（rs2069718）等位基因频率和基因型频率与血红蛋白高低也显着相关;在调整年龄和性别后,IL6R（rs2228145）基因型频率仅在显性模式下与高乳酸脱氢酶（LDH）显着相关性,但是在Bonferroni多重校正后,SNPs与血红蛋白、LDH无显着相关性。未发现SNPs与血小板高低相关。（5）免疫相关基因SNPs与WHO分型重现性遗传学异常的关系:STAT5B（rs6503691）在共显性和隐性模式下与AML重现性遗传学异常（RGAs）显着相关,即使Bonferroni多重校正后,rs6503691与重现性遗传学异常之间的相关性也具有统计学意义;调整年龄和性别后进行单变量逻辑回归分析,rs6503691 CC基因型（共显性模式）或CC/CT基因型（隐性模式）被作为参考时,TT或CT基因型（共显性模式）和TT（隐性模式）与重现性遗传学异常显着相关。（6）免疫相关基因SNPs与AML危险度分层的关系:在共显性、显性和隐性模式下TGF-β1（rs1800469）与AML危险度分层显着相关,但是经多元回归调整年龄和性别因素后rs1800469在共显性、显性和隐性模式下差异无统计学意义。（7）AML缓解组和难治组总生存时间（OS）:对191名化疗诱导治疗患者的治疗效果进行OS的单因素分析,结果显示完全缓解（CR）组和难治组之间的结果有显着差异,中位OS分别为39个月和18个月。（8）免疫相关基因SNPs与AML非M3诱导化疗敏感性的关系:在共显性和隐性模式下STAT1（rs3771300）的等位基因频率和基因型频率在治疗敏感组、中等组和无效难治组间差异有统计学意义;在共显性模式下GATA3（rs3824662）等位基因频率和基因型频率在三组间均有显着相关性,但是经过Bonferroni多重校正后无SNPs与诱导化疗敏感性相关。（9）免疫相关基因SNPs与AML生存的关系:在显性和共显性模式下STAT3（rs744166）基因型频率与AML患者生存期显着相关;IL12A（rs6887695）在等位基因、隐性和共显性模式下的与AML患者的生存期显着相关;在Bonferroni多重校正后IL12A（rs6887695）只有在共显性和隐性模式下的与AML患者的生存显着相关;在IL12A（rs6887695）共显性模式下AML患者携带CC基因型的比GG基因型的携带患者OS降低22个月;IL12A（rs6887695）在GC/CC下的生存期（22.0个月）明显短于隐性模式下GG（33.0 个月）。（10）rs6887695与IL12 mRNA表达水平的关系:在共显性模式下,CC基因型患者IL12mRNA表达水平高于GG基因型患者;与GG基因型相比,CG杂合子患者的IL12水平也升高;在隐性模式下,与CG/GG基因型相比,GG基因型的样本中IL12表达显着降低;而在显性模式下,CC/CG基因型和GG基因型的IL12 mRNA表达无差异。研究结论1.IL22（rs2227491）与白细胞计数显着相关,提示IL22与AML预后有相关性。2.STAT5B（rs6503691）与AML患者重现性遗传学异常密切相关,提示STAT5B与AML预后关。3.IL12A（rs6887695）与 AML 患者的 IL12 mRNA 表达及 OS 相关,对 AML的预后有独立的负面影响。

杨露露^[4]（2020）在《初步探讨PDGF家族及其受体基因在急性白血病患者骨髓单个核细胞中的mRNA表达水平及其临床意义》文中提出第一部分 采用RT-qPCR方法检测六种PDGF家族及其受体基因在急性白血病中的mRNA表达及其临床意义[目的]通过RT-qPCR方法检测PDGF家族及受体基因PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D及其受体PDGFR-A、PDGFR-B在急性白血病患者骨髓单个核细胞（Bone Marrow mononuclear cells,BMMCs）中的mRNA水平表达及其临床意义。[方法]收集2018年03月至2019年03月就诊于苏州大学附属第一医院的91例初诊急性白血病患者及19例的正常供体的骨髓样本,采用Ficoll梯度离心方法提取骨髓单个核细胞中的总RNA,并行逆转录,实时荧光定量PCR方法检测急性白血病患者骨髓单个核细胞中PDGF家族及受体基因PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D及其受体PDGFR-A、PDGFR-B的mRNA表达水平的差异。结合患者性别、年龄,初诊时血常规、骨髓FAB分型、染色体核型、融合基因、基因突变结果,以及WT1、EVI1定量水平,分析6种PDGF相关基因的表达水平与上述临床特征的相关性。[结果]1、91例初治急性白血病包括急性髓系白血病（AML）63例,急性淋巴细胞白血病（ALL）24例,急性混合细胞白血病（HAL）4例。AML组中M0 1例、M1 6例、M2 34 例、M3 7 例、M4 14 例、M5 1 例;ALL 组中 B-ALL 20 例（Ph+B-ALL 8 例,Ph-B-ALL 10例,Ph-like B-ALL2例）,T淋系ALL4例。56例AML患者染色体核型检测结果示（不包括M3）:单体核型1例,11q23 1例,正常核型33例,del（9）2例,+83例,+21 3例,t（8;21）5例,inv16 1例,其他异常7例。基因突变检测结果示:CEBPα双突变22例,突变率 39.39%;FLT3-ITD+14例,突变率 25.00%;FLT3-TKD+5例,突变率 8.93%;NRAS+11 例,突变率 19.64%;NPM1+10 例,突变率 17.86%;WT1+10 例,突变率 17.86%;DNMT3A+9 例,突变率 16.07%;TET2+6 例,突变率10.71%;其中同时合并NPM1+FLT3-ITD+7例;多重PCR检测结果:AML1-ETO融合基因阳性6例,CBF β-MYH11融合基因阳性4例,MLL相关融合基因阳性5例,其他融合基因阳性2例,融合基因阴性39例,其中WT1融合基因大于150copies 50例,EVI1融合基因大于150copies 6例。按照2017年NCCN急性髓系白血病治疗指南将AML（未纳入M3）分为预后不良组20例,预后中等组19例,预后良好组17例。20例B-ALL患者染色体核型检测结果示:t（9;22）8例,正常核型7例,11q23 2例,del（9）1例,其他异常核型2例;基因突变结果:TP53+3例,ETV6+3例,FLT3-ITD+2 例,FLT3-TKD+1 例,PTPN+2 例,CSMD1+2 例;多重 PCR检测结果:BCR-ABL融合基因阳性8例,E2A-PBX融合基因阳性3例,MLL相关融合基因阳性2例,其中WT1融合基因大于150copies 13例,EVI1融合基因大于150copies 3例。根据2016版中国成人急性淋巴细胞白血病诊断与治疗指南将20例B-ALL患者均列为高危组。2、与健康对照组相比,PDGF-A基因mRNA的表达量在急性白血病组升高（P<0.05）,同时ALL组较AML组表达显着增高（P<0.05）;PDGF-B基因的表达水平在患病组与健康组之间无明显差异（P>0.05）;PDGF-C基因mRNA在ALL组表达明显降低（P<0.001）;PDGF-D基因在AML组表达明显增高（P<0.05）;受体PDGFR-A基因mRNA的表达量在急性白血病组升高（P<0.05）,ALL组与AML组之间表达无差异（P>0.05）;PDGFR-B基因mRNA在ALL组表达升高（P<0.05）。在AML组中,PDGF-A、PDGF-D 和 PDGFR-A 高表达于非 M3 的 AML（P<0.05）。在 ALL 组中,PDGF-A、PDGF-C、受体 PDGFR-A、PDGFR-B等4种基因 mRNA 在 B-ALL 组和 T-ALL组表达无明显差异（P>0.05）。非M3的AML患者中,PDGF-A基因表达水平与PDGFR-A表达水平呈正相关（r=0.707,P<0.0001）;在B-ALL中PDGF-A和PDGF-C基因的表达与受体PDGFR-A和PDGFR-B基因表达没有明显相关性（P>0.05）。3、分析了 56例非M3型AML患者PDGF-A、PDGF-D和PDGFR-A基因表达水平与临床特征的相关性,我们发现PDGF-D基因mRNA高表达于染色体核型正常的AML患者中;而33例染色体核型正常的AML患者中,PDGF-D基因mRNA高表达于NPM1+组（P=0.008）,低表达于 CEBPα+组（P=0.003）。PDGF-A、PDGF-D 和 PDGFR-A 基因的mRNA表达水平与患者不同性别、年龄、FAB分型、低中高危险分层、初诊时血细胞计数水平、骨髓原始细胞计数水平、融合基因类型、WT1定量、EVI1定量水平及其他基因突变类型等临床因素无明显相关（P>0.05）。分析免疫分型表达与PDGFA、PDGF-D和PDGFR-A基因mRNA表达的相关性,在14例M4患者中,CD34阳性组的PDGFR-A基因mRNA表达水平较阴性组明显升高（P=0.009）,PDGF-A、PDGF-D基因mRNA表达情况与免疫表型无明显相关（P>0.05）。4、我们分析了 20 例 B-ALL 患者的 PDGF-A、PDGF-C、PDGFR-A 和 PDGFR-B基因mRNA水平表达与临床特征的相关性,发现PDGFR-B基因mRNA表达量与初诊时外周血白细胞计数呈正相关（r=0.668,P=0.001）;Ph染色体阳性B-ALL患者的PDGF-A和PDGFR-A基因的mRNA表达水平明显高于Ph染色体阴性的B-ALL患者。PDGF-A、PDGF-C、PDGFR-A和PDGFR-B基因的mRNA表达水平与性别、年龄、初诊时外周血红蛋白计数水平,血小板计数水平、骨髓原始细胞计数水平,融合基因类型、WT1定量和EVI1定量水平及基因突变类型等临床因素无明显相关（P>0.05）。在12例Ph染色体阴性B-ALL患者中,PDGF-C低表达于CD7阳性组（P=0.0201）。[结论]:1.急性白血病 BMMCs 中 PDGF-A,PDGF-D 和 PDGFR-A 基因 mRNA 在 AML患者中高表达,而PDGF-A,PDGFR-A和PDGFR-B基因mRNA在B-ALL中高表达,PDGF-C在B-ALL呈现低水平表达。2.在AML中PDGF-D基因mRNA高表达于正常染色体患者,并与NPM1和CEBPα基因突变存在一定的相关性,而在B-ALL中,PDGF-A和PDGFR-A基因的mRNA表达可能与Ph染色体存在一定相关性。第二部分 PDGF家族及其受体基因表达对急性白血病患者预后的影响[目的]分析急性白血病患者BMMCs中PDGF家族及其受体基因mRNA表达对预后的影响。[方法]对76例急性白血病患者进行随访,所有患者均接受1-2疗程诱导化疗和2-4疗程的巩固化疗。结合患者临床基本特征及骨髓形态、免疫分型、染色体核型、融合基因结果、基因突变等临床资料,采用卡方检验（Chi-sqaure test）和曼-惠特尼U检验（Mann-Whitney U test）等统计方法分析相关基因的mRNA表达差异和临床因素对患者化疗敏感率的影响,并用Logistics多因素回归找出影响疗效的独立因素。采用Kaplan-Meier分析影响患者总体生存率（OS）,无病进展生存率（PFS）,累积复发率（CRR）的因素,采用对数秩检验（Log-rank test）比较差异的显着性。采用Cox回归多因素分析找出影响预后的独立危险因素。[结果]1、76例患者随访终点为2019年12月9日,中位随访时间14（1～17）月,持续缓解49例,复发22例,死亡18例（包括复发后死亡13例）,总体生存率（OS）为72.20%,无病进展生存率（PFS）为60.96%,累积复发率（CRR）为39.04%。56例AML患者均接受了 1-2疗程的诱导化疗方案,1疗程诱导化疗后达CR41例,PR10例,NR 5例,接受2疗程诱导化疗获得CR 13例;至随访终点,持续缓解30例,复发15例,死亡13例（包括复发后死亡10例）,中位生存时间14个月,1年OS率为80.34%,1年PFS率为63.46%,1年累积复发率为29.3%。B-ALL组1疗程诱导化疗达CR 15例,NR3例,PR2例,5例NR/PR患者经2疗程诱导化疗达CR4例,PR1例。至随访终点时,持续缓解13例,复发7例,死亡5例（均为复发后死亡）。中位生存时间12个月,1年OS率为75%,1年PFS率为65%,1年累积复发率为35%。2、在AML患者（不包括M3）中,我们分析了 PDGF-A、PDGF-D、PDGFR-A基因表达水平和患者临床特征对化疗敏感率的影响,发现PDGF-A、PDGF-D、PDGFR-A的基因表达量在完全缓解组（CR）与非完全缓解组（PR+NR）组之间无明显差异（P>0.05）,同时临床因素对患者疗效无明显影响（P>0.05）。采用Kaplan-Meier行单因素生存分析,PDGF-A、PDGF-D、PDGFR-A基因mRNA表达水平对患者OS、PFS、CRR无明显影响（P>0.05）,将单因素分析中可能影响患者OS、PFS和CRR的临床因素纳入Cox多因素回归发现免疫表型CD11b+、融合基因WT1阳性可能是影响AML患者OS的独立危险因素（P<0.05）;融合基因WT1阳性可能是影响AML患者PFS独立危险因素（P=0.029）。结合第一部分相关临床因素进行生存分析,PDGF-D基因表达水平对染色体核型正常患者的OS、PFS、CRR无影响（P>0.05）。33例染色体核型正常的患者中,NPM1+AML患者的OS在PDGF-D基因mRNA高表达组显着高于低表达组（P=0.0047）、而PFS和CRR无明显差异（P>0.05）,NPM1-AML患者中PDGF-D基因水平对其OS、PFS、CRR无明显影响（P>0.05）。在CEBPα-AML中,患者OS在PDGF-D基因高表达组显着高于低表达组（P=0.003）、而PFS、CRR无明显差异（P>0.05）,CEBPα+组PDGF-D基因高表达组与低表达组患者的OS、PFS、CRR无明显差异（P>0.05）。3、我们发现 B-ALL 患者的 PDGF-A、PDGF-C、PDGFR-A、PDGFR-B 等基因mRNA表达水平和各临床因素对其首次诱导化疗敏感率无明显影响（P>0.05）。Kaplan-Meier 进行生存分析发现 PDGF-A、PDGF-C、PDGFR-A、PDGFR-B 基因表达水平对患者的OS、PFS、CRR无明显影响（P>0.05）,同时Cox多因素分析发现临床因素对患者总生存、无病进展生存以及复发无明显影响（P>0.05）。结合第一部分的临床因素进行生存分析,PDGF-A、PDGFR-A基因表达水平对Ph+B-ALL患者的OS、PFS、CRR的影响无明显差异（P>0.05）。PDGFR-B基因表达对高白细胞患者的 OS、PFS、CRR 无明显影响（P>0.05）。[结论]染色体核型正常的AML患者的PDGF-D基因表达可能进一步影响NPM1+AML和CEBPα-AML患者的总生存。

聂鼎睿^[5]（2020）在《miR-204靶向调控HGF/c-MET通路在急性髓系白血病中的作用和机制的研究》文中进行了进一步梳理研究背景急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia）是一种以造血干细胞和髓系祖细胞异常增殖和分化为特点的恶性血液学疾病,可导致造血系统紊乱,抑制红、巨核系正常造血。该病主要表现为感染、出血、贫血并且可浸润皮肤、黏膜、淋巴结、脑脊液、脾脏等重要脏器或组织,起病急骤,病情恶化迅速,自然病程短。近年来,由于对该病的病理生理学过程有了更深刻的认识,使得新药大量涌现,造血干细胞移植技术不断进步及支持疗法的不断完善,显着提高了该病的缓解率及治愈率。但是,该病总生存率仍不足50%,这主要是由于患者原发耐药或者疾病复发最终演变为难治性白血病。MircroRNAs是在进化过程中高度保守的一类非编码RNA,多数起源于内含子,长度约为18-22nt。这些非编码RNA可以结合靶基因的mRNA引起后者降解或者翻译抑制,因此在基因转录后调控发挥着重要作用。在正常生理代谢过程中,这种调控是细胞增殖、分化、凋亡及维持细胞自稳态等细胞生命活动过程中的重要途径之一;与此同时,近几年的报道中发现microRNAs在恶性演变过程不但具有独特的表达模式,而且发挥着癌基因或抑癌基因的效应,因此也是影响肿瘤命运的关键要素之一。miR-204作为其中的一员,位于人类9号染色体q21瞬时受体电位离子通道蛋白 3（Transient receptor potential ion channel proteins-3）基因的第六内含子中。在多数肿瘤的发生中,该microRNA主要发挥抗肿瘤效应。已研究发现低表达miR-204在AML患者往往与较差的预后密切相关。由此,miR-204可作为AML独立的预后因素之一。另外,miR-204还可以靶向作用于BIRC6诱导AML细胞的凋亡且可以增强化疗敏感性。因此,提高miR-204的表达水平可能为AML患者带来新的福音。人类肝细胞因子（hepatocyte growth factor）是一种双链糖蛋白,可调控其靶细胞增殖、生存、移动及形态转变,主要行使细胞更新及组织修复等功能,编码该细胞因子的基因位于7号染色体的长臂（7q2111）,其在细胞恶性演变的过程中发挥重要作用。已有报道在胃癌、肝癌、结肠癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等实体瘤发现过度表达的HGF/c-MET通路并且与肿瘤进展及预后密切相关;在AML中,HGF可作用于PI3/AKT、MAPK/ERK信号通路促进AML细胞增殖、侵袭及迁移。因此,miR-204和HGF均与AML存在密切联系。然而,二者在AML中的关系及潜在分子调控机制仍需进一步明确。目的探讨miR-204与HGF在AML中的作用、关系及潜在的分子生物学机制,为AML的靶向治疗提供新的实验室依据。方法应用RT-qPCR技术测定AML患者和正常人骨髓单个核细胞及AML细胞株中miR-204和HGF的表达水平并进行相关性分析。应用western blot技术测定AML细胞株中HGF、c-MET、p-MET、c-myc等与HCF/c-MET通路相关的蛋白水平;Over-expression 及 Knock-dowm 技术调节 miR-204 及 HGF 在 AML细胞株中的表达水平;应用在线生物信息学预测软件对二者关系进行初步预测,构建HGF3’UTR野生型及突变型荧光素酶报告质粒,通过双荧光素酶报告基因实验检测miR-204上调后荧光素酶活性的变化;MMT法测定细胞增殖能力、Annexin V/PI流式细胞技术测定细胞凋亡水平、Transwell法测定细胞的迁移及侵袭的能力。应用GraphPad8、SPSS 23.0、ImageJ将所得数据进行统计学分析。以Student’s t-test及单因素方差分析的方法分析两组与两组以上的差异,应用pearson法进行相关性分析,p值小于0.05认为差异具有统计学意义。结果1.miR-204与HGF在初治AML患者中的表达情况:1.1 miR-204在初治AML患者中的中位相对表达量（1.16643）显着低于正常对照组（2.231967）（p<0.05）。1.2 HGF在初治AML患者中的中位相对表达（1.712266）显着高于正常对照组（1.0285）（p<0.05）。1.3应用Pearson法将初治AML患者骨髓单个核细胞中miR-204与HGF的表达水平进行相关性分析,发现二者的相对表达量成负相关关系（r=-0.3666,p<0.05）。2.miR-204与HGF在AML细胞系中的表达水平2.1相比于人骨髓基质细胞HS-5,miR-204在Kasumi-1及HL-60细胞株中表达量均显着降低（p<0.05）。2.2相比于人骨髓基质细胞HS-5,HGF在Kasumi-1及HL-60细胞株中基因及蛋白水平的表达量均显着增高（p<0.05）。3.miR-204及HGF对AML细胞的生物学效应3.1实时荧光定量PCR结果证明miR-204 mimic可显着上调AML细胞miR-204的相对表达量;sh-HGF干扰载体可抑制HGF在AML细胞的基因及蛋白水平的表达。3.2 MMT法检测结果所示,miR-204上调后可抑制kasumi-1、HL-60的增殖活性,培养72h后抑制率分别为为44.7%和40.8%;下调HGF后可弱化AML细胞的增殖活性影响AML细胞生存,培养72h后生存率分别为53.5%和57.4%。3.3 Annexin V/PI双染法预染细胞并用流式细胞术测定AML细胞的凋亡水平,结果所示上调miR-204或下调HGF均可促进AML细胞的凋亡。3.4 Transwell法测定AML细胞迁移及侵袭能力的结果证实,上调miR-204或下调HGF可削弱Kasumi-1及HL-60细胞迁移和侵袭的能力。4.miR-204与HGF靶向关系的验证4.1 Western blot结果证明:在AML细胞中上调miR-204后,HGF蛋白表达水平显着降低,而应用miR-204 inhibitor下调miR-204可提高HGF蛋白的表达量。4.2应用在线生物信息学预测软件初步预测miR-204与HGF具有靶向关系,成功构建HGF 3’UTR端野生型及突变型荧光素酶报告基因质粒并于人胚肾293T细胞中进行双荧光素酶报告基因试验,结果证实HGF 3’UTR端存在与miR-204结合的预测靶点。5.miR-204靶向HGF对AML细胞生物行为的影响5.1 MMT法检测结果证实,miR-204可靶向作用于HGF抑制AML细胞的增殖活性。5.2 AnnexinV/PI双染法预染细胞并用流式细胞术测定结果说明,miR-204可靶向作用于HGF促进AML细胞凋亡。5.3 Transwell法结果证实,miR-204可靶向作用于HGF抑制AML细胞的迁移和侵袭的能力。6.在AML细胞中,miR-204靶向作用于HGF的分子生物学机制:Western blot结果说明miR-204靶向下调HGF的表达,但并不影响c-MET受体的表达水平,而是抑制c-MET受体的磷酸化水平及下游蛋白CyclinD1、c-myc、Bcl-2、Bax、MMP2和MMP9的表达,并且促进促凋亡蛋白BAX的表达;而在此基础上上调HGF后可恢复上述蛋白的表达水平。结论1.miR-204在AML患者骨髓中低表达,其可能的作用机制为通过抑制AML细胞增殖、迁移和侵袭,诱导细胞凋亡,发挥抗白血病效应。2.HGF在AML患者骨髓中呈高表达,可能与AML的发生相关。3.HGF为miR-204的靶基因,miR-204可靶向下调HGF影响HGF/c-MET通路及其下游蛋白的表达。4.miR-204靶向抑制HGF的表达,调节HGF/c-MET通路可能是其发挥抗白血病效应的关键要素之一。

马平^[6]（2020）在《PD-L1对急性髓系白血病糖酵解的影响及机制研究》文中研究表明背景急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）是一种高侵袭性和高异质性的血液系统恶性肿瘤,也是成人最常见的急性白血病。近年来,随着治疗手段的进步及新药的不断出现,诱导化学治疗（化疗）的完全缓解率（complete remission,CR）可以达到70%-80%,但仍有约10%-40%的患者诱导治疗失败,并且即使诱导治疗完全缓解并接受规律巩固治疗的患者仍有高达50%的复发率。诱导治疗失败及复发患者最终演变为难治、复发白血病。目前有关AML的发生、发展的机制尚未完全阐明,其发病涉及到多种因素,其中细胞遗传学异常在AML的发病机制中起着重要作用,其中葡萄糖代谢途径是受遗传学影响的重要领域。糖酵解是肿瘤细胞主要的能量代谢过程,上世纪二三十年代,Otto Warburg等人发现,即是在氧气充足的条件下,肿瘤细胞可将大部分葡萄糖以糖酵解的形式转化为乳酸,这种以葡萄糖高消耗、有氧糖酵解及乳酸生成为特点的代谢方式称为“Warburg效应”。糖酵解中的一系列关键酶在实体肿瘤及急性白血病的增殖、浸润、转移及耐药过程中发挥重要作用。糖酵解不仅为肿瘤细胞的快速增殖提供能量供应,同时还为其提供了大量的增殖所必须的合成原料。通过抑制糖酵解可以出现肿瘤细胞增殖受抑、凋亡增加和逆转耐药的现象,实现抗肿瘤目的。AKT/mTOR信号通路是肿瘤细胞糖酵解最为密切的调控通路之一,同时又参与了转录因子HIF-1α的表达与调控。PD-L1（programmed death ligand 1）作为B7超家族成员常在抗原递呈细胞及肿瘤细胞表面表达,通过与其受体PD-1（programmed death 1）相互作用参与肿瘤细胞的免疫逃逸过程。PD-L1在多种肿瘤细胞表面及肿瘤微环境的免疫细胞表面都可以被检测到,PD-L1不仅参与肿瘤的免疫逃逸还与肿瘤的恶性程度及不良预后相关。已有多项研究证实PD-L1与恶性肿瘤的发生、发展密切相关。还有研究显示肿瘤细胞表面PD-L1可直接激活细胞内AKT/mTOR信号通路导致糖酵解基因表达上调、增强糖酵解代谢。目前关于PD-L1在AML中的研究报道较少,且主要集中在PD-L1与PD-1相结合影响抗肿瘤免疫方面,缺乏PD-L1对AML的发生、发展的影响及具体机制的研究。其中,PD-L1是否可以直接参与调控AML细胞的生物学行为,AML中异常表达的PD-L1是否与AML的高糖酵解表型有关等问题都未见报道。为了解决这些问题,本研究首先探讨了 PD-L1在初治AML患者中的表达与临床特征和预后的关系,随后探讨了 PD-L1对AML细胞生物学行为和糖酵解的影响及作用机制。为研究PD-L1在初治AML患者中骨髓单个核细胞中的表达情况,我们收集郑州大学第一附属医院于2013-2015年间住院的初治非M3的AML患者的骨髓标本。经过对患者的随访及病例资料的整理后共有90例,收集新鲜标本后立即将标本用淋巴细胞分离液离心提取单个核细胞,然后提取mRNA应用荧光实时定量PCR方法检测mRNA表达水平。进一步构建稳定过表达及干扰PD-L1表达的AML细胞株,通过在体内、体外实验研究PD-L1表达量对AML细胞的增殖、凋亡、周期及糖酵解的影响。应用RNA-Seq技术分析PD-L1基因过表达组与对照组AML细胞株在转录组水平上基因表达变化。应用生物信息学技术对差异基因进行功能和通路富集,分析PD-L1在AML中可能的作用机制。最后应用Western blot技术检测PD-L1 的表达变化对糖酵解相关蛋白及AKT/mTOR/HIF-1α信号通路中关键蛋白的影响,分析其具体作用机制。本研究共分三个部分:第一部分PD-L1在AML中的表达及对临床预后影响目的应用Q-PCR方法检测PD-L1在AML患者骨髓单个核细胞中的mRNA水平,探讨PD-L1表达水平的变化与临床特征和预后之间的关系,并分析PD-L1基因与糖酵解基因及HIF-1α基因之间的相关性。方法1.利用GEPIA网站提供的公开肿瘤测序结果数据,分析PD-L1基因在AML患者与正常对照中的表达情况,同时分析PD-L1基因表达水平的高低与生存之间的关系。最后分析PD-L1基因与糖酵解相关基因及HIF-1α基因之间的相关性。2.应用Q-PCR方法检测90例初治的AML患者和18例骨髓移植供者骨髓的单个核细胞中的PD-L1基因、糖酵解相关基因及HIF-1α基因的表达水平,并进行基因之间相关性分析。3.收集90例初治AML患者临床资料,根据诱导治疗及后续巩固治疗的疗效与随访结果将患者分为持续完全缓解组和难治复发组,分析AML患者与正常对照及持续完全缓解组与难治复发组之间PD-L1基因表达量的差异,分析AML患者与正常对照组之间糖酵解相关基因和HIF-1α基因表达量的差异。4.应用卡方检验分析PD-L1的表达与AML患者临床特征之间的关系,Kaplan-Meier方法进行生存率分析并绘制生存曲线。用COX回归模型进行单因素及多因素分析。结果1.通过在GEPIA网站中检索发现与正常对照相比PD-L1基因在AML患者中表达量增高,但差异尚不具有统计学意义。检索生存发现PD-L1表达上调的AML患者较PD-L1表达下调的患者生存时间显着降低（P=0.046）。分析PD-L1基因表达与糖酵解相关基因（PFKM、PDK1、ENO2、GLUT1）及HIF-1α基因的表达具有正相关性（均P<0.05）。2.Q-PCR方法检测PD-L1、糖酵解相关基因（PFKM2、ALDOA、PGK1、PDK1、LDHA、HK2）和HIF-1α的mRNA表达水平显示,PD-L1在初治AML患者较正常对照表达量增高（P<0.05）;在难治复发组较持续完全缓解组的表达量增高（P<0.05）;糖酵解相关基因及HIF-1α在初治AML患者较正常对照表达量增高（均P<0.01）;在初治AML患者中PD-L1的表达与糖酵解相关基因及HIF-1α间的表达存在正相关性（均P<0.01）。3.应用卡方检验分析PD-L1基因的表达与临床特征的关系,结果显示,PD-L1基因的表达水平与AML患者一个疗程是否缓解的临床特征呈正相关。4.生存分析的结果显示PD-L1基因的表达水平与AML患者的预后相关,PD-L1基因高表达的AML患者相较表达量低的患者具有较差的总体生存期（P=0.041）。通过对AML患者预后多因素分析,WBC数（P=0.007）、预后分层（P=0.011）、一个疗程是否缓解（P=0.04）和PD-L1基因（P=0.02）是AML的独立预后因子。小结1.与正常对照相比,PD-L1基因的表达量在初治AML患者中显着增高,难治复发组较持续完全缓解组的表达量增高,其表达量与患者的预后呈负相关。2.与正常对照相比,糖酵解相关基因（PFKM2、ALDOA、PGK1、PDK1、LDHA、HK2）及HIF-1α基因的表达量在初治AML患者中显着增高。3.在初治AML患者中PD-L1的表达与糖酵解相关基因及HIF-1α间的表达存在正相关性,提示PD-L1可能通过HIF-1α调节AML的糖酵解过程。第二部分PD-L1在体内及体外对AML细胞生物学功能的影响目的通过体外细胞功能实验研究PD-L1表达量的变化对AML细胞的增殖、凋亡及周期的影响。研究PD-L1在AML发生、发展过程中的作用。构建裸鼠皮下移植瘤模型,检测PD-L1的表达量对瘤体体积及重量的影响。方法1.培养 5 株 AML 细胞:HL-60、Molm-13、K562、KG-1a 和 THP-1 细胞,应用磁珠分选技术在正常骨髓移植供者患者外周血中分离CD34+细胞作为正常对照,在细胞对数生长期提取细胞的蛋白及RNA。2.应用Q-PCR方法检测PD-L1基因在上述5株AMI细胞株及CD34+细胞中的表达水平;流式细胞术和Western blot方法检测细胞PD-L1蛋白的表达。3.应用PD-L1过表达及shRNA的干扰质粒包装慢病毒,将PD-L1过表达质粒转染到Molm-13细胞,将shRNA质粒转染到THP-1细胞,应用嘌呤霉素筛选出稳定表达株,最后应用荧光显微镜、Q-PCR、Western blot和流式细胞术对筛选后的细胞株进行检测荧光表达量、PD-L1基因及蛋白表达情况。4.应用CCK-8试剂盒检测细胞的增殖,应用凋亡试剂盒检测细胞的凋亡情况,应用周期试剂盒检测细胞周期的分布变化,观察PD-L1表达变化对AML细胞生物学行为的影响。5.将Molm-13-vec和Molm-13-PD-L1细胞通过裸鼠皮下接种的方式构建皮下移植瘤模型,观察两组移植瘤的生长速率、体积及最后重量的变化。最后应用免疫组化的方法检测移植瘤中Ki67的表达变化。结果1.根据5种AML细胞株中PD-L1表达的情况,最后选出低表达PD-L1基因及蛋白的细胞株Molm-13,高表达PD-L1基因及蛋白的细胞株THP-1。2.应用Q-PCR、流式细胞术及Western blot方法检测稳转的细胞株显示,PD-L1 基因及蛋白在Molm-13-PD-L1 较Molm-13-vec及Molm-13-blank 中升高,在 THP1-sh1 和 THP1-sh2 较 THP1-NC 中减低。3.PD-L1过表达可使Molm-13细胞增殖增加、凋亡受抑同时增加S期细胞比例,PD-L1的减低可以导致THP-1细胞增殖受抑、凋亡增加同时增加G0/G1期细胞比例,降低S期细胞比例。4.裸鼠皮下移植瘤实验结果显示,PD-L1能显着增加AML移植瘤组织中增殖相关蛋白Ki67的表达,促进AML移植瘤的增殖。小结通过体内及体外实验证实PD-L1的表达变化可以影响AML细胞的增殖、凋亡和周期。第三部分PD-L1对AML细胞糖酵解的影响及机制研究目的将Molm-13-vec和Molm-13-PD-L1细胞进行转录组测序,对测序结果进行KEGG功能及通路富集分析,预测PD-L1在AML中的作用机制。检测PD-L1表达的变化对AML细胞糖酵解的影响并探讨PD-L1对糖酵解影响的具体信号通路。方法1.将稳转细胞株Molm-13-PD-L1和Molm-13-vec进行培养、收集和洗涤,加入适量TRIzol经干冰运输至深圳华大基因股份有限公司进行转录组测序。将差异基因进行KEGG功能和通路富集分析,预测PD-L1在AML中作用及其机制。2.应用Q-PCR和Western blot法检测PD-L1表达的变化对糖酵解相关基因及关键蛋白的影响,应用葡萄糖及乳酸检测试剂盒检测PD-L1表达的变化对葡萄糖摄取及乳酸生成的影响,应用Seahorse实验检测PD-L1表达的变化对细胞外酸化率（ECAR）的影响。3.应用Western blot法对测序得到的富集通路中的关键蛋白进行检测,然后应用AKT抑制剂、mTOR抑制剂及干扰HIF-1α的表达,检测通路关键蛋白的变化及对AML细胞糖酵解的影响。4.应用双荧光素酶表达实验验证HIF-1α对糖酵解关键基因HK2、LDHA的靶向调控。结果1.差异基因KEGG功能富集分析PD-L1可以调节AML碳水化合物的代谢;KEGG通路富集分析显示PD-L1对AML细胞代谢的影响可能是通过PI3K/AKT信号转导通路实现的。2.过表达PDL-1基因可以导致AML细胞糖酵解相关基因（ALDOA、PGK1、LDHA、HK2）及糖酵解关键蛋白HK2、LDHA表达上调,干扰AML细胞PD-L1的表达可导致糖酵解相关基因（ALDOA、PGK1、LDHA、HK2）及糖酵解关键蛋白HK2、LDHA表达下调。3.过表达PDL-1基因可以导致AML细胞葡萄糖摄取增加、ECAR增高及乳酸生成增加。干扰PD-L1的表达,可以导致AML细胞葡萄糖摄取减少、ECAR降低及乳酸生成减少。4.在对AML细胞系进行AKT/mTOR/HIF-1α通路关键蛋白检测显示与PD-L1低表达细胞系相比,P-AKT、P-S6和HIF-1α蛋白在PD-L1高表达细胞系THP1中表达增高。与空白细胞及空质粒细胞组相比,过表达PD-L1的AML细胞中P-AKT、P-S6和HIF-1α蛋白表达增高。与对照组相比,干扰PD-L1表达的AML细胞中P-AKT、P-S6和HIF-1α蛋白表达下降。5.在过表达PD-L1的AML细胞中应用AKT抑制剂可以导致P-AKT、P-S6、HIF-1α、HK2和LDHA蛋白的表达下降,同时导致AML细胞萄糖摄取减少、ECAR降低及乳酸生成减少。6.在过表达PD-L1的AML细胞中应用mTOR抑制剂雷帕霉素可以导致P-S6、HIF-1α、HK2和LDHA蛋白的表达下降,同时导致AML细胞萄糖摄取减少、ECAR降低及乳酸生成减少。7.将过表达PD-L1的AML细胞应用si技术干扰HIF-1α基因的表达可以导致HIF-1α、HK2和LDHA蛋白的表达下降,而P-AKT、P-S6蛋白的表达不受影响,同时导致AML细胞萄糖摄取减少、ECAR降低及乳酸生成减少。8.应用双荧光素酶实验验证HIF-1α可以靶向调控HK2和LDHA基因。小结1.PD-L1的表达变化可以影响AML细胞的糖酵解。2.HIF-1α可以上调靶基因HK2、LDHA的转录。3.PD-L1是通过AKT/mTOR/HIF-1α信号通路调节糖酵解。

张洋^[7]（2020）在《FTL在免疫相关性血细胞减少症发病机制中作用的研究》文中研究表明目的:在前期SEREX法筛选出免疫相关性全血细胞减少症（immuno-related pancytopenia,IRP）可能抗原铁蛋白轻链（Ferritin light chain,FTL）的基础上,进一步筛选与鉴定FTL的抗原表位,并将FTL与指标进行相关性分析,从而验证FTL在IRP中的抗原性。内容:分别纯化IRP患者与健康人血清抗体,应用噬菌体随机肽库亲和筛选出噬菌体阳性斑测序,与铁蛋白轻链序列比对,并联合T细胞表位预测软件,筛选出FTL可能抗原表位,合成抗原肽。Elispot筛选出能被Th2细胞识别,而不被Th1细胞识别的FTL的抗原肽;分别在FTL水平、FTL-mRNA水平分析IRP病例组和对照组的差异;同时分析T、B淋巴细胞免疫状态,并与临床指标进行相关性分析。方法:1、筛选FTL抗原表位,合成抗原肽。将IRP患者与健康人血清抗体提纯,应用噬菌体随机肽库进行亲和筛选,结合ELISA挑取能与IRP患者血清抗体结合,而不能与健康人血清抗体结合的噬菌体阳性克隆测序、将测序结果与FTL序列比对,同时利用T细胞表位预测软件预测FTL与MHC-Ⅱ分子结合抗原表位（15肽）,合成肽段序列为VNLYLQASYTYLSLG作为后续酶联免疫斑点试验（ELISPOT）的阳性肽段。2、ELISPOT检测抗原肽对Th2细胞作用。应用淋巴细胞分离液提取IRP初治患者外周血单个核细胞（PBMNCs）并-80℃冰箱储存,待使用前复苏,检测细胞存活率。将复苏的PBMCs准确计数并分别放入IL-4 Elispot、IFN-γElispot中培养48h后上机检测。3、IRP初治及恢复组FTL水平检测及其与临床指标关联采用流式细胞术检测初治IRP、恢复期IRP以及病例对照组骨髓单个核细胞膜FTL表达,ELISA方法分别检测初治组、恢复组IRP患者以及正常对照血清中FTL浓度,WB检测初治IRP患者、恢复期IRP患者以及病例对照组骨髓单个核细胞FTL蛋白表达水平,并且用Q-PCR方法检测初治IRP患者、恢复期IRP患者以及病例对照组骨髓单个核细胞FTL-mRNA表达量。将上述指标、IRP患者的T、B细胞免疫状态及其他临床指标进行相关分析。结果:1.我们成功应用噬菌体随机肽库进行亲和筛选,结合ELISA挑取噬菌体阳性克隆测序,与铁蛋白轻链序列比对,并联合T细胞表位预测软件,筛选出FTL可能阳性抗原表位（多肽1）:VNLYLQASYTYLSLG及阴性肽段（多肽2）:IKKPAEDEWGKTPDA。2.本实验通过ELISPOT技术,发现多肽1:VNLYLQASYTYLSLG能明显刺激IL-4产生,不能刺激IFN-r产生,而多肽2:IKKPAEDEWGKTPDA不能刺激IL-4的产生,提示多肽1能明显激活Th2细胞,留取多肽1进行后续实验。3.1)本实验通过FCM发现IRP初治组骨髓单个核细胞膜FTL表达水平（4.62±4.61）高于病例对照组（0.68±0.46）,差异具有统计学意义;ELISA法检测初治组和恢复组血清FTL水平（954.85±743.34）ng/ml及（303.22±300.79）ng/ml高于正常对照组（70.46±82.63）ng/ml,差异具有统计学意义（P<0.05）;Q-PCR法检测初治组、恢复组、病例对照组骨髓单个核细胞FTL-mRNA表达水平分别是（2.00±1.30）、（1.27±0.65）和（1.10±0.49）,与病例对照组相比,IRP初治组FTL-mRNA水平明显升高,差异有统计学意义。WB发现FTL蛋白水平IRP初治组明显高于病例对照组。2)IRP患者T、B淋巴细胞免疫状态及与临床指标相关性分析:IRP初治组CD3+CD4+/CD3+（%）、CD3+CD4+/CD3+CD8+（%）、CD19+/PBMCs（%）细胞比例及细胞因子IL-6、IL-10表达水平均高于病例对照组,差异具有统计学意义,初治组和恢复组、恢复组和病例对照组比较差异无统计学意义。IRP初治组和恢复组外周血CD5+CD19+/CD19+（%）细胞比例及细胞因子IL-4表达水平高于对照组,差异具有统计学意义,初治组与恢复组差异无统计学意义;IRP初治组、恢复组、病例对照组外周血IL-2、TNF-α、IFN-γ水平比较,差异无统计学意义。CD5+CD19+/CD19+与补体C4成负相关;CD5+CD19+/CD19+与HBe Ab成正相关;IL-4与Ig A、抗链O成正相关;IL-6与C-反应蛋白（CRP）、HBe Ag、铁蛋白（Fer）成正相关。FTL-mRNA水平与抗链O（ASO）成正相关。ELISA法检测FTL水平与RBC、PLT成负相关,与铁蛋白、C反应蛋白（CRP）、乙肝e抗原成正相关。结论:1.FTL是部分IRP患者抗骨髓细胞膜抗体针对的“靶抗原”。2.VNLYLQASYTYLSLG多肽是“靶抗原”表位。3.该靶抗原在IRP患者骨髓造血细胞异常过度表达且与病情相关。4.阻断该靶抗原表位表达,有下调Th2激活趋势。

王爽^[8]（2020）在《长寿命浆细胞、NLRP3炎症复合体及IL-36在ITP发病中的作用和机制研究》文中研究说明第一部分硼替佐米对激素抵抗或复发ITP患者体内长寿命浆细胞的作用探究研究目的:探究激素抵抗或复发的原发性免疫性血小板减少症（immune thrombocytopenia,ITP）患者骨髓内长寿命浆细胞的情况,并通过硼替佐米的蛋白酶体抑制作用来探究抗血小板特异性IgG分泌长寿命浆细胞在ITP发病机制中的作用。研究方法:1.取ITP患者与健康志愿者的骨髓组织切片进行免疫组化分析,检测两组CD138+浆细胞在骨髓有核细胞中的百分比是否存在统计学差异。2.取ITP患者与健康志愿者的骨髓液,裂解红细胞后用流式细胞学分析检测骨髓有核细胞中CD38hiCD138+浆细胞的百分比在组间是否存在统计学差异,同时检测两组间CD19-CD38hiCD138+的总长寿命浆细胞的平均百分比有无显着统计学差异。3.取ITP患者与健康志愿者的骨髓组织制作冰冻切片,并在完成CD19和CD138染色后进行免疫荧光共聚焦检测,观察CD19和CD138的共表达情况,并统计CD138+细胞中CD19的阴性率,以及CD19-CD138+的长寿命浆细胞占有核细胞的百分比。4.考虑到硼替佐米对蛋白酶体的抑制特性,我们研究了硼替佐米是否可以减少骨髓中长寿命浆细胞的数量,并进一步限制抗血小板自身抗体的分泌。ITP骨髓液分选所得骨髓单个核细胞在加或不加0.25 ng/mL硼替佐米的情况下培养5天后,用流式细胞学分析检测CD19-CD38hiCD138+长寿命浆细胞的百分比,并同时检测CD3+T细胞、CD20+B细胞和CD56+NK细胞的百分比有无变化。5.为检测硼替佐米对分泌抗GPⅡb/Ⅲa特异性自身抗体的长寿命浆细胞数目的影响,我们用磁珠分选所得的CD19-CD138+长寿命浆细胞进行了 GPⅡb/Ⅲa特异性ELISpot检测。给药组加入25 ng/mL的硼替佐米,对照组加等量生理盐水,培养20 h。6.为了明确硼替佐米对抗血小板抗体分泌的影响,我们用加或不加0.25 ng/mL硼替佐米培养5天的CD19-CD138+长寿命浆细胞上清液,进行了改良MAIPA分析。7.基于硼替佐米作为蛋白酶体抑制剂的作用机制,我们进一步通过Annexin V染色探究了硼替佐米是否能诱导长寿命浆细胞凋亡。同时,用CD138-PE/Cy7和CD19-APC标记长寿命浆细胞。将培养的BMMCs分为4组,分别用4个浓度梯度的硼替佐米（0、0.25、25和2500 ng/mL）进行处理。处理6 h后,用流式细胞仪测定Annexin V阳性凋亡细胞的比例。8.为了确定硼替佐米减少长寿命浆细胞的数量的机制,是通过蛋白酶体抑制作用而不是通过非特异性作用（例如细胞毒性）,我们接下来用蛋白酶体活性检测试剂盒对硼替佐米组和对照组间蛋白酶体活性进行了检测分析。9.为了探究硼替佐米是否能在活体内减轻ITP,我们建立了主动型ITP小鼠模型来评价其作用。CD61敲除小鼠用CD61+的野生型血小板免疫,取其免疫后脾细胞注入已接受全身照射的SCID小鼠体内。将模型小鼠分为两组:硼替佐米处理组,从第3周起始至第4周末,以每周两次的频率给予尾静脉注射20 μg/kg的硼替佐米;而不给药对照组给予尾静脉注射等量生理盐水。在照射后的第19天至第28天,所有小鼠通过饮用水摄取BrdU（0.8 mg/mL）。连续4周每周记录小鼠外周血的血小板计数。10.在第4周结束后处死所有小鼠,采集小鼠的骨髓进行流式细胞学分析。BrdU-CD138+浆细胞即为长寿命浆细胞。同时检测CD3+T细胞或CD20+B细胞的改变。研究结果:1.骨髓组织切片免疫组化的结果显示,ITP患者骨髓中CD138+浆细胞的平均百分比明显高于健康对照组。与此结果一致的是,流式细胞学分析显示ITP患者骨髓中CD38hiCD138+浆细胞的百分比显着高于健康志愿者。然而,两组间CD19-CD38hiCD138+的总长寿命浆细胞的平均百分比无显着统计学差异。2.骨髓组织冰冻切片的共聚焦免疫荧光显微镜检测显示,ITP患者CD138+细胞中CD19阴性率为30.96±16.07%,与健康对照组的情况（42.06±23.08%）无显着性差异。此外,统计所得CD19-CD138+长寿命浆细胞在有核细胞中的比例在ITP患者和健康志愿者之间没有显着统计学差异。3.ITP的骨髓单个核细胞在加或不加0.25 ng/mL硼替佐米的情况下体外培养5天后,经流式细胞学分析显示,硼替佐米组骨髓单个核细胞中CD19-CD38hiCD138+长寿命浆细胞的百分比为0.02±0.01%,显着低于未给药对照组（0.04±0.02%）。硼替佐米对CD3+T细胞、CD20+B细胞和CD56+NK细胞的比例没有显着影响,提示硼替佐米对浆细胞的抑制作用具有特异性。4.用磁珠分选所得的CD19-CD138+长寿命浆细胞进行的GPⅡb/Ⅲa特异性ELISpot检测结果显示,在激素抵抗或复发ITP患者的CD19-CD138+长寿命浆细胞中观察到了一定数量的抗GPⅡb/Ⅲa IgG分泌细胞,而在健康志愿者中几乎没有观察到。在培养20 h后的ELISpot板中,硼替佐米处理组出现的斑点数明显少于未加硼替佐米的对照组,此结果直观地证明了硼替佐米对长寿命浆细胞清除的显着作用。5.改良MAIPA分析显示,与之前GPⅡb/Ⅲa特异性长寿命浆细胞的变化一致,硼替佐米处理组上清液的吸光度明显低于未处理对照组,提示硼替佐米处理组抗GPⅡb/Ⅲa抗体浓度明显降低。6.硼替佐米诱导凋亡的检测结果表明,随着硼替佐米浓度的增加,4个浓度梯度组Annexin V阳性凋亡细胞的百分率亦随之增加,表明硼替佐米对长寿命浆细胞的凋亡作用呈浓度依赖性。相比之下,不同组间B细胞、T细胞和NK细胞的凋亡比例保持稳定,未显示统计学差异。7.蛋白酶体活性检测分析结果显示,硼替佐米组的相对荧光单位较对照组明显降低,这提示硼替佐米对长寿命浆细胞中蛋白酶体的活性有一定的抑制作用。8.主动型ITP小鼠模型实验结果显示,硼替佐米处理组小鼠在照射后第4周末血小板水平显着高于未给药对照组小鼠,且血小板计数随着时间的推移上升更快。9.模型小鼠骨髓流式细胞学分析显示,硼替佐米组浆细胞百分比为0.15±0.06%,明显低于未给药对照组（1.00±0.30%）,此结果提示硼替佐米对浆细胞有显着影响。未观察到CD3+T细胞或CD20+B细胞的改变。硼替佐米组BrdU-CD138+长寿命浆细胞的比例为0.06±0.05%,较未给药对照组明显降低（0.69 ±0.11%）。研究结论:1.在糖皮质激素抵抗或复发的ITP患者的骨髓中存在持续分泌抗血小板抗体的血小板特异性长寿命浆细胞。2.硼替佐米作为蛋白酶体抑制剂可减少抗血小板抗体产生长寿命浆细胞的数目。3.硼替佐米可降低培养上清液中分泌的抗血小板自身抗体的浓度。4.在主动型ITP小鼠模型中,应用硼替佐米能有效减轻血小板减少症的严重程度。5.本研究为ITP的发病机制研究提供了补充,为ITP的临床治疗提供了新的可行的靶点和药物选择。第二部分血小板内NLRP3炎症复合体的活化参与ITP的机制研究研究目的:探究ITP血小板内抗氧化能力及细胞内氧化应激的改变,探讨NLRP3炎症复合体在ITP血小板中的活化情况,完善ITP的发病机制和病理生理学的研究。研究方法:1.为探究ITP患者血小板中NLRP3的表达是否增高,取ITP患者和健康志愿者的血小板,用CD61和NLRP3流式抗体染色后,检测CD61+血小板内NLRP3的表达情况。2.取ITP患者和健康志愿者的血小板,裂解后提取总蛋白,用免疫印迹实验进一步验证NLRP3炎症复合体在蛋白水平的表达情况,实验过程检测了NLRP3、ASC、cleaved caspase-1 和 cleaved IL-1β 的水平。3.之后又从转录表达情况进一步验证,取ITP患者和健康志愿者的血小板,提取mRNA后反转录为cDNA,进行实时荧光定量PCR检测,测定NLRP3、ASC、caspase-1 和 IL-1β 的 mRNA 表达情况。4.为进一步评估NLRP3炎症复合体的活化情况,我们又用免疫荧光检测观察了 ITP患者和健康志愿者的血小板中NLRP3和ASC的共定位情况,二者共定位提示NLRP3炎症复合体发生了装配和活化。5.此外,我们还用caspase-1活性检测试剂盒分析了 ITP和健康血小板内caspase-1的活性,进一步验证NLRP3炎症复合体的活化。6.为明确NLRP3炎症复合体活化的原因,我们首先用ROS检测试剂盒检测了 ITP血小板内的ROS水平;并且用DCFH-DA通过流式细胞学分析检测了H202处理30 min条件下血小板内的抗氧化能力。7.接下来,我们用免疫印迹法检测了 ITP和健康血小板内NLRP3炎症复合体活化对ROS反应的敏感性,即H202处理前后NLRP3、ASC、cleavedcaspase-1和cleaved IL-1 β相对表达量的改变情况。8.我们用还原剂NAC进一步明确了降低的抗氧化能力在ITP血小板NLRP3炎症复合体活化中的作用。血小板在H202处理前先用NAC预处理1h,在H2O2孵育 30min 后,用免疫印迹法检测 NLRP、ASC、cleavedcaspase-1 和 cleaved IL-1β表达的改变;此外,用caspase-1活性试剂盒检测caspase-1活性的改变。9.接下来,我们用NLRP3抑制剂MCC950和caspase-1抑制剂Z-YVAD-FMK评估了 NLRP3炎症复合体活化对ITP血小板焦亡的诱导情况。在ITP血小板暴露于H2O2前,先用MCC950和Z-YVAD-FMK预处理30 min,然后用流式分析检测annexin-V+/caspase-l+的焦亡细胞百分比。并用ELISA检测培养上清中分泌的IL-1β的浓度变化。研究结果:1.ITP患者和健康志愿者的血小板流式分析结果显示,ITP血小板中的NLRP3平均荧光强度显着高于健康血小板,提示ITP血小板中NLRP3的表达增加。2.血小板免疫印迹实验结果显示,NLRP3、ASC、cleaved caspase-1和cleaved IL-1β的水平在ITP血小板中均显着升高,进一步验证了 NLRP3炎症复合体在蛋白水平的表达增强。3.血小板mRNA实时荧光定量PCR结果与蛋白表达水平的变化一致,即ITP血小板中NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的mRNA表达水平较健康志愿者显着升高,提示了 NLRP3炎症复合体的转录增强。4.血小板免疫荧光结果显示,NLRP3和ASC在ITP血小板内发生了共定位,而在健康志愿者的血小板内无显着共定位,提示ITP血小板内有增强的NLRP3炎症复合体的装配和活化。5.血小板内caspase-1检测结果显示,ITP患者血小板内caspase-1的活性较健康对照组显着增强,结合之前免疫印迹结果显示的cleaved IL-1β蛋白水平增加,提示ITP血小板中NLRP3炎症复合体发生了活化。6.ROS试剂盒检测得ITP血小板与健康对照血小板内ROS水平无显着统计学差异;而血小板内抗氧化能力检测显示,ITP血小板内的抗氧化能力较健康血小板显着下降。7.免疫印迹法检测H202处理后血小板内NLRP3、ASC、cleaved caspase-1和cleaved IL-1β相对表达量增加,且ITP的倍增数显着高于健康志愿者,提示ITP血小板内NLRP3炎症复合体活化对ROS反应的敏感性高于健康志愿者。8.用还原剂NAC预处理的ITP血小板,在H2O2处理后,免疫印迹法显示其 NLRP、ASC、cleaved caspase-1 和 cleaved IL-1β 的表达较未用 NAC 的对照组显着下降。且与此一致的是,NAC预处理的ITP血小板,在H202处理后,其caspase-1活性亦较未用NAC的对照组显着下降。9.用 NLRP3 抑制剂 MCC950 和 caspase-1 抑制剂 Z-YVAD-FMK 预处理 ITP血小板,再暴露于H2O2后,流式分析检测annexin-V+/caspase-1+的焦亡细胞百分比显着低于未预处理对照组。此外,ELISA结果显示,用MCC950和Z-YVAD-FMK预处理的ITP血小板培养上清中分泌的IL-1β的浓度亦较未处理对照组下降。研究结论:1.ITP患者血小板中NLRP3炎症复合体的蛋白和mRNA水平的表达较健康血小板均增加。2.ITP血小板内NLRP3炎症复合体的装配和活化较健康血小板增强。3.ITP血小板内的抗氧化能力较健康血小板显着下降。4.ITP血小板内NLRP3炎症复合体活化对ROS反应的敏感性高于健康志愿者血小板。5.ITP血小板内降低的抗氧化能力导致细胞内氧化应激增强,从而诱导NLRP3炎症复合体活化。6.NLRP3炎症复合体活化诱导了 ITP血小板的焦亡增加,并增加IL-1β的分泌,导致下游炎症状态的增强。第三部分I TP中IL-36细胞因子的表达谱变化及其参与ITP作用的初步探索研究目的:探究 ITP 中 IL-36 细胞因子（IL-36α、IL-36β、IL-36y 和 IL-36Ra）的表达谱,初步探究IL-36细胞因子与ITP的相关关系,进一步完善ITP的机制或病理生理学研究。研究方法:1.招募了 25个活动期ITP患者和13个缓解期ITP患者,此外,另有20个年龄性别匹配的健康志愿者作为正常对照。2.采集外周血,制取乏血小板血浆,用人IL-1家族细胞因子阵列检测试剂盒检测 IL-36β、IL-36y、IL-36Ra 和 IL-38 的血浆水平,用 Human IL-36alpha/IL-1F6 DuoSet ELISA试剂盒检测IL-36α的血浆水平。3.从外周血中分选单个核细胞,提取RNA并反转录为cDNA,行实时荧光定量PCR,检测IL-36细胞因子的转录水平。4.接下来,我们采用相关性分析检验,探讨分析了在活动期ITP患者中,IL-36细胞因子与ITP特征性的血小板计数之间的相关性。5.考虑到抗血小板抗体亦为ITP特征性表现,我们又分析了 IL-36细胞因子与抗血小板抗体之间的关系,将进行过抗体检测的17名活动期ITP患者分为抗体阳性和抗体阴性两组进行比较分析。6.此外,我们还分析了活动期ITP患者PBMCs中IL-36的mRNA水平与IL-36R的相关性,以及血浆中IL-36与IL-17、IFN-γ的相关性。7.考虑到IL-36细胞因子分为激动性和拮抗性,我们又分析了 IL-36激动剂/抑制剂（agonists/antagonists）比值与血小板计数和抗血小板自身抗体的关系。IL-36 agonists/antagonists比值的计算公式如下:（IL-36α倍增数+IL-36β倍增数+IL-36γ倍增数）/（IL-36Ra倍增数+IL-38倍增数）。研究结果:1.与健康对照相和缓解期ITP相比,活动期ITP患者血浆中的IL-36α的水平显着下降,且与健康对照相比IL-36γ的水平在ITP患者中亦显着减低。而缓解期ITP与健康对照间均无统计学差异。此外,IL-36β、IL-36Ra和IL-38的血浆水平在三组之间均无差异。2.实时荧光定量PCR检测结果显示,IL-36αmRNA的改变与血浆水平变化一致,活动期ITP患者PBMCs中mRNA水平与健康对照相比亦显着下降。IL-36γ、IL-36Ra和IL-38的mRNA水平在三组之间无统计学差异。IL-36β的mRNA水平过低、无法检测。3.活动期ITP患者IL-36细胞因子与血小板计数相关性分析显示,IL-36α、IL-36β、IL-36γ、IL-36Ra和IL-38与血小板计数均无显着相关性。4.抗血小板抗体阳性和阴性两组的活动期ITP患者血浆中IL-36α、IL-36β、IL-36y、IL-36Ra和IL-38水平均无显着统计学差异,排除了 IL-36与抗血小板抗体之间的关系。5.活动期ITP患者PBMCs中IL-36的mRNA水平与IL-36R的相关性无显着统计学意义,此外,血浆中IL-36与IL-17、IFN-γ的相关性亦未见统计学意义。6.IL-36 agonists/antagonists比值与血小板计数、抗血小板自身抗体均未发现显着统计学相关关系。研究结论:1.活动期ITP患者的血浆中IL-36α和IL-36γ水平较健康正常人降低。2.活动期ITP患者外周血单个核细胞中IL-36α的mRNA水平较健康正常人降低。3.IL-36细胞因子与血小板计数、抗血小板抗体的有无、IL-36R、IL-17和IFN-γ均未发现显着相关性。4.IL-36细胞因子在ITP中的变化明确,但其参与ITP的具体机制仍需未来进一步的筛查与探索。

张琛^[9]（2020）在《骨髓交感神经及免疫失衡在急性白血病发生发展中的作用研究》文中研究表明第一部分急性髓性白血病骨髓微环境中神经破坏与Th免疫失衡的研究研究背景急性髓性白血病（Acute myeloid leukemia,AML）是一组异质性恶性疾病,其特征是白血病干细胞和/或祖细胞的过度增殖造成大量白血病细胞累积并抑制正常造血。即使采用目前临床应用强化的化疗方案和干细胞移植,AML的总体生存率仍然很差。恶性白血病细胞的微环境会被重塑成有利于白血病生存的环境,这样的骨髓微环境可以保护AML细胞免受化疗药诱导的细胞死亡。探究骨髓微环境中可以促进白血病发生发展、保护白血病细胞免受化疗药杀伤的因素,以期能够发现针对AML治疗的有效靶点。骨髓局部区域里的交感神经系统与造血干细胞（Hematopoietic stem cells,HSC）通过直接接触或者通过分泌细胞因子的形式,调节骨髓龛内造血干细胞的存活和休眠状态的转化来调控骨髓的正常造血功能。当破坏小鼠交感神经后,使骨髓局部缺乏交感失神经分布,会使得骨髓中造血干细胞数量的急剧下降,使正常的造血功能受到一定程度的抑制。骨髓局部的交感神经组织对骨髓中的造血和免疫平衡的维持具有极为重要地调控作用。然而,骨髓交感神经损伤与血液系统疾病的发生发展也有着密不可分的关系。有研究发现骨髓增殖性肿瘤（Myeloproliferative Neoplasms,MPN）患者及模型小鼠的骨髓中,交感神经纤维有明显受损,这些损伤可以使得正常HSC的凋亡。CD4+T细胞是免疫系统中一个不可忽略的组成成分,其分化的Th（T helper）亚群在许多实体瘤的发生发展中也扮演着关键的角色。课题组前期发现AML患者骨髓中交感神经特异性分子酪氨酸羟化酶（Tyrosine Hydroxylase,TH）、Nestin等的表达水平与Th细胞分泌的特异性细胞因子IL-17A表达呈正相关,而与Foxp3/IL-17A比值呈负相关。因此,我们推测在AML的发生发展中,骨髓交感神经发生病理性改变,引起骨髓区域微环境Th细胞免疫网络的异常,造成骨髓微环境中免疫平衡受到抑制,进而使得白血病病程进展。然而,AML中骨髓交感神经损伤是通过何种机制改变骨髓Th细胞免疫网络,以及Th细胞免疫异常如何促进白血病细胞的发生发展,这些问题亟待进一步研究。研究目的1.明确AML患者骨髓局部存在神经破坏并分析其与患者临床特征之间的相关性。2.检测骨髓局部微环境中Th亚群的改变,明确在AML患者中存在骨髓Th亚群的免疫失衡,并通过系统生物学的分析推测其中作用的关键点。3.探究在白血病动物模型中破坏交感神经后,其Th的变化情况。4.应用髓腔注射的方法,破坏白血病动物模型骨髓局部的交感神经,旨在明确骨髓局部神经受到破坏后对白血病发生发展的作用。研究方法1.标本收集:本研究采集就诊于山东大学齐鲁医院的63例初诊急性髓性白血病病患及16例对照组的骨髓液;分离骨髓中的单个核细胞并用MACS方法分选CD4+T细胞,留取骨髓上清。2.AML患者骨髓局部存在神经破坏:应用RT-PCR方法检测患者和对照组骨髓细胞中神经特异性分子Nestin、GFAP、TUB3、MAP2和S-100的相对表达水平。3.AML患者骨髓局部肾上腺素受体表达情况与临床特征相关性分析:应用RT-PCR方法检测骨髓局部β-肾上腺素受体的三个不同亚型β1-ADR、β2-ADR和β3-ADR在患者和对照组中的表达差异,并分析其与临床特征之间的相关性。4.AML患者骨髓局部存在Th亚群的免疫失衡:流式细胞术检测AML患者与对照组骨髓局部Th亚群比例,包括Th1、Th2、Th17、Th9、Th22和Treg;应用RT-PCR技术检测Th亚群特异性转录因子T-bet、RORc、GATA3、AHR和Foxp3的mRNA水平;采用ELISA方法检测骨髓上清中细胞因子IFN-γ、IL-17A、TGF-β、IL-22、IL-10 和 IL-4 的浓度。5.系统生物学方法分析:我们利用系统生物学方法中的贝叶斯网络对白血病患者和对照组骨髓微环境中检测的Th亚群以及Th亚群的关键性转录因子进行分析。6.AML动物模型中交感神经破坏对白血病和Th亚群的影响:应用MLL-AF9细胞尾静脉注射到C57BL/6J背景的野生型雌鼠体内建造AML小鼠模型;分别进行 6-羟基多巴胺氢溴酸盐（6-Hydroxydopamine hydrobromide,6-OHDA）和 4-甲基儿茶酚（4-Methylcatechol,4-MY）的腹腔注射对小鼠进行神经破坏和神经保护的干预;应用流式细胞术的方法对动物模型骨髓局部Th亚群的比例进行测定。7.骨髓局部交感神经破坏对白血病的影响:应用髓腔注射6-OHDA的方法对小鼠骨髓局部的神经进行破坏。研究结果1.AML患者骨髓局部存在神经破坏:通过比较患者和对照组骨髓局部的基因相对表达量发现,神经特异性分子Nestin、GFAP、TUB3、MAP2和S-100的mRNA水平在白血病患者中均低于对照组,提示AML患者骨髓局部微环境中存在交感神经的破坏。2.AML患者骨髓局部肾上腺素受体表达情况与临床特征相关性分析:通过检测β-肾上腺素受体的三个不同亚型β1-ADR、β2-ADR和β3-ADR,我们发现除β1亚型在白血病患者骨髓局部的相对表达量较低,β2和β3亚型在白血病患者的骨髓局部均有着较高的相对表达水平。并且,β2-ADR亚型的表达量远高于β1-ADR和β3-ADR亚型。通过分析其与临床特征的关系,AML-M4和AML-M5亚型高表达β3-ADR,而其中高表达β1-ADR的病患出现髓外浸润的几率更大。3.AML患者骨髓局部存在Th亚群的免疫失衡:（1）.与对照组相比,AML患者骨髓局部Th1和Th17的比例出现显着地降低,Treg和Th22的比例显着增高:（2）.AML患者骨髓中Th亚群的下游转录因子T-bet、RORc和GATA3的mRNA表达量较对照组明显降低,而Treg的下游转录因子Foxp3和Th22的转录因子AHR有所增高;（3）.AML患者Th亚群分泌的细胞因子中,IFN-γ、IL-17A、TGF-β和IL-22均低于对照组,而IL-10和IL-4的分泌量高于对照组;（4）.将上述结果通过贝叶斯网络进行分析发现,对照组中贝叶斯网络的终点指向IFN-γ和IL-4,而在AML患者中网络的终点变为IL-17A和IL-10。4.AML动物模型中交感神经破坏对白血病和Th亚群的作用:（1）.AML模型鼠的生存期均短于正常对照组小鼠,且神经破坏剂组AML小鼠生存期短于其他组小鼠生存期;（2）.神经破坏剂组小鼠的白血病负荷明显高于其他组,而神经保护剂组小鼠的白血病负荷明显低于其他组;（3）.骨髓局部微环境中,Th1和Th17在AML及神经破坏组比对照组及神经保护组均降低,Treg和Th2在AML及神经破坏组比对照组及神经保护组均升高。Th17/Treg比值在AML及神经破坏组比对照组及神经保护组均降低。5.骨髓局部交感神经破坏对白血病及Th亚群的影响:在利用髓腔注射的方法对白血病模型小鼠单只股骨的局部交感神经进行破坏后,观察其白血病负荷情况发现,被破坏交感神经一侧的髓腔内的白血病负荷明显高于未进行神经破坏一侧的负荷量。研究结论1.AML病患骨髓局部存在交感神经破坏,且β-肾上腺素受体在AML病患骨髓局部存在高表达。2.AML患者骨髓局部存在Th亚群的免疫失衡,Th1及Th17的比例明显降低,Treg等免疫抑制亚群的比例明显增高。3.AML小鼠模型组,神经破坏剂组生存期明显变短且白血病负荷增加,而神经保护剂组生存期更长且白血病负荷更少;AML及神经破坏组的骨髓中存在免疫失衡。4.局部破坏AML小鼠单侧的骨髓交感神经发现,被破坏一侧髓腔中白血病负荷明显高于神经完整的一侧髓腔,证明神经破坏会促进急性髓性白血病进展。第二部分 交感神经递质对Th亚群及急性髓性白血病细胞作用的研究研究背景急性髓性白血病（acute myeloid leukemia,AML）是一种生物学和临床表现上的存在高度异质性疾病。尽管支持治疗和预后风险分层的进展已优化了既定疗法,但总体长期生存率仍然很低,所以明确能够影响疾病发生发展的因素是十分必要的。众所周知急性应激反应是人体会对外界刺激作出的积极地反应,而慢性应激通常是有害的,并可能导致严重的健康并发症。应激会触发中枢神经系统特定部位控制下的神经内分泌链反应,其中主要包括肾上腺和交感神经系统分泌儿茶酚胺和糖皮质激素。儿茶酚胺（catecholamines）是最早对压力作出反应的信号分子,也是主要发挥作用的分子。尽管儿茶酚胺（主要是表肾上腺素和去甲肾上腺素）的主要功能是作用于心脏功能,但新近的研究表明这些应激激素也显示出在癌症中的重要作用。肿瘤坏死因子α（TNFα）是巨噬细胞/单核细胞在急性炎症过程中产生的炎症细胞因子,负责细胞内各种信号事件。TNFα结合TNFR触发各种MAPK等细胞内信号途径,参与到调节炎症和肿瘤中。T辅助（Th）亚群是CD4+T细胞在激活后会分化出不同的亚群,是各种免疫应答中重要的组成部分。不管是早期发现的Thl和Th2亚群还是新近的研究热门Th17及Treg亚群都被认为参与到了诸如卵巢癌、黑色素瘤等恶性肿瘤中的发病机制中。Th亚群的免疫失衡在疾病中被认为是导致疾病发生的关键因素。而且,有证据表明,诸如淋巴细胞等的膜表面上会存在多种神经递质的受体,而交感神经递质不仅会抑制免疫系统,还会导致Th1/Th2的细胞平衡向以Th2为主的反应发生转变并诱导了哮喘和过敏性疾病的发生。然而,交感神经递质以何种方式参与AML发生发展还尚不明确。依据前期检测到AML骨髓局部中存在着一定程度的神经损害以及Th亚群的免疫失衡,我们推测,在AML骨髓区域微环境中,交感神经递质会造成Th17、Treg、Th1、Th2等多个Th细胞免疫的失衡,最终促进AML白血病的发生发展。研究目的1.探究骨髓局部的交感神经递质对Th亚群免疫平衡的影响,明确其具体的作用机制。2.探究交感神经递质在不同浓度下对原代及白血病细胞系的影响,明确其如何通过改变Th亚群免疫平衡进而促进白血病发生发展。3、明确交感神经递质肾上腺素及去甲肾上腺素通过β-肾上腺素受体抑制CD4+T向免疫保护亚群Th1及Th17亚群分化,进而造成了骨髓局部的免疫抑制。4、进一步探究神经递质抑制了Th1及Th17亚群杀伤白血病细胞的作用,进而促进白血病的进展。研究方法1.标本收集:本研究收集来自山东大学齐鲁医院初诊AML患者骨髓液;分出骨髓中的单个核细胞并用MACS分选CD4+T细胞,留取骨髓上清。2.交感神经递质可促进原代及AML细胞系的增殖:选取AML细胞系MV4-11和THP-1以及初诊急性髓性白血病患者的原代细胞;应用CCK8检测不同浓度的肾上腺素和去甲肾上腺素在24小时和48小时时间点对其促增殖情况。3.β-肾上腺素受体在不同细胞上的表达情况:应用RT-PCR技术检测不同细胞上β1/β2/β3-肾上腺素受体受体mRNA的表达情况。4.不同浓度的交感神经递质对Th亚群的影响:设置浓度梯度0、10-8M,10-7M、10-6M、10-5M和10-4M的肾上腺素及去甲肾上腺素作用于CD4+T细胞;应用MACS免疫磁珠法分选CD4+T细胞;流式细胞术用于检测Th亚群的比例;ELISA检测培养上清中IFN-γ和IL-17A细胞因子的浓度。5.交感神经递质通过β-肾上腺素受体影响Th亚群的免疫平衡:MACS免疫磁珠法分选小鼠CD4+T细胞;琼脂糖凝胶DNA电泳明确β-肾上腺素受体敲除鼠的基因型;流式细胞术检测小鼠Th亚群的变化;ELISA检测培养后的细胞上清中IFN-γ和IL-17A的浓度。6.神经递质影响CD4+T的分化进而影响其对白血病细胞的杀伤功效:MACS免疫磁珠法分选CD4+T细胞;流式细胞术用于检测Th亚群的比例;CCK8方法用于检测细胞增殖情况。研究结果1.交感神经递质可促进原代及AML细胞系的增殖:分别应用不同浓度梯度等肾上腺素以及去甲肾上腺素,分别作用于初诊AML患者的原代细胞和MV4-11及THP-1两种AML细胞系,在24小时和48小时两个时间点应用CCK8方法检测其增殖情况,随着浓度的增加交感神经递质促进白血病细胞增殖的效果越明显。肾上腺素及去甲肾上腺素均在10-4M浓度时促增殖效果最明显,且肾上腺素促白血病细胞增殖效果优于去甲肾上腺素。2.β-肾上腺素受体在不同细胞上的表达情况:（1）应用RT-PCR技术检测了 HL60、THP-1、U937、Kasumi四种不同的AML细胞系以及CD4+T细胞和Hela细胞系表面β-肾上腺素受体的表达情况。其中β2-肾上腺素受体表达量远高于其他两种亚型,而β3-肾上腺素受体的相对表达量低于其他两种亚型,且AML细胞系及CD4+T细胞均有较高的β-肾上腺素受体。（2）同时检测了小鼠脾脏、骨髓、外周血、分选的CD4+T细胞以及骨骼肌细胞的β-肾上腺素受体受体表达情况。β2-肾上腺素受体表达量在各个组织里仍远高于其他两种亚型,β3-肾上腺素受体表达量也是最低的一种。其中CD4+T细胞上β2-肾上腺素受体的表达量最高,接近骨骼肌中表达量的水平。3.低浓度的交感神经递质对Th亚群的免疫平衡无明显影响:（1）分别加入10-8M-10-5M浓度的肾上腺素以及去甲肾上腺素于CD4+T细胞的培养体系中,3天后应用流式细胞学的方法检测Th1、Th2、Th17以及Treg亚群的比例及其比值关系。研究发现在10-8M-10-5M浓度区间,Th亚群及Th1/Th2、Th17/Treg相比于空白对照组均无统计学差异。（2）取培养后的上清,应用酶联免疫标记法（ELISA）测定分泌IFN-γ和IL-17A细胞因子的量,不同浓度梯度组与对照组之间的差别亦无统计学意义。4.高浓度的交感神经递质可改变Th亚群的免疫平衡:（1）CD4+T细胞的培养中分别添加10-4M浓度的肾上腺素以及去甲肾上腺素,培养3天后应用流式细胞学的方法检测Th1、Th2、Th17以及Treg亚群的百分比及其比值关系。研究发现,肾上腺素及去甲肾上腺素均能明显降低Th1及Th17的比例,并且能升高Treg的比例。（2）应用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测培养后的细胞上清,肾上腺素及去甲肾上腺素培养后上清中IFN-γ及IL-17A细胞因子的浓度明显减低。5.交感神经递质亦改变小鼠Th亚群的免疫平衡:分选小鼠CD4+T细胞后,应用上述方法添加交感神经递质进行培养,流式细胞学的方法检测发现Thl和Th17在对照组中的比例明显降低,Treg的比例明显增高。RT-PCR技术检测IFN-γ和IL-17A的mRNA水平明显低于对照组。6.交感神经递质通过β-肾上腺素受体改变Th亚群的免疫平衡:（1）检测β1/β2-肾上腺素受体敲除鼠的基因型,明确β1及β2-肾上腺素受体敲除成功。（2）分选肾上腺素受体敲除小鼠的CD4+T细胞后,应用上述方法添加交感神经递质进行培养,流式细胞学的方法检测Th1、Th17和Treg的比例,结果发现Th1及Th17亚群未被交感神经递质所抑制。证明交感神经递质肾上腺素及去甲肾上腺素通过β-肾上腺素受体发挥改变Th的作用。7.TNF-α能通过TNFR2促进Treg的比例:TNFR2是TNF-α主要的发挥作用的受体,于是我们应用流式细胞学的方法对初诊的急性髓性白血病患者和对照组中CD4+T细胞及Treg细胞表面的TNFR2表达量进行测定。初诊白血病患者的CD4+T细胞和Treg细胞表面均高表达TNFR2受体。随后,我们在CD4+T细胞的培养体系中加入TNF-α进行培养,在添加了 TNF-α后,Treg的比例明显增加,然而在预先添加TNFR2拮抗剂后再添加TNF-α进行培养则可以降低Treg的比例。8.神经递质影响CD4+T的分化进而影响其对白血病细胞的杀伤功效:CD4+T细胞的培养体系中分别加入10-4M浓度的肾上腺素以及去甲肾上腺素,培养3天后将CD4+T细胞与白血病细胞进行共培养,于24小时和48小时用CCK8方法检测AML细胞增殖情况。肾上腺素及去甲肾上腺素均能通过改变Th亚群平衡进而促进AML的增殖,其中肾上腺素作用更为明显。研究结论1、交感神经递质肾上腺素和去甲肾上腺素均能在24小时和48小时促进原代白血病细胞及白血病细胞系的增殖,且随浓度的增加其促进白血病细胞增殖的效果更加显着。2、交感神经递质可以抑制人和小鼠CD4+T细胞向Th1和Th17方向分化。3、敲除β-肾上腺素受体后,交感神经递质不能改变小鼠Th1及Th17的比例。4、TNF-α能通过TNFR2受体促进Treg的比例。5、交感神经递质通过抑制Th1和Th17的比例进而抑制其对白血病细胞杀伤作用。第三部分NLRP3炎性小体相关基因单核苷酸多态性在急性淋巴细胞白血病中的研究研究背景急性淋巴细胞白血病（Acute lymphoblastic leukemia,ALL）是一种血液恶性肿瘤,由于骨髓和其他组织中的淋巴样干祖细胞的恶性增殖和积累所致。尽管最常见的ALL是儿童急性淋巴细胞白血病（占ALL 80%的病例）,但成人急性淋巴细胞白血病的治愈率仅有20%-40%。在过去的十年中,尽管在改善预后以及开发针对特定亚型的新疗法方面取得了一定进展,但了解疾病的发病机制仍是改变ALL治愈率的关键点。炎性小体是固有免疫中公认的重要角色。其中研究最透彻的是NLRP3炎性小体,NLRP3炎性小体复合物属于核苷酸结合和寡聚化域样受体（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors,NLRs）的家族,也被称为“含pyrin域的蛋白3”。NLRP3炎性小体与许多疾病密切相关,包括多发性硬化症、炎症性肠病以及其他自身免疫性和自身炎性疾病。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）是一种 DNA 序列的多态性,是由于单个核苷酸在基因组水平上的变异而引起的。SNP在至少1%的人群中有差异,占正常人类遗传变异的大部分。虽然大多数SNP没有明显的表型作用,然而仍有很多的SNP被认为可能促进疾病发生发展以及影响药物治疗的功效。NLRP3相关分子的SNP在许多肿瘤和慢性病的发病及疾病进展过程中都有很大的作用。例如,已有文献表明CARD8（rs2043211）与心血管疾病的发生有关,NF-κB-94ins/del ATTG多态性则与胃癌、肝细胞癌和肺癌等癌症的发生密切相关,NLRP3效应分子之一IL-18的单核苷酸多态性rs1946518已显示与牙周炎和肝细胞癌的发病有关,而IL-1β rs16944被认为可能导致宫颈癌和胃炎。因此,NLRP3炎性体相关基因的多态性与恶性肿瘤的发生关系密切。NLRP3己广泛涉及各种血液疾病的发生和发展。然而,NLRP3炎性小体如何促进ALL的发生发展仍然未知。因此,我们探究了 ALL患者的骨髓中NLRP3炎性小体的单核苷酸多态性及其相关基因的表达情况,以期明确其在ALL发生发展中的作用。研究目的探索NLRP3炎性小体组成成分的单核苷酸多态性与ALL易感性的关系;分析不同模式下NLRP3炎性小体组成成分的单核苷酸多态性与临床特征之间的关系;为明确NLRP3单核苷酸多态性具体作用机制,探索其对NLRP3各组分表达水平及下游因子表达和细胞因子分泌的影响。研究方法1、PCR 检测 ALL 病人及健康对照组中的 CARD8（rs2043211）、IL-1β（rs16944）、IL-18（rs1946518）和 NF-κB-94ins/del ATTG 基因的单核苷酸多态性。2、用行×列卡方检验和单因素Logistic回归分析的方法分析白血病患者组和正常对照组 CARD8（rs2043211）、IL-1β（rs16944）、IL-18（rs1946518）和 NF-κB-94ins/del ATTG基因多态性与ALL易感性之间的关联。3、用行×列卡方检验和单因素Logistic回归分析的方法分析白血病患者组中CARD8（rs2043211）、IL-1β（rs16944）、IL-18（rs1946518）和 NF-κB-94ins/del ATTG基因多态性与预后有关的临床特征的关联。4、RT-PCR测定ALL患者IL-1β、IL-18 mRNA的相对表达,并分析其与患者NLRP3炎性小体相关基因SNPs之间的关系。5、ELISA测定ALL患者血清中IL-1β、IL-18的含量,并分析其与NLRP3炎性小体相关基因SNPs的关系。研究结果1、NF-κB-94ins/del ATTG 和 CARD8（rs2043211）的基因多态性与 ALL 的易感性相关:检测ALL患者组和对照组NLRP3相关成分的单核苷酸多态性,我们发现CARD8（rs2043211）在显性模式下的AT/TT基因型和共显性模型下的TT基因型与ALL易感性明显相关。此外,NF-κB-94ins/del ATTG中D等位基因的频率和显性模式下的DD基因型均与ALL易感性显着相关。我们采用单因素逻辑回归分析法分析NF-κB和CARD8,研究发现NF-κB单核苷酸的多态性表现为保护作用,而CARD8（rs2043211）的AT/TT基因型却极大的增加了 ALL的易感性。2、表达NF-KB-94ins/del ATTG DD基因型的ALL患者有较低的WBC计数,CARD8（rs2043211）AT/TT基因型与T细胞免疫表型相关:根据《NCCN急性淋巴细胞白血病指南》,一些临床检查指标可以给临床提供预后信息。我们的研究分析了这些预后指标与NLRP3炎性小体相关基因的四个SNP之间的关联,旨在弄清NLRP3遗传多态性与ALL预后之间的相关性。依据指南,WBC计数超过30×109/L被认为是不良的预后指标,而我们研究发现表达NF-κB-94ins/del ATTG的DD基因型的ALL患者有更低的WBC计数。ALL的免疫表型主要分为T细胞免疫表型和B细胞免疫表型,T细胞免疫表型也是一个预后不良因素,而CARD8（rs2043211）的AT/TT基因型与T细胞免疫表型相关性更强。因此,我们认为NF-κB-94ins/del ATTG的DD基因型显示为保护因素,而CARD8（rs2043211）的AT/TT基因型与预后不良相关。3、NF-κB-94ins/del ATTG,IL-18（rs1946518）和 IL-1β（rs16944）与 ALL 患者的临床特征相关性分析:对于NF-κB-94ins/del ATTG在隐性模式下的WW/WD基因型相比,DD基因型与较低的血红蛋白含量相关。共显性模型中的DD基因型及D等位基因发生脾肿大概率更高。IL-18（rs1946518）在隐性模式下TT基因型与脾肿大和血清中的高AST浓度具有统计学相关性。另外,在共显性模型中的TT基因型和T等位基因与较高水平空腹血糖有关。而IL-1β（rs16944）中的多态性与肌酐浓度有关。在隐性模式中,TT基因型比GG/GT基因型和高肌酐浓度更为相关。关于等位基因的频率方面,G等位基因也与高肌酐浓度显着相关。4、NLRP3炎性小体单核苷酸多态性与其相关基因表达的关系:关于CARD8（rs2043211）的AT基因型会表达较高NLRP3和ASC。TT基因型比AA和AT基因型会有更高的caspase-1 mRNA表达量。关于IL-1β（rs16944）多态性,相较于GG和TT基因型,GT基因型与IL-18表达量密切相关。并且相较于TT基因型,GT基因型会有更高的ASC表达量并分泌更多的IL-1β。与GG基因型相比,IL-18（rs1946518）多态性的TT基因型也与IL-1β和IL-18浓度相关。然而,IL-18多态性的GT基因型与NLRP3和ASC的较高水平有关。研究结论1、NF-κB-94ins/del ATTG 和 CARD8（rs2043211）的基因多态性与 ALL 的易感性相关。2、表达NF-κB-94ins/del ATTG的DD基因型的ALL患者有较低的WBC计数,CARD8（rs2043211）的AT/TT基因型与T细胞免疫表型相关。3、NF-κB-94ins/del ATTG与较低的血红蛋白含量以及脾肿大相关;表达IL-18（rs 1946518）基因型的ALL患者更易出现脾肿大及高的AST浓度和高的空腹血糖;而IL-1β（rs16944）基因型的ALL患者更易出现高肌酐浓度。4、CARD8（rs2043211）的 AT 和 TT 基因型、IL-1β（rs16944）的 GT 和 TT 基因型和IL-18（rs1946518）的TT基因型与NLRP3相关基因的mRNA高表达和分泌的细胞因子有关。

霍佳莉^[10]（2020）在《一、骨髄间充质干细胞在获得性再生障碍性贫血免疫异常机制中的作用 二、瘦素诱导的获得性再生障碍性贫血免疫异常机制研究》文中研究指明背景:尽管获得性再生障碍性贫血（aplastic anemia,AA）的发病机制尚未完全阐明,但是异常免疫介导的造血干/祖细胞损伤（hematopoietic stem/progenitor cells,HSPCs）作为AA最主要的发病机制已获公认。高达70%的AA患者经强化免疫抑制治疗（intensive immunosuppressive therapy,IST）可获血液学缓解为此提供力证。然而,导致免疫异常以及促进免疫活化的具体机制尚不清楚。骨髓微环境在AA免疫异常中的作用有待研究。间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）作为骨髓微环境主要基质细胞之一,在AA发病机制中的作用尚未明确。明确骨髓来源的间充质干细胞（BM-MSC）在AA免疫异常机制中的具体作用,有助于深入了解AA的发生发展,并有望为AA的治疗提供新思路。目的:本研究旨在探讨AA患者及正常供者（healthy donor,HD）BM-MSC在细胞水平上的功能差异及分子水平上基因的差异性表达,阐明骨髓微环境改变的具体机制及其在AA免疫异常中的作用。方法:收集AA和HD外周血标本,分离单个核细胞,检测两者外周血淋巴细胞亚群比例,以及外周血血浆中干扰素γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）、白介素-17A（IL-17A）和白介素-10（IL-10）的浓度。同时,收集AA和HD骨髓标本,分离单个核,贴壁培养BM-MSC,检测两组MSC的形态、免疫表型、迁移、增殖、凋亡、周期、衰老、成脂、成骨、成软骨的能力,并评估其免疫抑制功能。对3例AA患者和3例HD来源BM-MSC进行转录组测序（RNA-seq）,分析两者差异性表达的基因、信号通路及生物学功能。结果:同HD相比,AA患者外周血CD8+T细胞比例明显升高（29.02%vs 19.68%,P<0.001）,CD4+T 细胞与 CD8+T 细胞比例显着降低（1.43 vs 2.54,P<0.001）。此外,AA患者外周血淋巴细胞亚群Thl（CD4+IFNγ+IL-4-T）细胞与Tcl（CD8+IFNγ+IL-4-T）细胞比例均明显升高（13.71%vs 10.76%和 25.82%vs 18.43%,P值分别为<0.001和0.009）。ELISA显示,AA患者外周血血浆中IFN-γ、TNF-α、IL-6及IL-8的比例明显高于HD,而IL-10的比例显着降低。分离HD及AA患者BM-MSC,发现两者MSC的免疫表型及染色体核型无异,然而形态差异明显。此外,AA患者BM-MSC增殖及迁移能力明显降低,而凋亡及衰老显着增加。MSC同T淋巴细胞共培养显示,AA-MSC抑制T淋巴细胞增殖、活化及分泌细胞因子（IFN-γ）的能力均显着低于HD-MSC。RNA-seq显示:①同HD相比,AA患者BM-MSC基因表达谱具有明显差异,差异性表达的基因有292个（Fold Change>2或<-2,P<0.05）,其中在AA-MSC中上调的基因有163个（PRSS1、PNLIPRP3、IL-34、CCL3、ZNF521等）,下调的基因有 129 个（GPRC5A、HHIP、CLIC3、DHRS9、DIRAS3）;②GO富集分析显示差异表达的基因主要富集于脂质代谢、免疫系统进程、细胞周期、细胞分化、脂肪酸代谢、凋亡、Wnt信号通路、自噬、细胞迁移等生物学功能;③KEGG显示差异表达的基因相关的信号通路为代谢通路、MAPK通路、Hippo通路、细胞周期、自噬、Wnt通路、mTOR以及PI3k/Akt通路等。结论:AA患者BM-MSC具有显着的功能缺陷,导致其免疫抑制功能减弱,在促进AA患者免疫激活中可能发挥一定的作用。背景:获得性再生障碍性贫血（aplastic anemia,AA）属于骨髓衰竭性疾病,主要由异常免疫介导。AA患者骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）免疫调节缺陷可能为导致免疫异常的机制之一。此外,AA-MSC成脂能力明显增强,导致AA患者骨髓脂肪化。然而,关于骨髓微环境中脂肪细胞因子尤其是瘦素,在AA发病机制中的作用尚未见报道。目的:探讨AA患者、骨髓增生异常综合征（myelodysplasia syndrome,MDS）患者和正常供者（healthy donor,HD）骨髓中瘦素浓度差异,并探究瘦素对AA患者和HD骨髓T淋巴细胞功能的影响以及引起这些功能改变的具体分子机制,以期找到可能的治疗靶点。方法:收集AA、MDS和HD骨髓标本,检测骨髓上清中瘦素的浓度,同时检测AA患者骨髓中调节性T细胞的比例（CD4+CD25briCD127dim,Treg）,分析瘦素浓度与Treg的相关性。检测AA和HD骨髓单个核细胞瘦素受体（leptin receptor,Lepr）mRNA的表达水平,并应用流式分析AA和HD患者骨髓来源T淋巴细胞亚群上Lepr的表达水平差异。在体外,评估瘦素对AA和HD骨髓T淋巴细胞增殖、活化及分泌细胞因子IFN-γ的影响。检测瘦素对CD4+CD25-T细胞向CD4+Foxp3+T细胞分化的影响。结果:AA患者骨髓上清中瘦素浓度显着高于HD和MDS（13.07±2.09 ng/ml vs 3.90±0.71 ng/ml vs 4.47±0.98 ng/ml;P=0.001 和P=0.03）,且与 AA 骨髓中Treg细胞比例呈明显负相关（R=-0.70,P=0.005）。AA-MSC的成脂能力明显高于HD-MSC。在成脂第7天和第14天,AA-MSC中瘦素mRNA的表达均显着高于 HD-MSC（1272.00 vs 633.00,P=0.02;3588.00 vs 709.50,P=0.002）。而且,成脂过程中,AA-MSC的细胞培养上清中瘦素的浓度持续高于HD-MSC（12.15 pg/mlvs 8.44 pg/ml,P=0.003;17.96 pg/ml vs 10.91 pg/ml,P<0.001）。此外,AA患者骨髓单个核细胞Lepr mRNA表达水平显着高于HD（12.21±2.30 vs 1.42±0.52,P=0.003）。流式分析显示,AA患者骨髓来源CD8+T细胞、CD4+CD25-T细胞和CD4+CD25+T细胞Lepr的平均荧光强度均明显高于HD（54.22±4.65 vs 40.45±3.23,P=0.02;117.40±9.83 vs 65.79±6.62,P<0.001;209.20±23.36 vs 142.10±14.61,P=0.02）。在体外,瘦素可显着促进 AA患者骨髓来源CD4+和CD8+T细胞的增殖（P=0.007和P=0.04）,而对HD骨髓来源T细胞增殖无明显影响（P=0.52和P=0.26）。此外,瘦素显着促进AA患者骨髓来源CD4+和CD8+T细胞表面CD25和CD69的表达,而仅促进HD骨髓来源CD4+和CD8+T细胞表面CD25的表达。瘦素亦促进AA患者和HD骨髓来源CD4+和CD8+T细胞分泌IFN-γ,而对IL-4的分泌无影响。而且,瘦素明显抑制AA和HD骨髓来源CD4+CD25-T细胞向CD4+Fxop3+T细胞分化。结论:AA患者MSC成脂增强,导致骨髓脂肪化,产生高水平的瘦素,激活AA患者T淋巴细胞而抑制Treg细胞的生成,在导致AA患者免疫异常中具有一定的意义。

二、血液疾病时骨髓单个核细胞内Leptin mRNA表达的研究（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、血液疾病时骨髓单个核细胞内Leptin mRNA表达的研究（论文提纲范文）

（1）自噬异常在免疫性血小板减少症发病机制中的作用探讨（论文提纲范文）

（2）调节性B细胞与IL-9/IL-9R在再生障碍性贫血患者中的变化及临床意义（论文提纲范文）

（3）树突状细胞NLRP3炎症小体及免疫失衡在急性髓系白血病作用和机制研究（论文提纲范文）

（4）初步探讨PDGF家族及其受体基因在急性白血病患者骨髓单个核细胞中的mRNA表达水平及其临床意义（论文提纲范文）

（5）miR-204靶向调控HGF/c-MET通路在急性髓系白血病中的作用和机制的研究（论文提纲范文）

（6）PD-L1对急性髓系白血病糖酵解的影响及机制研究（论文提纲范文）

（7）FTL在免疫相关性血细胞减少症发病机制中作用的研究（论文提纲范文）

（8）长寿命浆细胞、NLRP3炎症复合体及IL-36在ITP发病中的作用和机制研究（论文提纲范文）

（9）骨髓交感神经及免疫失衡在急性白血病发生发展中的作用研究（论文提纲范文）

（10）一、骨髄间充质干细胞在获得性再生障碍性贫血免疫异常机制中的作用 二、瘦素诱导的获得性再生障碍性贫血免疫异常机制研究（论文提纲范文）

四、血液疾病时骨髓单个核细胞内Leptin mRNA表达的研究（论文参考文献）

• [1]自噬异常在免疫性血小板减少症发病机制中的作用探讨[D]. 孙睿婕. 山东大学, 2021(12)
• [2]调节性B细胞与IL-9/IL-9R在再生障碍性贫血患者中的变化及临床意义[D]. 谷梨花. 山东大学, 2021(11)
• [3]树突状细胞NLRP3炎症小体及免疫失衡在急性髓系白血病作用和机制研究[D]. 刘芹芹. 山东大学, 2020(04)
• [4]初步探讨PDGF家族及其受体基因在急性白血病患者骨髓单个核细胞中的mRNA表达水平及其临床意义[D]. 杨露露. 苏州大学, 2020(02)
• [5]miR-204靶向调控HGF/c-MET通路在急性髓系白血病中的作用和机制的研究[D]. 聂鼎睿. 郑州大学, 2020(02)
• [6]PD-L1对急性髓系白血病糖酵解的影响及机制研究[D]. 马平. 郑州大学, 2020(02)
• [7]FTL在免疫相关性血细胞减少症发病机制中作用的研究[D]. 张洋. 天津医科大学, 2020(06)
• [8]长寿命浆细胞、NLRP3炎症复合体及IL-36在ITP发病中的作用和机制研究[D]. 王爽. 山东大学, 2020(09)
• [9]骨髓交感神经及免疫失衡在急性白血病发生发展中的作用研究[D]. 张琛. 山东大学, 2020(08)
• [10]一、骨髄间充质干细胞在获得性再生障碍性贫血免疫异常机制中的作用 二、瘦素诱导的获得性再生障碍性贫血免疫异常机制研究[D]. 霍佳莉. 北京协和医学院, 2020(05)

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